2. 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 无锡 214081
2. Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi 214081
细胞凋亡的概念是病理学家Kerr于1972年正式提出的，凋亡途径可分为Caspase依赖性凋亡和Caspase非依赖性凋亡，而前者是凋亡的主要形式，又可分为死亡受体介导的外源性细胞凋亡和线粒体介导的内源性细胞凋亡(Kerr et al, 1972)。Caspase (Cysteinylaspartate specific proteinase)在1996正式命名(Nicholson et al, 1997)，是一类具有天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶，几乎参与所有凋亡通路的级联反应，是细胞凋亡的核心(Thornberry et al, 1998)。Caspase家族都有相似的催化部位，在其C端有一个高度保守的含有活性位点Cys残基的QACXG(X为R、Q或G)五肽序列和一个含有His残基的SHG motif。
已鉴定并确定其功能的有11种Caspase，其中Caspase 1、4、11负责白介素前体活化，不直接参与凋亡信号传递；Caspase 2、8、9、10、11主要是凋亡的起始者(Apoptoic initiator)；Caspase 3、6、7主要是凋亡的执行者(Apoptoic executioner)。Caspase 9是线粒体介导凋亡途径的关键蛋白酶，处于Caspase“瀑布式”级联反应的顶端，是细胞凋亡的启动子。在机体受到外界因子诱导后，Caspase 9酶原发生切割加工，同时线粒体释放细胞色素C与凋亡因子1(Apoptosis protease-activating factor-1, Apaf-1)形成多聚体，Caspase 9需要与其结合形成凋亡体(Apoptosome)共同作用才能产生较高的催化活性(Mannick et al, 1999)，活化后Caspase 9可以直接活化Caspase 3，间接活化Caspase 2、6、8、10，进而引发级联反应，诱导细胞凋亡。
目前，Caspase细胞凋亡已经成为生命科学领域研究的热点之一，水生动物细胞凋亡的研究也逐渐增多。张金洲(2008)1)获得了大黄鱼(Larimichthys crocea)中Caspase 3和Caspase 9等基因，并得出了Caspase 9参与了细菌感染过程的免疫反应的结论；贾旭颖等(2014)贾旭颖等(2014)研究了温度和氨氮胁迫下凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) Caspase 3的表达规律变化；王芸(2011)2)对pH和氨氮胁迫下中国对虾(Fenneropenaeus chinensis) Caspase的应激机理进行了研究；徐胜威等(2011)克隆到了唐鱼(Tanichthys albonubes)的Caspase 9基因，并研究了唐鱼在氯氰菊酯胁迫下Caspase 9的表达情况；黄吉芹(2013)3)克隆了草鱼(Ctenopharyngodon idella) Caspase 3、Caspase 9等凋亡相关基因；李华涛(2013)4)探索了鲤鱼(Cyprinus carpio)细胞凋亡过程中Caspase的活性变化等。但是，关于团头鲂(Megahbrama amblycephala) Caspase 9基因的研究还未见报道。
1) 张金洲.内源性凋亡途径在大黄鱼抗细菌感染中的作用及两个新的CC型趋化因子的功能研究.厦门大学博士研究生学位论文, 2008
2) 王芸. pH、氨氮胁迫对中国对虾细胞凋亡和抗氧化系统影响机理的研究.上海海洋大学博士研究生学位论文, 2011
3) 黄吉芹. DHA对草鱼前体脂肪细胞及线粒体发育影响的初步研究.西北农林科技大学硕士研究生学位论文, 2013
4) 李华涛.谷氨酰胺抗鲤鱼红细胞凋亡作用及作用机制研究.四川农业大学博士研究生学位论文, 2013
团头鲂是我国重要的草食性经济鱼类(张飞明等, 2011; 苏建国等, 2000)，而水体中氨氮含量过高是促使团头鲂发病的重要因素，严重制约其高密度养殖模式的发展(Sun et al, 2014a、b)。本实验室通过前期氨氮胁迫的转录组测序等研究筛选到Caspase 9相关基因，因此，该研究旨在通过克隆Caspase 9基因cDNA全长及序列分析，应用荧光定量PCR技术分析该基因在团头鲂不同组织中的表达情况，并分析脑和肝两种组织在不同氨氮胁迫时间下Caspase 9基因的表达模式，研究结果可为进一步了解团头鲂Caspase 9在胁迫过程中的作用及其调控机制提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料团头鲂幼鱼取自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心南泉养殖基地，选择活泼健康、规格一致的团头鲂幼鱼[(15.00±0.86) g] 500尾。试验前，用基础饲料驯养14 d。试验饲养期间，水温为23−24℃，溶氧≥5 mg/L，氨氮≤0.05 mg/L，pH为6.8−7.2。进行胁迫试验时，提前2 d停止投喂饲料。通过前期试验，获得团头鲂氨氮胁迫96 h的半致死浓度(LC50)为52.87 mg/L，以该浓度的40%作为胁迫浓度，即氨氮浓度约为20 mg/L和0.02 mg/L的试验组和对照组进行急性胁迫试验，每组设3个重复，每个重复40尾鱼，分别随机放入6个蓄养槽(体积约为300 L)。试验所用蓄养槽在空间位置上随机排布，以减小各个试验组间因光线等因素造成的误差。胁迫试验过后，用曝气自来水更换各组溶液，并恢复投饵。
