细胞色素CYP450 (Cytochrome CYP450, CYP450)酶系是一类亚铁血红素蛋白的超家族酶系，广泛存在于几乎所有生物体中，参与多种内源物质(保幼激素及其类似物、蜕皮甾酮、脂肪酸和信息素等)和外源物质(药物、环境毒物等)在生物体内的代谢(Danielson, 2002; Matthias et al, 2008; 刘晨晖等, 2010)。在CYP450众多的家族成员中，以CYP1−CYP4家族与药物代谢最为相关，其中，CYP1、CYP2和CYP3酶家族承担着人体2/3药物的代谢(Guengerich, 2007; 樊慧蓉等, 2006)。目前，在甲壳动物中已被证实存在的CYP450基因只有CYP2和CYP4家族基因(冯艳艳等, 2014)。CYP2家族是目前已知的CYP450家族基因中数量最大、种类最多、物种之间同源性最低的家族，参与多种低分子化合物及药物在生物体内的代谢(周园等, 2002)，其活性高低决定了药物的代谢速率，直接影响药物的清除率(李国昌等, 2004)，从而影响治疗效果和毒性效应。同时，药物、环境污染物等诸多外界因素可诱导或抑制CYP450的活性，从而影响药物的相互作用，导致药物不良反应。研究药物与生物体药物代谢酶的相互作用，有助于阐明水产动物体内药物代谢的规律和机制(马玉忠等, 2008)，对于保证水产养殖中安全合理用药、避免药物不良反应、保障水产品安全都具有重要价值。目前，海洋甲壳类有关药物与CYP450基因表达及其酶活性的研究十分有限，仅见中国对虾(李小彦等, 2010; 张喆等, 2012)和三疣梭子蟹(冯艳艳等, 2014)，凡纳滨对虾有关CYP2基因的研究尚属空白。

恩诺沙星(Enrofloxacin, EF)为人工合成的第三代喹诺酮类广谱抗菌药，对多种水产动物致病菌具有较强的抑制效果，广泛用于水产动物病害防治。鉴于此，本实验选取恩诺沙星作为外源物质，研究其对凡纳滨对虾肝胰腺CYP2基因表达与其标志酶氨基比林-N-脱甲基酶(APND)活性的影响，为进一步了解甲壳类动物CYP450基因的功能和作用机制，探讨CYP450与药物之间的相互作用奠定基础，为药物在水产养殖上中的合理使用及联用提供一定的理论基础。

健康凡纳滨对虾平均体重为(10.5±1.2) g，购自山东省潍坊市昌邑下营海丰水产养殖有限公司。实验前暂养7 d，充气，流水，水温为(26±1)℃，盐度为(25±1)，pH为(8.0±0.4)，每日投喂不含药物的配合饲料，投喂量为凡纳滨对虾体重的2%。

恩诺沙星原粉，纯度≥98.5%，购于武汉刚正生物科技有限公司；TaKaRa Taq^TM、PrimerScript^® RT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)和TaKaRa SYBR^® Premix Ex Taq^TMⅡ(Tli RNaseH Plus)均购自TaKaRa公司；氨基比林和1-苯基-2-硫脲(PTU, 98%)、还原型辅酶(NADPHNa₄) (含量≥99.9%)、乙二胺四乙酸二钠(EDTANa₂)、α-苯甲磺酰氟(PMSF)及1, 4-二硫苏糖醇(DTT) (99.5%)购自Sigma公司；Trizol Reagent购自美国Invitrogen公司；二乙基焦碳酸酯(DEPC)处理水购自Solarbio公司；考马斯亮蓝试剂盒购自南京建成生物技术公司；其他试剂均为国产分析纯。

日立CF16RX落地高速冷冻离心机，超微量紫外可见分光光度计，NanoDrop ND-2000C(基因有限公司)，电泳仪(Bio-Rad)，凝胶成像仪(Kodak Gel Logic 212 Imaging System)，多功能样品匀质器(Precellys 24 Dual)，酶标仪(Tecan)，Applied Biosystems 7500 Real-Time荧光定量PCR仪。

