梭鱼(Liza haematocheila)即鮻鱼，隶属于鲻形目、鲻科、梭属，分布于西北太平洋沿岸海域。梭鱼的基础生物学特征(李明德, 1992)、移殖驯养(李明德, 1993)、人工繁殖(陈惠彬, 1989)等取得了显著进展。目前，梭鱼已经从传统的咸水虾池套养，逐渐发展到与鲫、缢蛏和脊尾白虾无公害综合养殖(梅肖乐等, 2005)及淡水池塘主养(卓丽军等, 2011)和高位池零排放循环水养殖(郭益顿等, 2011)，梭鱼逐渐成为我国内陆湖泊、淡水池塘、沿海低盐度滩塘和海水池塘的重要养殖经济鱼类。

目前，我国梭鱼原种场(如天津原种场)主要利用采捕自然海域苗种培育亲鱼进行亲鱼供给、繁育苗种销售，以及考虑到渤海海域增殖放流等情况(姚欣华, 2012)，对我国沿海梭鱼野生群体及人工养殖群体进行遗传结构分析显得更为迫切。近年来，微卫星DNA(Microsatellite DNA)作为分子标记，具有高多态性、操作简单和重复性好等特点，广泛应用于动植物的群体遗传多样性分析(陆丽君等, 2013)、遗传图谱构建(罗云等, 2010)、种质资源鉴定(杜长斌等, 2000)及亲缘关系分析(李雪燕等, 2013)等。目前，仅限Xu等(2009)通过微卫星富集文库筛选10对多态微卫星引物，对山东海阳附近沿海梭鱼自然群体进行遗传多样性分析。本研究利用微卫星DNA多态性检测技术SSR (Simple Sequence Repeat)，对我国沿海梭鱼4个野生地理群体遗传多样性进行分析研究，旨在为我国梭鱼野生种质资源保护和遗传育种及增殖放流提供理论基础。

实验所用的梭鱼4个野生地理群体分别采捕于辽宁葫芦岛(2014年6月)、山东青岛(2013年10月)、江苏连云港(2014年5月)及浙江舟山(2013年11月)附近的海域，冰冻后冷藏带回实验室，各群体按照相似规格随机抽取30尾，体长为(16.54±1.35) cm，体重为(98.3±12.5) g，并用采捕海域就近的城市命名。剪取尾鳍用于基因组提取，−20℃保存。

称取各梭鱼群体低温保存尾鳍30 mg，采用柱式海洋生物DNA提取试剂盒提取DNA。将DNA样品用含有Dufinder的1%琼脂糖凝胶电泳检测，样品无大量蛋白质及降解的DNA片段。利用NanoDrop定量测定样品DNA浓度(A_{260 nm}/A_{280 nm}的值介于1.8−2.0)，并将其稀释至50 ng/μl，−20℃冷冻保存，作为模板用于SSR分析。

引物根据Gotoh等(2013)，选取具有多态性的引物，交由上海生工生物工程有限公司合成，经PCR扩增及电泳检测筛选出14对，其引物信息见表 1。

表 1(Tab. 1)

