鱼类能够通过视觉来辨别物体的大小、形状、颜色、距离方位和移动情况(林浩然, 2011)，在摄食过程中，一些鱼类靠视觉寻找和发现食物，辨认和选择食物，摄食时方向和姿态的调整(李大勇等, 1994)。不同摄食习性的鱼类的视网膜结构特征存在一定差异(林浩然, 2011)，摄食中视觉起主要作用的鱼类被称为“视觉鱼类”，如白昼时在中上层和浅水层摄食浮游、底栖生物的鱼类以及追逐捕食的凶猛鱼类，这些鱼类的视觉具有明视和暗视两种光感受系统(梁旭方等, 1998)。研究鱼类视网膜的结构特征及其相关特性，有助于进一步深入分析鱼类的摄食行为。

国外有关鱼类视觉特性与摄食行为方面的研究比较深入(Bailes et al, 2010; Evans et al, 1993; Ota et al, 1999; Robinson et al, 2011; Sabatés et al, 2003)。Blaxter等(1970)研究发现，欧鳎(Solea solea)、小头油鲽(Microstomus kitt)和欧鲽(Pleuronectes platessa)在鱼苗变态期和成鱼期存在视网膜运动反应。Robinson等(2011)研究发现，不同波长的光线会影响金赤鲷(Pagrus auratus)的视力。国内学者也开展了一些鱼类视觉特征方面的研究，如有关蓝圆鲹(Decapterus maruadsi)、鲐鱼(Pneumatophorus japonicus)(杨雄里等, 1976)、河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)(胡先成等, 2007)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)(马爱军等, 2007)、条石鲷(Oplegnathus fasciatus)(何滔等, 2012)和达氏鲟(Acipenser dabryanus)(史玲玲等, 2013)的视觉特性研究。

大菱鲆(Scophthalmus maximus)是我国北方沿海重要的养殖经济鱼类。国内外在大菱鲆养殖技术、营养与饲料、消化系统发育特征等方面进行了大量的研究(鲁媛媛等, 2014；Leknes et al, 2012；陈慕雁等, 2006)。Neave(1984)研究了光照强度对大菱鲆视网膜运动反应的影响，但有关大菱鲆早期发育阶段视觉器官组织学特征的研究未见报道。作者采取石蜡组织切片的方法，对不同发育阶段大菱鲆的视网膜发育特征和视觉特性进行了研究，为大菱鲆摄食生理的研究提供理论依据，并为鲆鲽鱼类视觉器官的组织发育研究补充相关的生物学资料。

实验所用大菱鲆仔稚幼鱼为同批次孵化的鱼苗，取自烟台泰华海洋科技有限公司。鱼苗培育水温为(20.5±2)℃，盐度为29±1。实验从2013年7月16日开始，至9月3日结束，共50 d。根据大菱鲆鱼苗发育阶段划分，1–16日龄鱼苗处于仔鱼期，20–30日龄鱼苗处于稚鱼期，34–60日龄鱼苗处于幼鱼期(雷霁霖等, 2003)，分别取初孵、2、5、10、16、20、23、26、30、34、39、43和50日龄的健康鱼苗用于实验。

准备6个水体为6 L的方形塑料水槽，调节水温为20.5±0.5℃，将每阶段所取的72尾鱼苗随机放入6个水槽内，每槽12尾。3个水槽置于自然光下3 h，光照强度为100–500 lx，对鱼苗进行明适应；另外3个水槽用不透光的黑色胶带覆盖侧面和底部，上方用不透光的黑色塑料板覆盖，光照强度为0，对鱼苗进行暗适应3 h。

明暗适应后的鱼苗均用波恩氏液进行固定处理。其中，明适应后的鱼苗在自然光下直接固定，暗适应后的鱼苗在全暗环境的安全红光下进行固定。安全红光用3 W的红色LED灯距离0.5 m照射。样品固定24 h后，用70%酒精冲洗，并保存于其中。

样品经过乙醇梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋后，进行横向和纵向的连续切片，16日龄前鱼苗的切片厚度为4 μm，16日龄后鱼苗的切片厚度为5 μm。经HE染色后，在SMART生物显微镜下进行观察，用ISCapure图像采集软件拍摄照片。

在生物显微镜下，经台微尺校准，用目微尺测量各日龄鱼苗视网膜上外核层(ONL)、内核层(INL)和神经节细胞层(GCL)的厚度。

计数视网膜横切面上100 μm长度内，视锥细胞(CC)、外核层细胞核(ONN)及神经节细胞(GC)的数量，其中1个双锥以2个单锥计(Blaxter et al, 1967)，每个样品随机选择5个不同的区域进行计数。

