甲壳素是由N-乙酰-2-氨基-脱氧-D-葡萄糖以β(1-4)糖苷键形式链接的共聚物，它来源丰富，可从螃蟹、虾的外壳及真菌和藻类的细胞壁中获得，是生物界除纤维素外最丰富的天然多糖。甲壳素的溶解性差，不易被利用，在碱性条件下，通过N-脱乙酰作用可得到溶解性较好的壳聚糖来提高其利用价值(Kafetzopoulos et al, 1993)。壳聚糖分子是由N-乙酰-D-葡糖胺和D-葡糖胺共聚而成的阳离子型多糖(Hejazi et al, 2003)，化学性质稳定，具有良好的生物相容性和生物降解性，对人体安全无毒。在禽类、猪体内可以调节脂肪代谢，提高机体的营养物质转化能力和代谢水平，改善动物品质。作为水产饲料添加剂，壳聚糖对异育银鲫(Carassiusauratus gibelio)、花鲈(Lateolabrax japonicus)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)、罗非鱼(Tilapia nilotica)等有促生长和增强免疫力的作用(曹丹等, 2004; 常青等, 2006; 张艺等, 2012; 刘兴国等, 2004)。壳聚糖的化学、物理和生物学特性是由它的脱乙酰度和分子量决定的，不同分子量的壳聚糖其抗菌活性、抗氧化能力、细胞吸收能力和改变细胞膜通透性等功能也有所不同(Seyfarth et al, 2008; Xing et al, 2005; Su et al, 2005; 余雄伟等, 2011)。

刺参(Apostichopus japonicus Selenka)俗称海参，属棘皮动物门、海参纲，富含多种营养物质，具有较高的食用和药用价值。在中国、俄罗斯、日本和韩国都是重要的经济类养殖物种，有很大的市场需求量。然而，随着养殖量的增加，由于养殖操作的不规范，由病原菌(如灿烂弧菌、假交替单孢菌) (张春云等, 2006)引起的传染病成为海参养殖的严峻问题，导致了重大的经济损失。使用抗生素类药物和化学法杀菌将导致病菌的耐药性、环境污染和水产品中的药物残留等问题。棘皮动物缺乏特异性免疫系统，海参防御外来物质的机制只有细胞免疫和体液免疫(Eliseikina et al, 2002)。使用免疫增强剂是增强水产动物免疫力和抗病力的有效方法(安红红等, 2013)，因此，研究合适的免疫增强剂对提高海参非特异性免疫能力意义重大。

本研究以仿刺参为实验对象，探讨不同分子量壳聚糖对刺参生长性能和免疫力的影响，以期对壳聚糖作为免疫增强剂的应用提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 实验饲料

低分子壳聚糖(Low molecular weight chitosan, LMWC)，分子量为35 kDa，由山东青岛弘海生物技术有限公司提供。

高分子壳聚糖(High molecular weight chitosan, HMWC)，分子量为400 kDa，由山东青岛海汇生物工程有限公司提供。

海参饲料以马尾藻粉为主料，并添加鱼粉、小麦粉、豆粕等基础原料，制得粗蛋白含量为19.46%，粗脂肪含量为2.26%的基础饲料(表 1)。在基础饲料中分别设计添加质量分数为1%的LMWC和HMWC (赵彦翠, 2011¹); 韩丽蓉等, 2014)替代面粉，制成实验饲料。所有原料粉碎后均过100目筛，充分混合均匀，加适量水揉成团状后，用双螺杆制料机(F-II26型，华南理工大学，广州)制成粒径均匀、长度一致的颗粒饲料，经40℃烘12 h，密封保存备用。

1) 赵彦翠.刺参(Apostichopus japonicus Selenka)多糖类免疫增强剂及微生态制剂的研究与应用.中国海洋大学博士研究生学位论文, 2011, 41-48

1.2 海参的饲养与管理

实验所用海参苗购于山东青岛即墨市田横镇海参育苗厂，均为同一批次培育的参苗。挑选大小均匀、初始体重为(6.77±0.01) g的海参，将参苗置于室内具有循环水系统的大桶内进行暂养，为期14 d。养殖实验在山东青岛国家海洋科学研究中心中国海洋大学科研基地进行。暂养期间每天09:00定时清理粪便和残饵并换水，并在13:00饱食投喂基础饲料。