表 1 14对微卫星引物信息及在本实验中的退火温度 Table 1 Information and specific annealing temperatures of 14 pairs of microsatellite marker primers used in this study 位点 Locus 引物序列 Primer sequence(5'-3') 重复单位 Repeat motif 片段长度 Product size (bp) 退火温度 Annealing temperature(℃) Orla3-185 F: TCGCCATGTTAAATGTGCTC (CA)7 151 59 R: AACYGCMCACCAAAACAGGA Orla4-222 F: CTTGGTTCATTCCCACACAG (GT)5, (GT)6 123 58 R: GGAGCTGCTTCACACTGAG Orla9-38 F: ACAAACTTAATAGCCGGCAG (CA)10, (CTC)5 239 56 R: CACTGCTTCATTCCCAATCC Orla9-204 F: TATGCTGACCTGCTGTGACC (CA)5, (CA)10 269 59 R: CGCCAGATGTCGCAAATAC Orla10-175 F: ATTTGGGGAAYTCCAAAATTAG (CA)7 140 58 R: GACCTAAGGAGACAGAGTGTGAC Orla14-137 F: TGACACTTGTCAGCCCTCTG (CA)12 251 55 R: CTGGCAGCCATCTTTTACTC Orla15-84 F: CGCTTTAGCCACAGGCCAAC (GT)12 244 57 R: TTCAGAGGGCCAGTTAGCAC Orla15-260 F: TAAGCATGGCTTGGTGATCC (CA)7 230 55 R: AATTGCAAATGGTCCTCTCC Orla16-32 F: TAATTGCCTGGGCATGTGCC (GT)5 243 59 R: TAGCAAGGAGAGCCTGATGC Orla17-260 F: CATGCAGTGCAGATAGCRCC (CA)8 226 60 R: TTACCCACRGCAACCTCTCC Orla18-49 F: GCCTCCAGATGGTTTGTGAG (CA)10, (CA)8 180 57 R: GAGAGTCAGGTGTCAAGTTYACC Orla19-63 F: TTTAAAAGCAGCTCTGCGGGCAG (CA)7 167 59 R: GAGCTGTCGCCTCTTGTTAG Orla20-134 F: AATCCAAAACACCAGSCAAG (CA)8 223 55 R: TACAAGGTGGAGGTGGGTGAC Orla21-231 F: CCCGAGGGCCRTTGAAAG (CA)5TA(CA)10 208 61 R: CTGGCCTYTCCTCTTGGAC

表 1 14对微卫星引物信息及在本实验中的退火温度 Table 1 Information and specific annealing temperatures of 14 pairs of microsatellite marker primers used in this study

PCR为15 μl反应体系：Taq酶(5 U/μl) 0.2 μl，dNTP(0.2 mmol/L) 1.3 μl，Buffer(10×) 1.6 μl，Forward/Reverse Primer(10 μmol/L)各0.7 μl，Template DNA(50 ng/μl) 1.2 μl，dd H₂O(1 mg/ml) 9.3 μl。PCR反应程序：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，退火温度30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR扩增产物变性(95℃，5 min)后采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染，自然晾干拍照，用于检测。

根据电泳图谱，参照引物设计时片段大小统计条带，记录4个群体所有个体不同位点的基因型。利用Popgene 32 Version 1.32软件计算各位点的等位基因数、有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度，并计算各群体的Hardy-Weinberg平衡检验概率值、遗传固定指数、遗传分化系数、基因流、遗传相似性系数和遗传距离。根据Botstein等(1980)的方法，计算多态信息含量。用SPSS 13.0软件对各位点的期望杂合度(He)进行Kruskal-Wallis检验。根据Nei (1978)标准计算遗传距离，基于该遗传距离绘制UPGMA聚类图。

对所有合成的引物经过PCR扩增及电泳检测，共筛选出14个位点能够在梭鱼野生地理群体扩增出清晰的多态性条带，部分引物扩增条带结果见图 1。所有梭鱼群体全部14个位点多态信息见表 2。由表 2可知，14个位点共扩增出61个等位基因，每个位点等位基因数为2−8个，有效等位基因数为1.563−5.617个，在Orla21-231位点扩增出等位基因数和有效等位基因数最多，在Orla16-32位点扩增出等位基因数和有效等位基因数最少，所有位点平均等位基因数为4.357，平均有效等位基因数为3.172。每个位点观测杂合度为0.033−0.633，期望杂合度为0.360−0.822，二者的平均值分别为0.368和0.632。14个位点的多态信息含量(PIC)为0.306−0.798，平均值为0.575。由此可见，所有梭鱼群体的14个位点中有10个表现为高多态性(PIC＞0.5)，4个表现为中多态性(0.25＜PIC＜0.5)，这些位点具有丰富的多态性，能够用于梭鱼遗传多样性的分析。

