近年来，对虾养殖业迅速发展，中国逐渐成为世界范围内的对虾养殖大国，我国对虾的养殖产量约占世界产量的1/3，而维持这一养殖规模所需要的苗种数量，每年在5000亿尾以上(江世贵, 2010)¹⁾。据中国渔业统计年鉴数据显示，我国凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)苗种生产量在2008–2012年的各年分别达到3770亿尾、4484亿尾、4635亿尾、6332亿尾和6948亿尾，对虾苗种产量在逐年上升。对虾苗种是对虾养殖业发展的基础，投放健康苗种是对虾养殖成功的先决条件。对虾体内的细菌组成影响着对虾的健康状况，某些细菌成为优势菌时可能会导致对虾患病，如Vandenberghe等(1999)研究发现，溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)在对虾幼体的所有时期中均为优势菌，哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)多在患病的对虾幼体内为优势菌；李筠等(2004)也曾报道，当哈维氏弧菌为优势菌时，对虾容易发生病害。另有些正常存在于对虾体内的细菌可以作为益生菌来提高对虾对病害的防御能力(孙艳等, 2012; Vaseeharan et al, 2003; 李桂英等, 2011)。所以，定性、定量研究对虾体内的细菌菌群结构对于研究对虾的健康状况具有重要意义。细菌病和病毒病是影响对虾产业最主要的病害(Lightner et al, 1998; Wang et al, 2015; Aftabuddin et al, 2011; Lightner, 1999)，有研究报道，病毒和细菌相互作用会引起对虾的大量死亡(苏永全等, 1995; Phuoc et al, 2008; 安永菊, 2007)，并且对虾在感染病毒后体内的某些病原菌数量大量增加，从而减弱对虾的抵御能力而加速死亡(李继秋等, 2006; 秦崇涛等, 2011)。国内外关于对虾体内细菌的研究已有报道(李玉宏等, 2014; Li et al, 2004)，但是，关于对虾苗种体内优势菌结构组成以及携带病毒的调查还鲜有报道，通过多地点的调查来研究携带病毒和不携带病毒的对虾幼苗体内的优势菌结构组成，可为养殖对虾病害的发生和防控提供必要的基础数据。

凡纳滨对虾和中国明对虾(Fenneorpenaeus chinensis)苗种样品共采集9批次，苗种采集时间为2013年4–9月，采样地包括山东、天津、浙江，所采集的对虾苗种均为无任何病症的人工培育对虾仔虾幼体。

采集的对虾苗种置于盛有海水的充气袋中运回实验室。随机取10尾对虾苗种，立即用无菌的PBS(pH=7.0)缓冲液冲洗3–4次，无菌滤纸吸干对虾表面的水分，放入无菌EP管中称重后，加入1 ml无菌PBS，无菌研磨棒研磨成匀浆。取0.1 ml的匀浆液用无菌PBS缓冲液进行10倍梯度系列稀释，分别取0.1 ml涂布于2216E固体培养基上，每个梯度3个平行。倒置于37℃恒温培养箱中培养16–20 h，肉眼观察2216E平板上细菌的菌落形态，在菌落数为30–300的平板上，对菌落形态完全一致的细菌进行编号及计数，同时，挑选出优势菌株进行划线纯化，纯化的优势菌保存在–80℃冰箱中。

液体培养的细菌菌悬液0.2 ml放入无菌的EP管中，12000 r/min离心2 min，去除上清液，再加入0.2 ml的无菌水，充分吹打混匀，沸水浴10 min后，12000 r/min离心2 min，取上清液(DNA悬液)作为PCR扩增的模板。

以提取的细菌基因组DNA为模板，用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，引物由上海生物工程公司合成。扩增引物序列(李筠等, 2006)为：

正向引物序列5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

反向引物序列5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3' 。

PCR 50 μl扩增体系：模板DNA 2 μl，正向引物、反向引物各1 μl，Premix Ex Taq 25 μl，ddH₂O 21 μl。PCR扩增程序：95℃热启动5 min；94℃预变性10 min；94℃变性45 s，57℃退火45 s，72℃复性1 min，重复35个循环；72℃延伸10 min。将PCR产物送往上海桑尼生物科技有限公司进行测序。菌株的16S rDNA序列结果在 http://ezgenome.ezbiocloud.net/ezg_BLAST网站上进行比对，共鉴定149株菌。

白斑综合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)的检测采用中华人民共和国国家标准GB/T28630.2-2012：白斑综合征(WSD)诊断规程第2部分套式PCR检测法。传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal & haematopoietic necrosis virus, IHHNV)的检测采用中华人民共和国国家标准GB/T25878.1-2010：对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)检测PCR法。