暂养结束后，挑选个体大小均匀的海参幼苗随机分组，置于体积为40 L的玻璃缸中，每缸16只。实验共设置3个处理，每个处理3个重复。饲养期间每天09:00清理粪便和残饵，13:00饱食投喂1次，为期56 d。实验期间保持水温为(15±1)℃，盐度为30.0±1.0，pH为8.0±0.3。24 h连续充氧，保证暗室饲养。

56 d的养殖实验结束后，饥饿海参24 h，对每个玻璃缸内的海参计数、称重。从每个重复里随机取4只海参，进行解剖，混合体腔液用于测定总蛋白含量、酸性磷酸酶(ACP)活力、一氧化氮合酶(NOS)活力、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力和碱性磷酸酶(AKP)活力。

1.3 样品分析及计算方法 1.3.1 特定生长率测定

海参特定生长率(SGR)计算公式：

SGR(%/d)=(ln终末体重-ln初始体重) × 100%/饲养天数

1.3.2 刺参体腔细胞破碎上清液

首先将体腔细胞液进行超声破碎。条件为：22 kHz, 超声时间6 s，间歇6 s，重复25次，0℃。细胞破碎后于4000xg离心10 min(4℃)，所得上清液即为体腔细胞破碎上清液。测定该上清液中总蛋白含量、ACP活力、NOS活力、T-SOD活力和AKP活力。

1.3.3 体腔细胞破碎上清液总蛋白含量的测定方法

测定原理是考马斯亮蓝染料上的阴离子与蛋白质分子的NH₄⁺结合，生成蓝色物质，通过测定吸光度可计算出蛋白含量。测定波长为595 nm。

1.3.4 体腔细胞破碎上清液ACP活力

测定原理是ACP可分解磷酸苯二钠，产生游离酚和磷酸。游离酚在碱性条件可与4-氨基安替吡啉作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌衍生物，可测定其吸光值。该活力选用南京建成试剂盒进行测定，测定波长为520 nm。体腔细胞破碎液中1个ACP活力单位定义为：每克组织蛋白在37℃与基质作用30 min产生1 mg酚为1个活力单位(U)。

1.3.5 体腔细胞破碎上清液NOS活力

原理是根据NOS可以催化L-精氨酸反应生成NO。NO可以被氧化成NO₂^-和NO₃^-，NO₂^-可用Griess试剂[对氨基苯磺酰胺，磷酸，N-(1-萘基)-乙二胺]进行检测。选用南京建成试剂盒进行测定，测定波长为530 nm。体腔细胞破碎液中1个NOS活力单位定义为：每毫克组织蛋白每分钟生成1 nmol NO为1个酶活力单位。

1.3.6 体腔细胞破碎上清液T-SOD活力

基本原理是：通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基(O₂^-)，O₂^-可氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见分光光度计测其吸光值。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光值低于对照管的吸光值，通过公式可计算出SOD活力。该活力选用南京建成试剂盒进行测定，测定波长为550 nm。体腔细胞破碎液中1个T-SOD酶活力单位定义为：每毫克组织蛋白在1 ml反应液中SOD抑制率达到50%时所对应的SOD量为1个SOD活力单位(U)。

1.3.7 体腔细胞破碎上清液AKP活力

该测定原理同1.3.4。选用南京建成试剂公司的试剂盒按照要求进行测定。体腔细胞破碎液中1个AKP活力单位定义为：每克组织蛋白在37℃与基质作用15 min产生1 mg酚为1个活力单位(U)。

1.3.8 实验数据分析

实验数据均以3个重复的平均值±标准误(Mean±SE)表示，使用SPSS 20.0软件单因素方差分析法(ANOVA)进行分析，若差异显著(P < 0.05)，采用Tukey检验进行多重比较。

2 结果 2.1 不同分子量壳聚糖对刺参生长的影响

各实验组海参的初始体重、终末体重和特定生长率见表 2。经过56 d的养殖实验，添加1%的LMWC和1%的HMWC组均对刺参的生长有促进作用，SGR均高于对照组，其中，LMWC组刺参的最终体重和SGR均显著高于对照组(P < 0.05)。HMWC组刺参的SGR比对照组略高，但与对照组没有显著性差异(P > 0.05)。