图 1(Fig. 1)

图 1 引物Orla17-260在4个群体的扩增电泳 Figure 1 The electrophoresis of products amplified with Orla17-260

表 2(Tab. 2)

表 2 梭鱼14个微卫星位点的遗传多样性指数 Table 2 Genetic diversity parameters of 14 microsatellite loci of L. haematocheila 位点Locus A Ne Ho He PIC Fst Nm Orla3-185 3 1.886 0.442 0.472 0.419 0.014 17.745 Orla4-222 4 2.665 0.252 0.628 0.570 0.029 8.287 Orla9-38 5 3.508 0.633 0.718 0.661 0.086 2.663 Orla9-204 2 1.986 0.033 0.499 0.373 0.375 0.416 Orla10-175 5 3.125 0.267 0.683 0.627 0.189 1.074 Orla14-137 3 1.563 0.058 0.362 0.306 0.815 0.057 Orla15-84 4 3.549 0.59 0.721 0.664 0.105 2.128 Orla15-260 4 2.227 0.533 0.553 0.511 0.022 11.282 Orla16-32 2 1.684 0.017 0.408 0.324 0.849 0.044 Orla17-260 3 2.681 0.462 0.630 0.55 0.063 3.747 Orla18-49 7 5.239 0.567 0.813 0.781 0.070 3.313 Orla19-63 6 4.885 0.322 0.799 0.765 0.032 7.535 Orla20-134 5 3.792 0.392 0.739 0.691 0.019 12.871 Orla21-231 8 5.617 0.583 0.825 0.798 0.046 5.205 平均Mean 4.357 3.172 0.368 0.632 0.574 0.148 1.444

表 2 梭鱼14个微卫星位点的遗传多样性指数 Table 2 Genetic diversity parameters of 14 microsatellite loci of L. haematocheila

梭鱼4个不同地理群体的遗传多样性参数见表 3。由表 3可知，14个位点在所有群体的多态性百分率分别为92.86%、92.87%、100.00%和85.71%。各群体的等位基因数为3.786−4.000，有效等位基因数为2.673−2.899，观测杂合度为0.359−0.389，期望杂合度为0.503−0.561，多态信息含量为0.465−0.513，由此分析，梭鱼4个地理野生群体的遗传多样性比较丰富。同时，各群体期望杂合度表明，4个群体遗传多样性差异无统计学意义(P＞0.05)。另外，对所有群体个体的全部位点的等位基因型频率进行Hardy-Weinberg平衡检验，并进一步计算各位点遗传固定指数，其概率值(P)和遗传固定指数(Fis)的结果见表 4。由表 4可知，4个地理群体中大部分位点偏离Hardy-Weinberg平衡，如青岛群体有8个，葫芦岛群体和连云港群体分别有9个位点，而舟山群体除了两个位点为单态性外，其他位点均偏离Hardy-Weinberg平衡。对4个群体的各位点遗传固定指数(Fis)的研究发现，葫芦岛和舟山均有两个位点呈现杂合子过剩，其他两群体均有3个位点呈现杂合子过剩。

表 3(Tab. 3)

表 3 4个群体遗传多样性参数 Table 3 Genetic diversity parameters of the four populations 群体Population 多态性百分率 Polymorphic percentage (%) A Ne Ho He PIC 葫芦岛Huludao 92.86 3.929 2.673 0.364 0.532 0.487 青岛Qingdao 92.86 3.786 2.682 0.36 0.503 0.465 连云港Lianyungang 100.00 3.929 2.703 0.389 0.561 0.513 舟山Zhoushan 85.71 4.000 2.899 0.359 0.550 0.509

表 3 4个群体遗传多样性参数 Table 3 Genetic diversity parameters of the four populations

表 4(Tab. 4)