分别计算视网膜上外核层细胞核与视锥细胞的数量比值(ONN/CC)、外核层细胞核与神经节细胞的数量比值(ONN/GC)(Blaxter et al, 1967)。

在视网膜上等距离取5个点，测量色素层厚度(P)，即从视网膜外缘到黑色素移动最外缘间的距离。测量视觉细胞层厚度(V)，即视网膜外缘到外界膜之间的距离。色素指数(Pigment Index，PI)=P/V(章厚泉等, 1989)。

实验数据(平均值±标准差)(Mean±SD)采用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA) (P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著)。

初孵仔鱼视网膜结构简单，晶体已发育，从脉络膜向玻璃体方向，视网膜分化为外核层、内核层和神经节细胞层(图 1-1)。2日龄仔鱼视网膜主要结构发育完备，视网膜上出现色素层，少量的视单锥细胞形成视锥细胞层(图 1-2)。10日龄仔鱼视网膜上出现1层水平细胞(图 1-3)。

图 1(Fig. 1)

图 1 大菱鲆鱼苗视网膜的早期发育特征 Figure 1 Retina development characteristics of turbot fry 1.初孵仔鱼的视网膜结构；2. 2 d仔鱼的视网膜结构；3. 10 d仔鱼的视网膜结构；4. 34 d幼鱼的视网膜结构；5. 50 d幼鱼的视网膜结构(图示外核层、内核层)；6. 50 d幼鱼的视网膜结构(图示神经节细胞层)；7. 5 d仔鱼明适应后视网膜结构；8. 5 d仔鱼暗适应后视网膜结构；9. 34 d幼鱼明适应后视网膜结构；10. 34 d幼鱼暗适应后视网膜结构A：无长突细胞；B：双极细胞；COL：视锥细胞层；GCL：神经节细胞层；H：水平细胞；INL：内核层；L：晶体；ONL：外核层；PEL：色素层；SC：视单锥细胞 1. The retina structure of newly hatched larva; 2. The retina structure of 2 d larva; 3. The retina structure of 10 d larva; 4. The retina structure of 34 d young fish; 5. The retina structure of 50 d young fish (It shows ONL and INL); 6. The retina structure of 50 d young fish (It shows GCL); 7. The retina structure of 5 d larva after light adaption for 3 h; 8. The retina structure of 5 d larva after dark adaption for 3 h; 9. The retina structure of 34 d young fish after light adaption for 3 h; 10. The retina structure of 34 d young fish after dark adaption for 3 h. A: Amacrine cell; B: Bipolar cell; COL: Cone cell layer; GCL: Ganglion cell layer; H: Horizontal cell; INL: Internal nuclear layer; L: Lens; ONL: Outer nuclear layer; PEL: Pigment layer; SC: Single cone cell

初孵仔鱼视网膜外核层较薄，只有1层细胞(图 1-1)，厚度为(5.2±1.1) μm (表 1)，10日龄仔鱼外核层有1–2层细胞(图 1-3)，34日龄幼鱼外核层有3–4层细胞(图 1-4)。从表 1可知，鱼苗从2日龄发育到16日龄，视网膜的外核层厚度显著增大(P < 0.01)，从16日龄发育到50日龄，外核层厚度没有出现显著变化(P > 0.05)。

表 1(Tab. 1)

表 1 不同发育阶段大菱鲆鱼苗视网膜的外核层(ONL)、内核层(INL)与神经节细胞层(GCL)厚度的变化(平均数±标准差) Table 1 Thickness variations of outer nuclear layer (ONL), internal nuclear layer (INL) and ganglion cell layer (GCL) of retinal of turbot fries (Mean±SD) 日龄Age (d) 外核层厚度 Thickness of ONL (μm) 内核层厚度 Thickness of INL (μm) 神经节细胞层厚度 Thickness of GCL (μm) 0 5.2±1.1a 12.2±0.8a 21.6±2.1f 2 6.0±0.0ab 14.8±1.1a 20.2±1.8ef 10 8.4±0.5b 18.4±2.2b 17.8±1.1de 16 11.6±1.7c 25.2±1.1c 17.2±2.3cde 20 11.6±1.1c 26.2±2.0c 16.4±0.9bcd 26 13.2±1.1c 29.8±1.1de 14.4±2.2abcd 34 13.6±0.9c 36.6±1.7f 13.8±1.1abc 43 13.0±0.7c 31.8±1.1e 13.4±1.1ab 50 12.8±3.0c 26.8±2.3cd 11.6±1.7a P 0 0 0   注：表中数据为平均数和标准差；同一列中平均数后上标不同表示差异显著(P < 0.05)，下同   Note: Values are means and standard deviation; Means with different superscripts within the same column have significant differences (P < 0.05), the same as follows