2.2 不同分子量壳聚糖对刺参免疫酶活性的影响 2.2.1 ACP活力

结果显示，在基础饲料中添加1%的LMWC可以显著提高刺参的ACP活力(P < 0.05)，HMWC对刺参ACP活力影响不大(表 3)。

2.2.2 NOS活力

结果显示，刺参体腔细胞NOS活力受HMWC影响较为显著(P < 0.05)，而受LMWC影响较小(表 3)。

2.2.3 T-SOD活力

研究表明，不同分子量的壳聚糖均能显著提高刺参体腔细胞T-SOD活性(P < 0.05)，且随着壳聚糖分子量的增大，该酶活性有增大趋势(表 3)。

2.2.4 AKP活力

结果显示，在基础饲料中添加1%不同分子量壳聚糖，对刺参体腔细胞AKP活力有不同程度的提高，其中，HMWC对AKP活力提高显著(P < 0.05)(表 3)。

3 分析与讨论 3.1 饲料中添加不同分子量壳聚糖对刺参生长的影响

壳聚糖作为饲料添加剂应用在畜禽和水产动物养殖中，可以促进生长、增强机体代谢能力。曹丹等(2004)对异育银鲫研究发现，添加1.0%壳聚糖组的增重率极显著高于对照组(p < 0.01)。Niu等(2013)在基础饲料中分别添加了甲壳素、壳聚糖、壳寡糖和N-乙酰-D-葡萄糖胺饲养斑节对虾(Penaeus monodon) 70 d，研究表明，壳聚糖组的增重和生物量增加均显著高于对照组和其他饲养组(p < 0.05)。在基础饲料中添加不同含量的壳聚糖后，虹鳟(Oncorhynchus mykiss)幼鱼的增重率(WGR)、特定生长率(SGR)显著高于对照组(p < 0.05)，同样对星斑川鲽(Platichthysstellatus)幼鱼的生长也有促进作用，但是，当壳聚糖添加量高于0.50%后，WGR和SGR趋于平稳，说明壳聚糖促进机体生长的作用与其添加量有关(蒋锦坤, 2012)¹)。壳聚糖对机体的影响与分子量有关，分子量是影响壳聚糖透过Caco-2细胞膜的重要因素，随分子量的增加，其透过量和透过率均显著降低(Su et al, 2005)。余雄伟等(2011)比较了不同分子量壳聚糖在改变E.coil和S.aureus细胞膜通透性方面的影响，研究表明，改变细胞膜通透性能力大小的分子量依次是3 kDa > 300-400 kDa > 700 kDa。壳聚糖具有黏膜粘附作用，并可以暂时打开紧密的上皮细胞，帮助其他物质转运(Ranaldi et al, 2002)，因此，不同分子量的壳聚糖其转运效果也有所不同。王红卫(2013)²)研究了不同分子量壳寡糖对鸡产蛋性能、蛋品质、血清生化指标、肠道微生物菌群的影响，研究表明，壳寡糖分子量为1-3 kDa时为蛋鸡饲料添加剂的最适宜分子量。

1) 蒋锦坤.壳聚糖对虹鳟(Oncorhynchus mykiss)和星斑川鲽(Platichthys stellatus)幼鱼生长及非特异性免疫的影响.上海海洋大学硕士研究生学位论文, 2012, 10-25

2) 王红卫.不同分子量壳寡糖对蛋鸡生产性能及免疫功能的影响.山东农业大学硕士研究生学位论文, 2013, 27-29

壳聚糖有助于机体对营养物质的消化和吸收(Gopalakannan et al, 2006)，可以促进机体代谢，因此能够促进生物生长(Niu et al, 2013)。本研究在刺参基础饲料中分别设计添加了1%的LMWC(35 kDa)和1%的HMWC(400 kDa)，结果发现，LMWC和HMWC均能够对刺参的生长起到促进作用，其中LMWC作用更显著。

3.2 饲料中添加不同分子量壳聚糖对刺参免疫酶活性的影响

刺参的免疫是指机体识别外来和自身抗原、对体内的外来物质进行排斥、对自身抗原形成免疫耐受性使自身免受伤害和伤口愈合等生理过程(王吉桥等, 2002)。海参缺乏特异性免疫系统，只有体壁和体内防御机制共同组成的非特异性免疫体系。体内防御主要是体液免疫和细胞免疫(Eliseikina et al, 2002)。海参体腔中充满了体腔液，体腔细胞就悬浮其中。体液免疫和细胞免疫是紧密联系的，体腔细胞能够分泌酚氧化酶原激活系统、凝集素、溶菌酶以及ACP、SOD和AKP等免疫因子到体腔液中形成免疫防线，同时，细胞之间也通过信息传递，可以迅速启动和扩大免疫应答。它们相互协同，共同完成海参免疫防御反应(王兰等, 2009; 孙永欣等, 2007; 王淑娴等, 2012)。