表 4 Hardy-Weinberg平衡检验概率值(P)与遗传固定指数(Fis) Table 4 P value of Chi-square test for Hardy-Weinberg equilibrium and Fis value of heterozygote deficiency or excess 位点Locus 葫芦岛Huludao 青岛Qingdao 连云港Lianyungang 舟山Zhoushan P Fis P Fis P Fis P Fis Orla3-185 0.747 −0.140 0.008** −0.030 0.116 0.218 0.004** 0.119 Orla4-222 0.002** 0.380 0** 0.748 0** 0.775 0 ** 0.403 Orla9-38 0.006** 0.215 0.229 0.128 0.164 −0.158 0.010 * −0.037 Orla9-204 0** 0.705 0** 1.000 0** 0.933 0** 1.000 Orla10-175 0** 0.839 0** 1.000 0.010** 0.146 0** 0.536 Orla14-137    — —    — — 0.023* 0.123    — — Orla15-84 0.775 0 0.001** 0.448 0.029* 0.083 0** −0.238 Orla15-260 0.795 −0.126 0.386 −0.315 0.810 −0.030 0** 0.516 Orla16-32 0** 1.000 1.000 −0.017 1.000 −0.017    — — Orla17-260 0.795 0.234 0.307 0.062 0.033* 0.204 0.002** 0.359 Orla18-49 0.004** 0.013 0** 0.137 0 ** 0.383 0.001** 0.462 Orla19-63 0** 0.487 0** 0.484 0** 0.865 0** 0.499 Orla20-134 0.015* 0.436 0** 0.550 0** 0.383 0.001** 0.462 Orla21-231 0** 0.431 0.178 0.194 0.767 0.009 0** 0.354 *表示P＜0.05，**表示P＜0.01；—表示单态性位点 * represents P＜0.05, ** represents P＜0.01; — represents monomorphism locus

表 4 Hardy-Weinberg平衡检验概率值(P)与遗传固定指数(Fis) Table 4 P value of Chi-square test for Hardy-Weinberg equilibrium and Fis value of heterozygote deficiency or excess

14个位点在4个地理群体间遗传分化指数(Fst)和基因流(Nm)如表 2所示，群体间各位点表现出不同程度的遗传分化，所有位点的平均遗传分化指数为0.148，平均基因流为1.444，说明各群体间存在中度遗传分化，存在一定程度的基因交流。

梭鱼的所有地理群体两两之间的遗传分化指数(Fst)和基因流(Nm)见表 5。由表 5可知，梭鱼两群体间的遗传分化系数为0.025−0.133，基因流为1.673−9.701，在葫芦岛和青岛群体间遗传分化指数最小，基因流出现最大值；连云港和舟山群体间遗传分化指数最大，基因流为最小值。

表 5(Tab. 5)

表 5 梭鱼群体间基因流Nm (对角线以上)和遗传分化系数Fst (对角线以下) Table 5 Gene flow estimates Nm (above diagonal) and F-statistics estimates Fst (below diagonal) among the four populations of L. haematocheila 群体 Population 葫芦岛 Huludao 青岛 Qingdao 连云港 Lianyungang 舟山 Zhoushan 葫芦岛 Huludao 9.701 2.440 3.046 青岛 Qingdao 0.025 2.173 1.673 连云港 Lianyungang 0.093 0.103 1.628 舟山 Zhoushan 0.076 0.130 0.133

表 5 梭鱼群体间基因流Nm (对角线以上)和遗传分化系数Fst (对角线以下) Table 5 Gene flow estimates Nm (above diagonal) and F-statistics estimates Fst (below diagonal) among the four populations of L. haematocheila

根据Nei (1978)的计算方法，计算梭鱼各地理群体间遗传相似性系数(I)和遗传距离(D) (表 6)。由表 6可知，两群体间的遗传相似性系数为0.623−0.818，遗传距离为0.202−0.473，青岛和葫芦岛群体的遗传相似性系数最高，连云港和舟山群体的遗传相似性系数最低。对遗传距离研究分析发现相同的结果，即青岛和葫芦岛群体的遗传距离最近，而连云港和舟山群体的遗传距离最远(图 2)。