根据《新编渔药手册》(杨先乐, 2005)的推荐剂量，设计恩诺沙星低、中、高3个剂量梯度：高剂量组(60 mg/kg，HD)、中剂量组(30 mg/kg，MD)和低剂量组(15 mg/kg，LD)，另设1个对照组(CK)。按照凡纳滨对虾每天每千克体重摄食20 g饲料计算，分别拌制不同剂量恩诺沙星药饵。实验用400尾凡纳滨对虾，平均饲养于1–8号养殖池，1、2号养殖池设为对照组，3、4号为高剂量组，5、6号为中剂量组，7、8号为低剂量组，暂养7 d。实验前随机取10尾凡纳滨对虾，取肝胰腺、肠、胃、肌肉等组织进行药物残留检测，确保无恩诺沙星、环丙沙星残留。实验组分别投喂不同剂量恩诺沙星药饵，对照组投喂等量基础饲料，每天早、午、晚各投喂1次，连续投喂7 d。

分别于最后一次投喂后的1、3、6、9、12、24、48、96 h取样，每个时间点随机取凡纳滨对虾6尾，迅速取肝胰腺组织于液氮中保存备用。

另取10尾健康对照组凡纳滨对虾，抽取0.3 ml血淋巴置于预先装有等体积抗凝剂的离心管中，于5000 r/min转速下离心5 min，弃上清液，保留血细胞，加入Trizol保存备用，同时，取肝胰腺、鳃、肌肉、甲壳、肠、胃、心脏和眼柄液氮保存，用于RNA提取，检测凡纳滨对虾CYP2基因在不同组织中的表达水平。

取健康凡纳滨对虾各组织(血细胞除外)于液氮中研磨，Trizol法提取总RNA，按照Invitrogen说明书进行；用超微量紫外可见分光光度计(NanoDrop ND-2000C)检测总RNA的纯度和浓度；用1.0%的MOPS琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量及完整性。然后用PrimerScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒去除基因组DNA后合成第一链cDNA。产物于−40℃冰箱中保存备用。

通过凡纳滨对虾转录组(编号：SRR346404)得到CYP2基因部分序列，设计特异性引物用于RT-PCR定量分析，选取β-actin为内参基因(表 1)。将各组凡纳滨对虾肝胰腺的cDNA用DEPC处理水稀释至200 ng/μl，分别加入SYBR Premix Ex Taq^TM Ⅱ (2×) 10 μl，PCR正反引物(10 μmol/L)各0.8 μl，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μl，cDNA稀释模板2 μl，灭菌水6 μl，配制成20 μl体系反应液。荧光定量PCR反应条件为: 95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，40个循环。不同时间点同一样品的目的基因和内参基因均在同一个96孔板上进行，每个样品设3个平行。

表 1(Tab. 1)

表 1 凡纳滨对虾CYP2基因表达量分析所用引物 Table 1 Primers used in the analysis of CYP2 gene mRNA expression in Litopenaeus vannamei 引物Primer 引物序列Primer sequence(5′-3′) CYP2-F GCAGTTTGCACAGACGTGTT CYP2-R CCATGCTGGGAAAACGATTA β-actin-F TGGACTTCGAGCAGGAGATG β-actin-R GGAATGAGGGCTGGAACAGG

表 1 凡纳滨对虾CYP2基因表达量分析所用引物 Table 1 Primers used in the analysis of CYP2 gene mRNA expression in Litopenaeus vannamei

肝胰腺S9的制备参照张喆等(2012)的方法进行。APND活性的测定参照Schenkman等(1967)改进的方法进行。使用考马斯亮蓝蛋白定量测试盒(南京建成生物研究所)完成组织蛋白含量的测定。

采用2^−ΔΔCt法分析荧光定量数据，用SPSS 17.0软件对实验结果进行单因素方差分析(当P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著)。

利用RT-PCR检测CYP2基因在凡纳滨对虾组织中的转录表达情况。结果显示，CYP2基因在肝胰腺、甲壳、肠、鳃、血淋巴、肌肉、胃、心脏和眼柄中均有表达。以血淋巴中基因表达量为参照，CYP2在肝胰腺中表达量最高，其次是胃，在血淋巴中表达最低(图 1)。

图 1(Fig. 1)

图 1 凡纳滨对虾CYP2基因在组织中的表达量 Figure 1 Levels of CYP2 transcript in different tissues of L. vannamei