采用SPSS 17.0软件对实验数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，当差异显著(P＜0.05)时，用Duncan氏法作多重比较。

中国明对虾苗种体内的可培养细菌总数、优势菌种类及百分比、病毒检测结果见表 1。中国明对虾苗种体内的可培养细菌总数在1.57×10⁵–4.14×10⁷ CFU/g之间，弧菌属在中国明对虾苗种样品体内占绝对优势，达57.14%–90.09%。其他优势菌属主要包括假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、发光杆菌属(Photobacterium)、Bizionia、盐单胞菌属(Halomonas)、Planococcus、海杆菌属(Marinobacter)。4批次中国明对虾苗种病毒检测阳性样品中，有1批次同时检出WSSV、IHHNV两种病毒，另有两批次只检出WSSV，1批次只检出IHHNV。同时检出两种病毒的对虾苗种体内的弧菌数量为8.0×10⁶ CFU/g，比例为57.14%。只检出WSSV的对虾苗种体内的弧菌数量在1.65×10⁷–3.67×10⁷ CFU/g之间，比例在88.58%– 89.10%之间。只检出IHHNV的对虾苗种体内的弧菌数量为1.15×10⁵ CFU/g，比例为73.34%。

表 1(Tab. 1)

表 1 中国明对虾苗种体内的可培养细菌数量、优势菌种类及数量及病毒检测结果 Table 1 The quantity of culturable bacteria, dominant bacteria and virus in the larva of F. chinensis 采样 日期 Sampling date 采样地点 Sampling site 可培养细菌总数 Total culturable bacteria (CFU/g) 优势菌属 Dominant bacteria 携带病毒 Carrying virus 名称Name 数量Amount(CFU/g) 占细菌的总 数的比例 Percentage in total (%) WSSV IHHNV 04-16 山东日照 Rizhao, Shandong 1.40×107±1.71×106a 弧菌属Vibrio 8.00×106±1.41×105b 57.14±1.01 + + 假交替单胞菌属 Pseudoalteromonas 2.00×106±1.17×106a 14.28±8.38 发光杆菌属 Photobacterium 2.00×106±1.21×106a 14.28±8.65 Bizionia argentinensis 2.00×106±2.47×105a 14.28±1.76 04-19 山东潍坊 Weifang, Shandong 2.22×106±9.76×105b 弧菌属Vibrio 2.00×106±1.01×106a 90.09±45.71 N N 芽孢杆菌属 Bacillus 1.83×105±7.74×104a 8.24±3.49 05-11 山东烟台 Yantai, Shandong 1.57×105±1.18×104b 弧菌属Vibrio 1.15×105±1.20×104a 73.34±7.66 − + 假交替单胞菌属 Pseudoalteromonas 2.09×104±7.33×103a 13.33±4.67 芽孢杆菌属 Bacillus 1.05×104±6.95×103a 6.67±4.43 盐单胞菌属 Halomonas 9.80×103±2.06×103a 6.24±1.31 05-21 山东日照 Rizhao, Shandong 4.14×107±7.43×106a 弧菌属Vibrio 3.67×107±7.58×106d 88.58±18.83 + − 动性球菌属 Planococcus 2.90×106±4.04×105a 7.00±0.98 假交替单胞菌属 Pseudoalteromonas 1.78×106±4.66×105a 4.31±1.12 05-21 山东日照 Rizhao, Shandong 1.85×107±2.25×106a 弧菌属Vibrio 1.65×107±2.95×106c 89.10±15.90 + − 海杆菌属 Marinobacter 2.00×106±6.95×105a 10.80±3.76     注：1) “+”病毒检测结果为阳性；“−”病毒检测结果为阴性；“N”没有检测病毒。2)同一列不同字母表示样品中存在显著性差异(P＜0.05)     Notes: 1) ‘+’ are virus positive; ‘−’ are virus negative; ‘N’ are virus not been tested. 2) Different superscript letters within each column represent significant differences among samples (P＜0.05)

表 1 中国明对虾苗种体内的可培养细菌数量、优势菌种类及数量及病毒检测结果 Table 1 The quantity of culturable bacteria, dominant bacteria and virus in the larva of F. chinensis

凡纳滨对虾苗种体内的可培养细菌总数、优势菌种类及百分比、病毒检测结果见表 2。

表 2(Tab. 2)