表 6(Tab. 6)

表 6 梭鱼群体间遗传相似系数I(对角线以上)和遗传距离D(对角线以下) Table 6 Genetic identity I (above diagonal) and Nei's genetic distance D (below diagonal) among the four populations of L. haematocheila 群体 Population 葫芦岛 Huludao 青岛 Qingdao 连云港 Lianyungang 舟山 Zhoushan 葫芦岛 Huludao 0.818 0.761 0.815 青岛 Qingdao 0.202 0.747 0.675 连云港 Lianyungang 0.273 0.292 0.623 舟山 Zhoushan 0.205 0.393 0.473

表 6 梭鱼群体间遗传相似系数I(对角线以上)和遗传距离D(对角线以下) Table 6 Genetic identity I (above diagonal) and Nei's genetic distance D (below diagonal) among the four populations of L. haematocheila

图 1(Fig. 1)

图 2 基于Nei无偏遗传距离构建的4个梭鱼群体的UPGMA聚类 Figure 2 UPGMA dendrogram based on Nei unbiased genetic distances of the four populations of L. haematocheila

在对物种群体的遗传信息进行分析探讨时，采用不同的分子标记往往出现不同的遗传参数，如杨锐等(2002)和权洁霞等(2000)分别利用水平淀粉凝胶电泳技术和随机扩增多态DNA(RAPD)技术对采自河北黄骅的梭鱼自然群体和养殖群体进行遗传多样性分析，发现利用RAPD技术测得的自然群体和养殖群体的遗传多样性均高于水平淀粉凝胶电泳的结果。申雪艳等(2004)对从不同国家引进的3个大菱鲆(Scophthalmus maximus)地理群体进行研究发现，运用微卫星引物计算的遗传距离(0.068−0.120)高于RAPD引物计算的结果(0.012−0.019)。另外，England等(1996)研究表明，微卫星作为分子标记具有一定的优越性。因此，本研究选取14个微卫星标记位点对梭鱼4个地理野生群体进行遗传多样性分析。

本研究发现，14个微卫星位点在梭鱼野生群体中均能扩增出清晰的条带且具有多态性，这些位点具有丰富的多态性，能够用于群体遗传多样性的分析。

群体的遗传多样性是指群体全部遗传信息的总和，包括群体遗传变异程度和遗传结构，是群体适应环境变化、维持长期生存和进化的基础，也可以用来衡量群体适应环境变化能力的强弱(张文静等, 2003; O'Connell et al, 1997)。本研究发现，来自葫芦岛、青岛、连云港及舟山等的梭鱼地理群体的微卫星位点的等位基因数为3.786−4.000，有效等位基因数2.673−2.899，其微卫星位点等位基因数相对较少，恰好可以用来进行群体遗传学的研究(O'Reilly et al, 1995)。群体遗传杂合度即基因多样度，度量群体各位点的遗传变异的最适参数，梭鱼4个地理野生群体的观测杂合度为0.359−0.389，期望杂合度为0.503−0.561。比杨锐等(2002)和王茜等(2005)利用水平式淀粉凝胶电泳法及权洁霞等(2000)利用随机扩增多态DNA(RAPD)技术测定的梭鱼野生群体的杂合度要高，但各群体的观测杂合度和期望杂合度均低于Xu等(2009)的研究结果。