利用RT-PCR检测凡纳滨对虾在投喂不同剂量的恩诺沙星后肝胰腺中CYP2基因表达量的变化情况(图 2)。结果显示，连续投喂恩诺沙星7 d后，除1 h、24 h和96 h外，实验组较对照组表达量均显著下调(P < 0.05)，各剂量组在取样时间9 h表达量下调幅度最大且极显著低于对照组(P < 0.01)；高剂量组除96 h外，其他取样点的表达量均极显著低于对照组(P < 0.01)。对于同一测定时间，恩诺沙星对CYP2基因的抑制作用基本呈现剂量效应，即高剂量组 > 中剂量组 > 低剂量组。

图 1(Fig. 1)

图 2 不同浓度恩诺沙星对凡纳滨对虾肝胰腺CYP2基因表达的影响 Figure 2 The expression of CYP2 gene in L. vannamei hepatopancreas after enrofloxacin administration * P < 0.05;** P < 0.01

由图 3可知，3个剂量恩诺沙星对凡纳滨对虾肝胰腺APND活性呈现明显的抑制作用，在取样时间12 h，各剂量组APND活性均达到最低值且极显著低于对照组(P < 0.01)。9 h后，低剂量组和中剂量组酶活性均显著低于对照组(P < 0.05)，高剂量组除3 h外，其余各时间点酶活性均极显著低于对照组(P < 0.01)。对于同一时间点，恩诺沙星对APND活性的抑制作用基本呈现剂量效应，即高剂量组 > 中剂量组 > 低剂量组。

图 1(Fig. 1)

图 3 不同浓度恩诺沙星对凡纳滨对虾肝胰腺APND活性的影响 Figure 3 The APND activity in L. vannamei hepatopancreas after enrofloxacin administration * P < 0.05;** P < 0.01

细胞色素CYP450是一个庞大的基因超家族，在生物体中广泛分布且功能多样，能够催化多种外源性化学物质以及内源化合物的氧化反应，负责超过80%药物的代谢。CYP2是CYP450超家族中一类重要的药物代谢酶，在海洋无脊椎动物中的研究主要集中在基因克隆与功能分析方面。本研究首次从凡纳滨对虾转录组获得CYP2基因片段，并通过RT-PCR方法研究其组织表达分布情况。结果显示，CYP2基因在凡纳滨对虾体内呈组成型分布，在肝胰腺中的表达量显著高于其他组织。Gonzalez (1993)研究发现，CYP2A1只在哺乳动物的肝脏中表达；Brown等(1998)研究了CYP450在鱼体各组织中的表达情况，发现CYP450在脾和肾中表达水平较高；朱磊等(2011)研究发现，CYP3A在异育银鲫肝和肠组织中转录水平最高。Matsuo等(2008)等对银大马哈鱼(Oncorhynchus kisutch) CYP1A、CYP2K1、CYP2M1和CYP3A27的表达进行了研究，发现CYP1A、CYP2M1和CYP3A27在各组织中均有表达，而CYP2K1只在肝脏和嗅觉器官中表达。由以上研究可见，CYP基因在不同种属生物体内的表达具有组织选择性，肝脏作为药物代谢的重要器官，其表达优势均强于其他器官，这种表达优势是由不同器官的特异性功能决定的。

甲壳动物由于生活环境的特殊性会接触到许多外来物质，生物体对外来物质的清除主要通过肝脏系统CYP450基因表达进行，这些基因的酶产物催化外来物质极性化，使之更易排出体外(范岚等, 2009)。同时，CYP450的转录表达容易受到外源物质的影响，外源物质可以诱导或者抑制CYP450，从而影响治疗效果或产生毒副作用。刘树民等(2006)发现，黄药子可诱导大鼠肝脏中CYP2E1基因的表达，黄药子和当归配伍后，CYP2E1基因的表达下降。冯艳艳等(2014)研究发现，磺胺嘧啶对三疣梭子蟹CYP2 mRNA的表达有显著诱导作用，且给药剂量越大，基因上调水平越高。本实验研究了不同恩诺沙星剂量及作用时间对CYP2表达的调控，发现该药物可显著抑制凡纳滨对虾体内CYP2 mRNA的表达，呈现出一定的剂量效应和时间效应，这可能与给药次数多、时间长而导致药物在凡纳滨对虾体内的残留时间较长有关。恩诺沙星进入生物体后不断被P450酶代谢生成环丙沙星，环丙沙星也进行自身的代谢，使药物在机体内不断积累。给药浓度越高，药物在组织中的积累量越多，对CYP2的抑制作用越明显。随着给药时间的推移，恩诺沙星及其代谢产物不断被药物代谢及转运链中的Ⅲ相药物流出泵排出体外，组织中药物浓度降低，导致CYP2 mRNA表达量慢慢升高至对照组水平。