表 2 凡纳滨对虾苗种体内的可培养细菌数量、优势菌种类及数量及病毒检测结果 Table 2 The quantity of culturable bacteria, dominant bacteria and virus in the larva of L. vannamei 采样日期 Sampling date 采样地点 Sampling site 可培养细菌总数 Total culturable bacteria (CFU/g) 优势菌属Dominant bacteria 携带病毒 Carrying virus 名称Name 数量 mount (CFU/g) 占细菌总数的比例 Percentage in total (%) WSSV IHHNV 05-11 山东烟台 Yantai, Shandong 1.36×105±9.05×103b 弧菌属Vibrio 6.00×104±8.16×103a 43.80±6.00 盐单胞菌属 Halomonas 4.00×104±4.51×103a 29.20±3.32 假交替单胞菌属 Pseudoalteromonas 2.00×104±8.16×103a 14.60±6.00 动性球菌属 Planococcus 1.30×104±4.83×103a 9.49±2.85 05-14 天津大港Dagang, Tianjin 1.75×106±1.26×105b 弧菌属Vibrio 7.00×105±7.26×104a 40.00±4.15 − + 发光杆菌属 Photobacterium 5.00×105±3.51×104a 28.57±2.01 极地杆菌属 Polaribacter 4.30×105±1.07×105a 24.57±6.09 盐单胞菌属 Halomonas 1.00×105±1.41×104a 5.71±0.81 07-05 浙江温州Wenzhou, Zhejiang 4.6×105±1.95×104b 弧菌属Vibrio 4.10×105±2.16×104a 89.03±4.70 − − 假交替单胞菌属 Pseudoalteromonas 4.68×104±2.75×103a 10.17±0.60 09-02 山东青岛Qingdao, Shandong 1.23×107±2.21×106a 弧菌数Vibrio 1.11×107±2.30×106b 90.23±18.70 + − 假交替单胞菌属 Pseudoalteromonas 1.03×106±9.20×104a 8.41±2.12     注：1) “+”病毒检测结果为阳性；“−”病毒检测结果为阴性。2)同一列不同字母表示样品中存在显著性差异(P＜0.05)     Notes: 1) ‘+’ are virus positive; ‘−’ are virus negative. 2) Different superscript letters within each column represent significant differences among samples (P＜0.05＝

表 2 凡纳滨对虾苗种体内的可培养细菌数量、优势菌种类及数量及病毒检测结果 Table 2 The quantity of culturable bacteria, dominant bacteria and virus in the larva of L. vannamei

各批次凡纳滨对虾苗种样品体内的可培养细菌总数均在1.36×10⁵–1.27×10⁷ CFU/g之间，弧菌属在所有凡纳滨对虾苗种体内占绝对优势，达40.00%–90.23%。其他优势菌属主要包括假交替单胞菌属、芽孢杆菌属、发光杆菌属、Bizionia、盐单胞菌属、动性球菌属、海杆菌属。4批次凡纳滨对虾苗种样品中，有1批次只检出WSSV，1批次只检出IHHNV。只检出WSSV的对虾苗种体内的弧菌数量为1.11×10⁷ CFU/g，比例为90.23%。只检出IHHNV的对虾苗种体内的弧菌数量为7.0×10⁵ CFU/g，比例为40.00%。未检出WSSV和IHHNV的对虾苗种体内的弧菌数量为6.4×10⁴– 4.0×10⁵ CFU/g，比例为43.80%–89.03%。

综合表 1和表 2的结果可以看出，凡纳滨对虾和中国明对虾苗种体内的可培养细菌总数均在10⁵–10⁷CFU/g之间；弧菌在对虾苗种体内占绝对优势，达40.00%– 90.23%；同时检测出发光杆菌属、芽孢杆菌属、盐单胞菌属、Biaionia、海杆菌属、动性球菌属、极地杆菌属，呈现出菌属分布不均匀、细菌种属类别少、个别菌属分布多的特征。部分凡纳滨对虾和中国明对虾苗种样品检测为WSSV和IHHNV阳性：WSSV检出率为50.0%，IHHNV检出率为37.5%，两种病毒同时检出率为11.11%。检出WSSV病毒的对虾苗种体内的总菌数量在1.23×10⁷–4.14×10⁷ CFU/g之间，显著高于其他批次的样品(P＜0.05)，且弧菌数量在10⁷ CFU/g左右，显著高于其他批次的样品(P＜0.05)；只检出IHHNV以及未检出病毒的对虾苗种体内的弧菌数量为10⁴–10⁶ CFU/g，弧菌属在凡纳滨对虾和中国明对虾苗种体内普遍存在且为优势菌属，但弧菌数量在对虾苗种体内的比例变化幅度较大。