1.2 试验方法 1.2.1 总RNA的提取采用TaKaRa总RNA提取试剂盒(D9108A)提取。取团头鲂肝组织转入液氮预冷的研钵中，加入液氮，迅速将组织研磨成粉，然后向研钵中加入1.5 ml的RNAiso Plus，按照试剂盒说明书上的步骤提取总RNA，用紫外分光光度计测定其浓度和纯度，通过琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，保存于−80℃低温冰箱。
1.2.2 Caspase 9基因3′ 端和5′ 端扩增从本实验室构建的团头鲂cDNA文库中筛选出1个Caspase 9基因片段作为中间序列，在NCBI primer BLAST上在线设计并筛选合适的3′ RACE和5′ RACE特异性引物(表 1)，并以提取的团头鲂肝总RNA为模板，按照TaKaRa试剂盒上的步骤进行Caspase 9基因3′ 端和5′ 端扩增，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，选择较亮的目的条带进行胶回收，回收产物经16℃过夜与pMD18-T载体连接，然后转入到DH5α感受态细胞中，在含氨苄的固体培养基中过夜培养，最后挑选白色单菌落扩大培养过夜，将阳性产物送于BioSune测序。
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表 1 基因克隆和表达所用的引物及其序列 Table 1 Primers and their sequences used in the gene cloning and expression |
将3′ 和5′ 测序结果结合中间序列进行拼接，得到团头鲂Caspase 9全长cDNA序列。在Compute pI/Mw程序中(http://web.expasy.org/compute_pi/)预测蛋白分子量及等电点，
1.2.4 团头鲂不同组织Caspase 9的表达分析提取团头鲂肌肉、鳃、肾、脑、肝和肠道6个组织的总RNA，按照TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT Reagent Kit试剂盒说明书进行反转得到cDNA，根据拼接的Caspase 9基因全长cDNA序列设计荧光定量特异性引物cas9 qF和cas9 qR(表 1)，扩增长度为226 bp；以团头鲂的β-actin基因(序列号：AY170122)为荧光定量反应的内参基因，设计内参引物β-actin-F和β-actin-R(表 1)，扩增产物长度为152 bp。对荧光定量基因特异性引物和内参引物进行PCR扩增，电泳检测其在团头鲂中的扩增情况，判断目的片段的大小。
荧光染料使用TaKaRa的SYBR® Premix ExTaqⅡ，反应在Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System定量仪上进行，反应总体系为20 μl：cDNA 2 μl，引物各0.8 μl (10 μmol/L)，SYBR® Premix ExTaqⅡ10 μl，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μl，dH2O 6 μl，采用两步法进行扩增。反应程序为95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40个循环。每个样品3次重复试验以减少误差，先用标准品梯度稀释进行定量PCR，获得内参基因及溶菌酶基因的标准曲线，数据均用“平均值±标准差”表示(Schmittgen et al, 2008)，采用双标准曲线法进行相对定量分析，使用SPSS 17.0软件用Turkey法及独立样本T检验进行比较显著性分析(P < 0.05为显著水平)。
1.2.5 团头鲂肝和脑组织应答氨氮胁迫和恢复后Caspase 9基因的表达分析在氨氮胁迫后0、3、6、12、24、48、72 h和恢复后72 h时，分别在试验组和对照组中随机取3尾团头鲂，取肝和脑组织保存于–80℃冰箱，用于后续的荧光定量PCR分析试验。反应步骤同上，对照组和试验组的cDNA样品在每个时间点进行3个特异性引物和内参基因的重复。
2 结果与分析 2.1 团头鲂Caspase 9基因3′ RACE和5′ RACE扩增、克隆及全长拼接根据实验室提供的中间序列，以团头鲂肝的RNA为模板，经RACE PCR扩增到了团头鲂Caspase 9的3′ 端和5′ 端序列，结果如图 1所示，Caspase 9 5′ RACE在靠近500 bp处有一条明显很亮的条带，3′ RACE在1000−2000 bp间有一条很亮的特异性条带。