在甲壳动物中，APND主要反映CYP2家族同工酶的活性(冷欣夫等, 2001)。很多研究表明，药物剂量能够显著影响药物对酶活性的影响。草鱼(Ctenopharyngodon idellus)连续注射剂量为50 mg/kg和80 mg/kg的利福平3 d后，肝微粒体APND活性被诱导，且随着药物浓度的升高呈现先升高后降低的趋势(Li et al, 2008)。韩华等(2010)研究发现，黄岑苷对牙鲆CYP1A的诱导作用呈现出明显的剂量-效应关系，药物剂量越高，诱导作用越大。本实验在研究恩诺沙星对凡纳滨对虾APND活性影响时也发现了这种剂量影响效应的现象，凡纳滨对虾连续用药7 d后，恩诺沙星对其抑制作用由高到低依次为：高剂量组、中剂量组、低剂量组。在取样初期，实验组APND活性即被抑制，3 h略有上升，这可能是机体在受到外来物质刺激后所表现出的一种自我保护，以此缓解抑制效应对生物体机能产生的影响。随着时间的延长，药物在机体组织中的浓度不断升高，APND活性的下降幅度更大，在12 h各剂量组活性达到最低值且极显著低于对照组(P < 0.01)，24 h后APND活性逐渐升高。这与前述的CYP2基因表达量随剂量和作用时间的变化趋势基本一致。区别在于，CYP2基因表达量在9 h达到最低值，96 h与对照组无差异；而APND活性在12 h达到最低值，96 h仍显著低于对照组(P < 0.05)。这可能是由于药物进入机体后首先刺激基因的转录过程，进而影响蛋白质的翻译，最终使酶的蛋白含量和活性降低，所以，恩诺沙星对CYP2基因的抑制效应在时间上早于对酶活性的抑制效应。这与漏芦(Rhaponticum uniflorum)抑制大鼠CYP1A1活性的机制类似(吴宁等, 2007)。

恩诺沙星作为第三代喹诺酮类药物，以其卓越的疗效在水产养殖中得到广泛使用。近年来，由于临床上与喹诺酮类药物联合用药的增多，有关药物相互作用也随之出现，酶抑制引起的药物相互作用约占全部相互作用的70%。药物在体内主要靠P450酶进行代谢，研究表明，喹诺酮类药物对大鼠各组织中的CYP2C活性存在不同程度的抑制作用(姚欣等, 2006)；张喆等(2012)研究发现，诺氟沙星对中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)肝胰腺、鳃及血清中的APND、ECOD酶均有显著抑制作用，与本研究结果一致。但也有文献报道，氟甲喹对虹鳟(Oncorhynchus mykiss)和异育银鲫(Carassius gibelio) EROD活性具有诱导作用(Mouto et al, 1998; 胡晓等, 2011)，虽然同为喹诺酮类药物，但该研究结果与本研究结果并不相同，这可能与药物的分子结构及靶向动物不同有关。有关喹诺酮类药物抑制P450酶的机制，目前尚不清楚。Fuhr等(1993)认为，喹诺酮类药物分子中8位上没有取代基(即萘啶环或奎啉环C8与一个氢相连)或者7位哌嗪基3′和4′无甲基等取代基，则其抑制作用强，这解释了为什么环丙沙星对CYP450有较强的抑制作用。对于恩诺沙星而言，虽然其哌嗪环上7位哌嗪基的4′位有1个乙基取代基，但由于其在生物体内部分被P450酶代谢脱去乙基生成环丙沙星，因此，恩诺沙星仍表现出较强的抑制CYP450的能力。

本研究结果显示，恩诺沙星对凡纳滨对虾CYP2 mRNA表达及APND活性呈现显著抑制作用，且具有一定的时间和剂量效应，提示恩诺沙星可能会导致一些经CYP2代谢的药物生物利用度增加，从而有可能引起药物间的相互作用。此外，恩诺沙星在凡纳滨对虾体内的代谢和残留规律表明，其在凡纳滨对虾体内的半衰期长，消除缓慢(赵海军等, 2010)，在药物联用中可能会导致药物相互作用更为严重。因此，在养殖实践中，当恩诺沙星与其他药物合并用药时，应充分考虑恩诺沙星对CYP2的抑制作用，而导致经其代谢的药物在对虾体内的蓄积和毒性增强。