在本研究中，观测杂合度与期望杂合度差异较大，群体遗传处于不平衡状态，这与利用等位基因型频率进行Hardy-Weinberg平衡检验并计算各位点遗传固定指数的研究结果相符。4个地理群体中，大部分位点偏离Hardy-Weinberg平衡，且对4个群体的各位点遗传固定指数(Fis)的研究发现，葫芦岛和舟山群体均有两个位点呈现杂合子过剩，其他两群体均有3个位点呈现杂合子过剩。可能受到地理因素及洋流模式等外界环境影响，梭鱼幼体扩散能力与实验所捕捞的野生样本等因素有关。如Liu等(2007)利用梭鱼为广泛分布海洋性鱼类的特点，采用mtDNA控制区部分序列分析其系统地理格局，研究发现，梭鱼幼体分布在近海岸浅水区域，其扩散能力有限，各地理群体的单倍型由梭鱼在更新世冰期低于海平面时在西北太平洋3个边缘海中被隔离分化形成，而东海组群同时出现3个单倍型类群，由于在末次冰期过后东海架坡度较小，随海平面上升产生大量的沿岸浅海栖息地，导致梭鱼群体的重建。在陈澄璟(2012)利用梭鱼线粒体控制区片段序列和Cyt b全序列研究发现，梭鱼野生群体种内的遗传水平归为第二类遗传多样性水平模式，即较高的单倍型多样度和较低的核苷酸多样度(Grant et al, 1998)，Gao等(2014)对来自西北太平洋梭鱼5个地理群体的研究结果相同，提示梭鱼群体在经历过瓶颈效应或奠基者效应之后，从一个小的群体发生急剧的群体扩张事件，这与本研究中梭鱼出现微卫星位点偏离Hardy-Weinberg平衡及产生杂合子过剩现象相符合。

另外，从4个梭鱼野生群体的多态信息含量分析其遗传多样性比较丰富。同时，对各群体期望杂合度分析结果表明，4个群体遗传多样性差异无统计学意义(P＞0.05)。

群体间遗传分化系数(Fst)作为衡量群体间遗传分化程度的重要指标，常常与群体间基因流(Nm)共同阐述各群体间遗传分化的内在机制。在本研究中，梭鱼野生群体的14个位点平均遗传分化指数为0.148 (0.05＜Fst＜0.15)，表现为中等水平，平均基因流为1.444 (1＜Nm＜4)，群体间基因交流通畅，能够抵制遗传漂变作用，防止群体间遗传分化。对两群体间的遗传变异研究发现，梭鱼两群体间的遗传分化系数为0.025−0.133，基因流为1.673−9.701，在葫芦岛和青岛群体间遗传分化指数最小，基因流出现最大值，而连云港和舟山群体遗传分化指数最大，基因流为最小值，这可能与梭鱼幼体的扩散能力及近海沿岸生态环境及群落结构有关(朱鑫华等, 2001)。

遗传距离是研究物种遗传多样性的基础，Crawford等(1998)指出，由微卫星得出的遗传距离更能反映分化时间的长短，能客观反映品种间的遗传变异和分化。本研究利用14个微卫星位点进行不同地理野生群体的遗传多样性分析，根据Nei (1978)的计算方法计算了各地理群体间遗传相似性系数(I)和遗传距离(D)。研究结果显示，梭鱼4个野生地理群体依据地理位置由北向南依次聚在一起。

本研究的多项遗传多样性参数表明，我国沿海梭鱼不同地理野生群体遗传多样性处于中等偏上的水平，同时，存在微卫星位点偏离Hardy-Weinberg平衡及产生杂合子过剩现象。再结合其他学者对梭鱼自然与养殖群体的研究结果，对梭鱼种质资源保护及开发利用提出几点建议：1)梭鱼野生群体虽具有丰富的遗传多样性，但应该进行海岸工程来加强梭鱼产卵场及保育场的保护，维持天然的种群结构；2)由于梭鱼野生群体存在偏离Hardy-Weinberg平衡及产生杂合子过剩现象，故在对沿岸海域进行人工苗种的增殖放流时，要注意其遗传结构，避免人为因素加快梭鱼天然种质资源的衰竭；3)在对梭鱼繁养殖时，可以通过采捕不同海域的苗种培育亲鱼，分析其遗传信息，利用不同群体间的交配提高梭鱼的养殖效益。