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图 1 团头鲂Caspase 9 5′ RACE和3′ RACE扩增结果
Figure 1 5′ RACE and 3′ RACE amplification results of Caspase 9 in M. amblycephala
M. DL2000 Marker；条带5′ : 5′ 末端扩增结果； 条带3′ . 3′ 末端扩增结果 M. DL2000 Marker; Lane 5′ . 5′ RACE; Lane 3′ . 3′ RACE |
序列拼接得到全长1613 bp的团头鲂Caspase 9基因cDNA序列(GenBank注册号为KM604705)，包含有185 bp的5′ UTR、96 bp的3′ UTR、1332 bp的ORF，编码443个氨基酸，并且有明显的AATAAA加尾信号和Poly(A)尾(图 2)。Compute pI/Mw程序预测该基因的蛋白分子量为49.19 kDa，理论等电点(pI)为5.93。结构域分析显示，该基因有大亚基(P20)、小亚基(P10)和NH2末端结构域(Prodomain) 3个结构域，同时在P20结构域中包含了半胱氨酸和组氨酸催化位点，未检测到信号肽序列。序列中还存在一处ATTTA的mRNA不稳定信号，多预示着Caspase 9的降解，利于该基因的调控作用。
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图 2 团头鲂Caspase 9基因cDNA全序列以及由此推测的氨基酸序列
Figure 2 cDNA sequence of Caspase 9 gene and putative amino acid sequence in M. amblycephala
浅色阴影表示Prodomain，包含CARD结构域；深色阴影表示P20大亚基；加粗下划线表示P10小亚基； 下划线表示mRNA不稳定信号；虚线表示组氨酸催化位点；波浪线表示半胱氨酸催化位点；双下划线表示加尾信号 The light shadow represents Prodomain, including CARD domain; dark shadow represents P20; bold underline represents P10; regular underline represents the unstable signal of mRNA; dotted line represents histidine catalytic site; wavy line represents cysteine catalytic site; double underline represent tailing signal |
运用DNAMAN软件将团头鲂Caspase 9的氨基酸序列与其他已公布的6种鱼类的氨基酸序列进行比对分析，平均同源水平高达77.74%，如图 3所示，黑色阴影表示同源性大于75%的氨基酸，显示该基因在鱼类中的同源性较高，且均有比较保守的组氨酸和半胱氨酸活性位点。
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图 3 团头鲂Caspase 9基因推导氨基酸序列的多序列比较 Figure 3 DNAMAN multiple sequence alignment of Caspase 9 in M. amblycephala and other species 组氨酸活性位点以黄色方框框出，半胱氨酸活性位点以红色方框框出 Histidine catalytic site was represented by yellow box; cysteine catalytic site was represented by red box |
用MAGE 5.0对已公布的几种哺乳动物和鱼类常见的Caspase氨基酸序列(表 2)以及团头鲂的Caspase 9氨基酸序列采用邻位相联法构建系统进化树(图 4)。系统进化树主要分为5大支，Caspase 1、2、3、8、9各处一大支，表明不同的Caspase基因在进化上存在着明显差异；Caspase 1和2处于进化树的基部，显示这两种Caspase在进化上是相对原始的类型；团头鲂Caspase 9与锦鲤亲缘关系最近，与其他鱼类聚为一支，再与哺乳动物Caspase 9聚为一大支。总的来说，进化树中不同物种的Caspase与其所处的进化地位大体一致。
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表 2 进化树所用物种Caspase基因及其登录号 Table 2 Protein and GenBank accession No. of different species in the evolutionary tree |