大量研究表明，壳聚糖作为饲料添加剂应用在养殖业中，能够增强动物的免疫能力，包括无脊椎动物的非特异性免疫能力。王兰等(2009)研究发现，添加适量LMWC可以提高长江华溪蟹(Sinopotamon yangtsekiense)LSZ、SOD、AKP和ACP等酶的活性。在鲤鱼饲料中添加不同浓度的LMWC，其中含量为1.0%组能显著提高鲤鱼肝脏和血清中的SOD、ACP和AKP酶活力，但壳聚糖对SOD酶活力的增强作用具有时间效应(任国锐, 2012)¹)。

1) 任国锐.低分子量壳聚糖对鲤鱼生长代谢和免疫的研究.山西大学硕士研究生学位论文, 2012, 36-41

关于多糖类物质对免疫的促进作用，有研究指出与其分子量有关，多糖的分子质量越大，体积就越大，就越不利于其跨越多重细胞膜进入胞内发挥生物学活性。而分子量大的壳聚糖表面带有大量的-NH₄⁺等阳离子基团，这些阳离子基团是壳聚糖抑菌抗菌的结构基础，并且高分子结构使得壳聚糖对带负电荷的大分子物质具有较强的絮凝作用，也有较强的静电吸附和离子交换作用(张严伟, 2012)²)。Je等(2004)测定了9种不同分子量的壳聚糖对DPPH、-OH、超氧化物和自由基分子的清除能力，结果显示，中等分子量的壳聚糖的清除能力最强。Shin等(1999)研究表明，分子量为40 kDa的壳聚糖在0.5%浓度时可抑制90%的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长，而当壳聚糖分子量增大到180 kDa时，0.05%浓度即可完全抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长。本研究中在海参基础饲料中添加了不同分子量的壳聚糖，发现均对刺参的生长和免疫能力有促进作用，而HMWC的SOD酶活力比LMWC更高，说明其清除超氧化物能力更强，与Je等(2004)的测定结果稍有不同，可能是体内外环境因素造成的差异。

2) 张严伟.低聚壳聚糖对福瑞鲤生长、免疫及抗氧化功能的影响.南京农业大学硕士研究生学位论文, 2012, 6-9

壳聚糖可以提高机体的SOD活性而增强抗氧化能力(Nordberg et al, 2001)，从而解除过氧化氢和氧化应激对机体的毒害(Cho et al, 2010)，保护生物抵抗细菌的侵袭和保护脂质的过氧化作用。ACP的免疫机制是在碱性条件下水解破坏表面带有磷酸基团的外来物质(Wang et al, 2014)。本研究表明，多糖类物质可以提高海参ACP酶活力，与Zhao等(2010)的报道结论相同，饲料中添加一定量酵母多糖提高了刺参肠道

ACP酶的活力。AKP可以通过提供磷酸基团来参与机体的磷代谢、蛋白质、脂质和DNA、RNA代谢，调节膜运输，对机体的免疫反应有重要影响(陈清西等, 1998; 绳秀珍等, 2001)。NOS可催化L-精氨酸转化成瓜氨酸和NO，NO能够刺激巨噬细胞对抗肿瘤细胞、病原菌和分枝杆菌等多种靶细胞，因而，NOS在特异性免疫和非特性免疫防御中都有重要作用(Buentello et al, 1999)。Wang等(2014)进行的海参体腔细胞体外实验表明，小分子量(＜1 kDa)的褐藻寡糖显著提升NOS活力，而大分子量(2-4 kDa)的不显著，说明褐藻寡糖的分子量对NOS影响较大。本研究中，LMWC对刺参的SOD和ACP活力水平均有显著提高，并且也相应增强了AKP活力，说明LMWC对刺参免疫能力有一定的促进作用。HMWC组与对照相比，AKP和NOS活力显著增强，SOD活性显著高于其他两个处理组。

4 结论

本实验研究了不同分子量壳聚糖对刺参生长性能和免疫相关酶活力的影响，通过添加不同分子量壳聚糖，刺参的生长均得到了促进，且LMWC的促生长作用显著。高低分子量的壳聚糖表现出对海参不同的免疫增强作用，HMWC组的SOD、AKP和NOS活性显著高于对照组(P < 0.05)，LMWC组的SOD和ACP活性显著高于对照组(P < 0.05)，并且发现，随着壳聚糖分子量的增加，刺参SOD活性也随之增加，具体关系有待进一步研究。