表 1 不同发育阶段大菱鲆鱼苗视网膜的外核层(ONL)、内核层(INL)与神经节细胞层(GCL)厚度的变化(平均数±标准差) Table 1 Thickness variations of outer nuclear layer (ONL), internal nuclear layer (INL) and ganglion cell layer (GCL) of retinal of turbot fries (Mean±SD)

初孵仔鱼视网膜内核层有5–6层细胞，此时内核层仅由双极细胞和无长突细胞组成，两种细胞间界限不明显(图 1-1)。10日龄仔鱼视网膜内核层出现水平细胞，但数量稀少(图 1-3)。34日龄幼鱼视网膜内核层最厚，包括1-2层水平细胞、6–7层双极细胞和5层无长突细胞(图 1-4)。随着鱼苗发育，内核层逐渐变薄，50日龄幼鱼视网膜内核层仅有1层水平细胞、3–4层双极细胞和3–4层无长突细胞(图 1-5)。由表 1可知，鱼苗发育过程中视网膜内核层的厚度先增大后减小。初孵仔鱼视网膜内核层的厚度仅为(12.2±0.8) μm，随着鱼苗发育，内核层的厚度显著增大(P < 0.01)，至34日龄时内核层的厚度达到最大(36.6±1.7) μm，之后内核层的厚度显著减小(P < 0.01)，50日龄时厚度减小至(26.8±2.3) μm。

初孵仔鱼视网膜神经节细胞层有5–6层细胞(图 1-1)，随鱼苗发育，神经节细胞层细胞数量逐渐减少，50日龄幼鱼的神经节细胞层仅有1层细胞，且细胞排列稀疏(图 1-6)。从细胞层厚度来看(表 1)，初孵仔鱼视网膜神经节细胞层的厚度最大(21.6±2.1) μm，随着鱼苗发育，神经节细胞层的厚度显著减小(P < 0.01)，其中，10–16日龄仔鱼的神经节细胞层厚度显著低于初孵仔鱼(P < 0.01)，20–26日龄稚鱼的神经节细胞层厚度显著低于2日龄仔鱼(P < 0.01)，50日龄幼鱼的神经节细胞层厚度显著低于20日龄稚鱼(P < 0.01)，34–50日龄幼鱼的神经节细胞层厚度没有显著变化(P > 0.05)。

从表 2可知，鱼苗发育过程中视网膜上视锥细胞的数量呈下降趋势，其中，26–30日龄稚鱼视网膜上视锥细胞的数量显著低于16日龄仔鱼(P < 0.01)，43–50日龄幼鱼视网膜上视锥细胞的数量显著低于20–26日龄稚鱼(P < 0.01)，34–50日龄幼鱼视网膜上视锥细胞的数量相比较没有显著差异(P > 0.05)。

表 2(Tab. 2)

表 2 大菱鲆鱼苗视网膜横切面上100 μm长度内视锥细胞(CC)、神经节细胞(GC)和外核层细胞(ONN)的数量及数量比(平均数±标准差) Table 2 The amounts of cone cell (CC), ganglion cell (GC) and nuclei of the outer nuclear layer (ONN), ratio of the amounts of ONN and CC, ratio of the amounts of ONN and GC per 100 μm length of the retina cross section of turbot fries (Mean±SD) 日龄 Age (d) 视锥细胞数量 Amount of CC (个/100 μm) 神经节细胞数量 Amount of GC (个/100 μm) 外核层细胞核数量 Amount of ONN (个/100 μm) 外核层细胞核与视锥 细胞的数量比 Ratio of ONN and CC 外核层细胞核与神经节 细胞的数量比 Ratio of ONN and GC 16 35.4±0.9e 64.8±6.6c 65.8±1.6a 1.86±0.04a 1.02±0.10a 20 33.2±3.3de 63.2±8.0c 75.2±2.9b 2.27±0.04ab 1.20±0.13ab 23 30.0±1.6cde 63.0±8.6c 88.2±3.1c 2.94±0.36abc 1.42±0.23ab 26 27.6±2.7bcd 57.0±19.0c 92.2±1.0cd 3.36±0.16bcd 1.75±0.51ab 30 25.6±3.3abc 48.8±17.4bc 93.0±3.5cd 3.70±0.21cde 2.16±0.90bc 34 24.0±2.0abc 45.0±7.6abc 93.8±3.2cd 3.93±0.13cde 2.14±0.41bc 39 23.4±2.7ab 34.2±6.1ab 96.2±2.6d 4.45±0.21de 2.88±0.48c 43 21.4±5.2a 30.8±1.9ab 94.8±4.0d 4.63±0.11e 3.10±0.20cd 50 20.4±2.1a 24.4±4.3a 94.2±3.4cd 4.64±0.15e 3.90±0.62d P 0 0 0 0 0