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图 4 利用MEGA 5.0软件构建各物种Caspase进化树 Figure 4 Phylogenetic tree of the Caspase amino acid sequence in different species by MEGA 5.0 1. Caspase 3; 2. Caspase 8; 3. Caspase 9; 4. Caspase 2; 5. Caspase 1 |
以团头鲂β-actin为内参基因，检测健康团头鲂的6个组织中Caspase 9基因的相对表达量，结果见图 5-1，该基因在所检测组织中均有表达且均存在显著差异(P < 0.05)，在脑组织中表达量最高，往后依次是肝、肾、肠道、鳃，在肌肉中表达量最少。电泳检测结果显示(图 5-2)，鳃和肌肉的条带较淡，与其结果一致。
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图 5 团头鲂Caspase 9基因qRT-PCR结果
Figure 5 qRT-PCR results of Caspase 9 gene of M. amblycephala
(a) qRT-PCR方法检测团头鲂各组织中Caspase 9 mRNA的相对表达量，柱上不同字母代表组间差异显著(n=3, P < 0.05) (b)团头鲂β-actin基因和Caspase 9基因在6个不同组织的扩增结果 M. Marker DL2000; 1.肠道; 2.肝; 3.脑; 4.肾; 5.鳃; 6.肌肉 (a) Caspase 9 mRNA expression in different tissues of M. amblycephala by qRT-PCR, different letters represent significant difference between groups (n=3, P < 0.05) (b) Amplification results of caspase 9 and β-actin gene in six different tissues of M. amblycephala, M. Marker DL2000; 1. Intestine; 2. Liver; 3. Brain; 4. Kidney; 5. Gill; 6. Muscle |
采用实时荧光定量PCR方法探究团头鲂受到氨氮胁迫3、6、12、24、48、72 h以及氨氮恢复正常水平72 h后，肝组织和脑组织中Caspase 9的表达规律。结果显示，肝和脑在胁迫前后表达模式类似，整体呈类似波浪形表达谱。如图 6所示，肝组织中的Caspase 9基因在氨氮胁迫的3 h，其表达量均显著高于对照组(P < 0.05)，在此之后表达量有所下降，6−12 h表达量略高于对照组，但是与对照组之间无显著差异(P > 0.05)，之后表达量又有所上升，24−72 h表达量均显著高于对照组(P < 0.05)，并在72 h达到最高峰，去除胁迫72 h后，该基因的表达量有所下降，有恢复至对照组水平的趋势；如图 7所示，脑组织中的Caspase 9 mRNA在胁迫的12 h才出现表达量显著上升的趋势，之后表达量有所下降，24 h和48 h与对照组差异不显著(P > 0.05)，随后表达量又有所上升，同样也在胁迫后的72 h表达量达到最大，氨氮恢复至正常水平72 h后，Caspase 9的表达量明显下降，表达量与对照组差异不显著(P > 0.05)，恢复至对照组水平。
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图 6 氨氮胁迫和恢复刺激后团头鲂肝组织中Caspase 9基因mRNA的表达量变化 Figure 6 Expression of Caspase 9 in liver of M. amblycephala in response to ammonia-N stress and recovery *表示与对照组差异显著(n=3, P < 0.05) * means significant difference compared with control (n=3, P < 0.05) |
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图 7 氨氮胁迫和恢复刺激后团头鲂脑组织中Caspase 9基因mRNA的表达量变化 Figure 7 Expression of caspase 9 in the brain of M. amblycephala in response to ammonia-N stress and recovery *表示与对照组差异显著(n=3, P < 0.05) * means significant difference compared with control (n=3, P < 0.05) |