9批次样品中，中国明对虾苗种和凡纳滨对虾苗种体内的优势菌菌群组成以及数量波动较大，且菌属分布不均匀，呈现细菌种属类别少、个别菌属分布多的特征，这可能是受养殖环境的影响。冯娟等(1999)发现，中国明对虾育苗池中假单胞菌属和弧菌属占绝对优势，也呈现细菌种属类别少、个别菌属分布多的特征。宛立等(2006)发现，同一养殖场不同养殖时间的凡纳滨对虾消化道内细菌组成有所差异，而且优势菌也不相同。Vandenberghe等(1998)调查研究发现，中国北方的几个养殖场中健康和患病的中国明对虾幼苗以及养殖水体中的细菌菌群组成不稳定，可能受投喂饲料以及养殖环境的影响。

凡纳滨对虾和中国明对虾苗种体内中弧菌属占绝对优势，达40.00%–90.23%。Wang等(2000)研究发现，中国明对虾成虾消化道内的优势菌为弧菌属和假单胞菌属，且在前肠、中肠和后肠中的细菌数量分别为1.3×10⁵ CFU/尾、2.8×10⁵ CFU/尾和1.1×10⁴CFU/尾。中国明对虾从蚤状幼体3期后至仔虾5/6期，弧菌明显占优势(李筠等, 2004)。溶藻弧菌在对虾幼苗所有时期中为主要的优势菌，但优势菌与对虾幼体的健康状况有关(Vandenberghe et al, 1998、1999)。

本研究发现，检出WSSV和同时检出两种病毒的对虾幼苗体内的弧菌数量在10⁷ CFU/g左右，显著高于只检出IHHNV病毒和未检出病毒的对虾幼苗体内的弧菌数量(10⁴–10⁶ CFU/g) (P＜0.05)，根据细菌分离和病毒检测结果推测，对虾苗种携带WSSV病毒会引起体内的弧菌数量增加。这一结果与李继秋等(2006)曾报道的感染WSSV的凡纳滨对虾肠道内的弧菌数为18.75%，而未感染WSSV的凡纳滨对虾肠道内的弧菌数为51.78%的结果不同。而秦崇涛等(2011)曾报道，感染WSSV病毒的克氏原鳌虾(Procambarus clarkii)血淋巴中的细菌数量约为正常鳌虾的100倍，只是这些增加的细菌主要为弗劳地柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)和琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii)，可能是对虾苗种和成虾在感染病毒后引起对虾体内细菌变化不尽相同。对虾携带病毒会引起对虾苗种体内的弧菌数量增加，是否会由此增加后期养殖风险，因未做相应跟踪调查，还不得而知。弧菌是对虾体内存在的正常菌群，一般为优势菌，但一些弧菌是条件致病菌，一旦养殖环境恶化或对虾免疫力下降将会引起细菌在体内的大量繁殖而导致对虾死亡。Phuoc等(2008)研究报道了感染WSSV病毒的对虾会增加对虾对坎氏弧菌(Vibrio campbellii)的敏感性。丁燏等(2000)曾报道，弧菌的潜伏感染会促进病毒的增殖，而病毒的潜伏感染不会促进弧菌的继发感染，但二者的作用机制并不明确，需要进一步研究。

本研究应用16S rDNA序列测定分析来鉴定从养殖对虾苗期体内分离的细菌，更适用于确定属及属以上的分类单位的亲缘关系，优点是速度快、准确率高、高通量，基本可以反映特定环境下细菌多样性特征。如果进一步将分离菌株鉴定到种，还需要逐一对菌株进行形态学特性、生理生化特征、血清学特点等进行分析和确认。由于本研究分离的菌株较多，暂将分离的细菌鉴定到属，但所有菌株均已保存于实验室菌种库内，以备研究菌株的特性或生物学功能时活化使用。通过16S rDNA序列测定以及系统进化树的分析仍可以将一些菌株初步鉴定到种，本研究中，携带病毒的对虾苗种体内的优势弧菌与巴西弧菌(Vibrio brasiliensis)、坎氏弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌相似度较高，不携带病毒的对虾苗种体内的优势弧菌与Vibrio diabolicus和溶藻弧菌相似度较高。溶藻弧菌在对虾幼体的所有时期中均为优势菌，哈维氏弧菌多在患病的对虾幼体内为优势菌(Vandenberghe et al, 1999)，巴西弧菌和Vibrio diabolicus还鲜有报道，关于养殖对虾苗种体内的优势菌与对虾携带病毒的关系还有待做进一步深入的研究。