表 2 大菱鲆鱼苗视网膜横切面上100 μm长度内视锥细胞(CC)、神经节细胞(GC)和外核层细胞(ONN)的数量及数量比(平均数±标准差) Table 2 The amounts of cone cell (CC), ganglion cell (GC) and nuclei of the outer nuclear layer (ONN), ratio of the amounts of ONN and CC, ratio of the amounts of ONN and GC per 100 μm length of the retina cross section of turbot fries (Mean±SD)

鱼苗发育过程中视网膜上神经节细胞的数量呈显著下降趋势，其中39–50日龄幼鱼视网膜上神经节细胞的数量显著低于20–30日龄稚鱼(P < 0.01)，从16日龄仔鱼发育到30日龄稚鱼，视网膜上神经节细胞的数量相比较没有显著差异(P > 0.05)，34–50日龄幼鱼视网膜上神经节细胞的数量相比较没有显著差异(P > 0.05)。

从16日龄仔鱼发育到30日龄稚鱼，视网膜上外核层细胞核的数量显著增多(P < 0.01)，从30日龄稚鱼发育到50日龄幼鱼，视网膜上外核层细胞核的数量没有显著变化(P > 0.05)。

鱼苗发育过程中视网膜上ONN/CC值呈显著上升的趋势，其中16日龄仔鱼视网膜的ONN/CC值显著低于34日龄幼鱼(P < 0.01)，34–50日龄幼鱼视网膜的ONN/CC值相比较没有显著差异(P > 0.05)。

鱼苗发育过程中视网膜上ONN/GC值呈显著上升的趋势，其中16日龄仔鱼视网膜的ONN/GC值显著低于30日龄稚鱼(P < 0.01)，20–26日龄稚鱼视网膜的ONN/GC值显著低于39–50日龄幼鱼(P < 0.01)，50日龄幼鱼视网膜的ONN/GC值显著高于34–39日龄幼鱼(P < 0.01)。

5日龄仔鱼经自然光明适应后，黑色素屏蔽了视锥外段(图 1-7)，经暗适应后黑色素没有退回至色素层(图 1-8)，明暗适应下黑色素分布状态一致。34日龄幼鱼经自然光明适应后，黑色素完全覆盖视锥层(图 1-9)，经暗适应后黑色素基本退回至色素层(图 1-10)。

由表 3可知，5日龄仔鱼明暗适应后色素指数持平，16日龄仔鱼明暗适应后色素指数出现差异。从16日龄仔鱼发育到30日龄稚鱼，明暗适应后色素指数的差值显著升高(P < 0.01)，34–50日龄幼鱼明暗适应后色素指数的差值差异不显著(P > 0.05)。

表 3(Tab. 3)

表 3 不同发育阶段大菱鲆鱼苗明暗适应后视网膜色素指数的变化(平均数±标准差) Table 3 Variation of the pigment index (PI) of retinal of turbot fries after the light or dark adaption (Mean±SD) 日龄 Age (d) 明适应后色素指数 PI after light adaption (LPI) 暗适应后色素指数 PI after dark adaption (DPI) 明暗适应后色素 指数差值(LPI-DPI) 5 0.81±0.08ab 0.81±0.02e 0.00±0.07a 16 0.87±0.01bc 0.75±0.05de 0.13±0.05b 20 0.80±0.02a 0.63±0.07c 0.17±0.08b 26 0.87±0.04bc 0.66±0.06cd 0.22±0.05bc 30 0.91±0.01cd 0.60±0.05bc 0.32±0.05c 34 1.00±0.00e 0.50±0.04a 0.50±0.04d 43 0.96±0.04de 0.53±0.04ab 0.44±0.05d 50 0.98±0.02de 0.44±0.03a 0.54±0.03d P 0 0 0

表 3 不同发育阶段大菱鲆鱼苗明暗适应后视网膜色素指数的变化(平均数±标准差) Table 3 Variation of the pigment index (PI) of retinal of turbot fries after the light or dark adaption (Mean±SD)