细胞凋亡(Apoptosis)，又称程序性细胞死亡(Programmed cell death, PCD)，是一个主动的、由基因决定的、细胞自动结束的过程，不同于细胞坏死的正常生理过程，在对机体发育的调控、内环境稳态的维护、免疫耐受的形成以及肿瘤监控等多种生理和病理过程中发挥重要作用。Caspase家族在进化上非常保守，在细胞凋亡通路中起着至关重要的作用，其中Caspase 9是线粒体凋亡途径的启动子，是细胞凋亡过程中的关键蛋白酶(LeBlanc, 2003)。由于Caspase的特殊功能，Caspase的激活受到严格的控制，只有在生物体内出现无用或者有害细胞才能激活其催化活性(Menze et al, 2010)。
该研究首次克隆到团头鲂Caspase 9的全长cDNA序列1613 bp，包含开放阅读框(ORF) 1332 bp，编码443个氨基酸，预测编码蛋白质分子量为49.19 kDa。Caspase 9与其他已经鉴定出来的Caspase类似，存在NH2末端原结构域(Prodomain)、大亚基(P20)、小亚基(P10) 3个典型的结构域，同时P20中有1个含有cys活性位点的保守五肽序列QACGG，与已鉴定出的Caspase 9相同(Duan et al, 1996; Srinivasula et al, 1996)，同Caspase 8 (QACQG)及其他Caspase(QACRG)有差异。NH2末端原结构域中包含Caspase 9募集结构域(Caspase-recruitment domain, CARD)，通过CARD与开放的Apaf-1结合，进而与大小亚基结合使Caspase 9得到活化，启动细胞凋亡(Hofmann et al, 1997; Li et al, 1997; Srinivasula et al, 1998)。同时该序列有一个mRNA不稳定信号(ATTTA)，该信号预示着Caspase 9 mRNA的快速降解，利于Caspase 9的精确调控(杨莹莹等, 2012)，张金洲(2008)1)在大黄鱼Caspase 9中也发现了3个mRNA不稳定信号。氨基酸序列比对和系统进化树分析均显示，团头鲂Caspase 9基因在进化上高度保守，并与锦鲤的亲缘关系最近。
1)张金洲.内源性凋亡途径在大黄鱼抗细菌感染中的作用及两个新的CC型趋化因子的功能研究.厦门大学博士研究生学位论文, 2008
Caspase 9的组织定量表达分析显示，该基因在各组织中均有表达，但在脑组织中的表达量最高，然后依次是肝、肾、肠道，鳃和肌肉表达量较低。而已报到的海鲈(Lateolabrax japonicus) Caspase 9基因在肠和肝脏中表达量高，头肾中表达量低(Reis et al, 2007)；大黄鱼Caspase 9在肾中高表达，在肠和肌肉中低表达(张金洲, 2008)1)，这种差异可能与鱼的不同种类有关。脑和肾脏是鱼体神经内分泌系统中的重要组织，同时脑对免疫反应有调控作用(王文博等, 2002)，而肾脏是鱼类重要的免疫器官，由此推测团头鲂中Caspase 9可能参与机体免疫反应。组织定量表达结果显示，Caspase 9在脑和肝组织中的表达量最高，乔顺风(2005)研究显示，氨氮先是侵袭黏膜，其次是神经系统，同时伴随着肝肾系统的破坏，最终导致水产动物昏迷甚至死亡。因此，试验选择脑和肝两个组织作为研究对象。在氨氮胁迫和恢复刺激后不同时间段对团头鲂肝和脑组织中Caspase 9基因的定量表达分析显示，肝和脑组织中该基因的表达规律相似，表达水平均呈现先升高后降低再升高的变化过程，并都在胁迫后的72 h表达量达到最大，恢复72 h后其表达量逐渐恢复至对照水平。王芸(2011)2)对中国对虾氨氮胁迫过程中Caspase基因表达量变化研究显示，Caspase在鳃组织和血液淋巴的表达呈现先升高后降低再升高的变化过程，该研究结果与其类似。研究显示，凋亡系统被激活的作用是清除无用或者有害细胞，以维持生物正常发育的稳态(White, 1996; Raff, 1992)。因此，推测氨氮胁迫引起团头鲂Caspase 9表达量上调、激活细胞凋亡通路，为了清除无用或有害细胞，减少能量消耗来应对氨氮胁迫，暗示Caspase 9基因可能参与团头鲂应激过程中的免疫防御，且与细胞凋亡有关。
1)张金洲.内源性凋亡途径在大黄鱼抗细菌感染中的作用及两个新的CC型趋化因子的功能研究.厦门大学博士研究生学位论文, 2008
2)王芸. pH、氨氮胁迫对中国对虾细胞凋亡和抗氧化系统影响机理的研究.上海海洋大学博士研究生学位论文, 2011
团头鲂是我国主要的淡水养殖品种，经济价值显著。本研究对团头鲂Caspase 9及其在氨氮胁迫中的表达变化的结果揭示，氨氮胁迫下Caspase 9基因参与团头鲂的免疫防御。Randall等(2002)报道指出，氨氮对水产动物的危害机理是高浓度的氨氮会取代生物体内的钾离子，引起N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体结合活性的降低，导致中枢神经系统中流入过量的钙离子，进而导致脑缺血并引起细胞死亡；也有卢娜娜等(2013)研究表明，Caspase 9介导的细胞凋亡在脑缺血过程中发挥了重要作用，本研究结果显示，脑组织Caspase参与了团头鲂氨氮胁迫的分子过程，支持了这一观点，而具体的调控机制仍不清楚，Caspase 9参与团头鲂氨氮胁迫应激的分子机制及具体的调控机制还有待进一步的研究。
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