硬骨鱼类视网膜具备脊椎动物视网膜的典型结构，从脉络膜至玻璃体方向可分为色素层、视锥视杆层、外界膜、外核层、外网状层、内核层、内网状层、神经节细胞层、神经纤维层和内界膜(张胜祥等, 2002)。在水温为(13.0±0.2)℃条件下，大菱鲆受精卵孵化至70 h时开始出现晶体(朱杰等, 2002)，本研究中初孵仔鱼视网膜已分化形成外核层、内核层和神经节细胞层，2日龄仔鱼视网膜上出现色素层和视锥细胞层，此时，仔鱼视网膜为纯视锥结构，该结构适应于仔鱼的首次摄食，为3日龄仔鱼开口摄食提供了视觉基础，这与达氏鲟(史玲玲等, 2013)、半滑舌鳎(马爱军等, 2007)、花鲈(Lateolabrax japonicus)(王小平等, 1999)等其他硬骨鱼类的研究结果相一致。

光感受系统发达的中上层鱼类，其内核层发育成4层水平细胞，且水平细胞、双极细胞和无长突细胞的分化非常明显(何大仁等, 1993)，而以鳜鱼(Siniperca chuatsi)为代表的夜间捕食的底栖伏击型凶猛鱼类，视网膜仅存在1层或2层水平细胞(梁旭方, 1994)。大菱鲆初孵仔鱼视网膜内核层有5–6层细胞，但双极细胞和无长突细胞间界限不明显。10日龄时，视网膜出现水平细胞，但数量稀少。34日龄时，水平细胞增至1–2层，表明此时视网膜光敏感性有所增强。随着鱼苗发育，内核层逐渐变薄，50日龄幼鱼视网膜内核层仅有1层水平细胞，表明大菱鲆是光感受系统不发达的鱼类。与半滑舌鳎相比较(马爱军等, 2007)，大菱鲆视网膜水平细胞、双极细胞与无长突细胞间界限更明显，分化更显著，表明大菱鲆视网膜的光敏性较半滑舌鳎强。

光线能引起鱼类视网膜发生运动反应和色素移动，强光下视网膜的视锥细胞向外界膜延伸，视杆细胞被色素细胞覆盖；弱光下视杆细胞移向外界膜，而视锥细胞末端的外节则靠近色素细胞。视网膜的这种色素移动是对光的视觉适应，保护了视杆细胞在强光时不会受到损伤，在弱光时暴露出来以增强感光能力(Neave, 1984)。Blaxter等(1970)研究发现，视杆细胞发育与视网膜产生色素移动同步发生。5日龄大菱鲆仔鱼经明暗适应后，视网膜上黑色素分布状态一致，表明此时视网膜没有运动反应。16日龄仔鱼视网膜经明暗适应后，色素指数出现显著差异，表明在临近变态时大菱鲆视网膜产生了明显的运动反应，视杆细胞开始发育。从16日龄仔鱼发育到30日龄稚鱼，明暗适应后视网膜色素指数的差值及ONN/CC值显著增大(P < 0.01)，表明从临近变态期至变态期结束时，视杆细胞的数量逐渐增多(魏开建等, 1996)。

ONN/GC值反映了视网膜网络结构的会聚程度，进而反映了鱼眼视敏度的高低及光敏性的强弱(梁旭方, 1994)。16日龄仔鱼ONN/GC值较低，表明此时视网膜网络会聚程度较低，视敏度较高，有利于准确辨认并摄取水中的食物。随着鱼苗发育，视网膜网络会聚程度逐渐升高，同时视锥细胞数量下降，视网膜视敏度降低，而视杆细胞的数量增加，增强了视网膜的光敏性，有助于大菱鲆视网膜逐步适应感受弱光的刺激，这与鱼苗变态后从浮游到底栖的生活习性相适应。

何大仁等(1993)比较研究了黄鳍鲷(Sparus latus)、鲻鱼(Mugil cephalus)、赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)、蓝圆鲹和金色小沙丁鱼(Sardinella aurita) 5种海水鱼的视网膜结构，发现具有高视敏度、高敏感性视网膜的鱼类对周围环境的光强变化有较强的适应性，活动范围大。视网膜为高视敏度、低敏感性的鱼类只能在光线充足的水层活动，而中下层鱼类的视网膜则属于低视敏度、高敏感性类型。本研究中，大菱鲆鱼苗在变态期前视网膜视敏度较高，光敏性低。鱼苗变态后视敏度降低，光敏感性增强，利于分辨弱光环境中的食物，因此，变态后的大菱鲆具有低视敏度、高敏感性的光感受系统。