褐藻胶(Algin)是从褐藻门藻类的细胞壁中提取的(陈利梅等，2010)、由甘露糖醛酸(Mannuronicacid，M)和古罗糖醛酸(Guluronic acid，G)以C_1-4键混合连接起来的直链高分子水溶性多糖，两种糖醛酸的含量和结合方式因海藻的种类、生态环境和季节的不同而不同，直接影响着褐藻胶的凝胶强度和对金属离子的选择性，从而影响褐藻胶的理化性质及其应用(纪明候，1997)。作为一种安全的功能高分子，褐藻胶广泛应用于食品、化工及药物开发等领域，不同领域对褐藻胶中M和G的含量要求不同(吴建东等，2011)。

关于褐藻胶M/G值的测定方法主要有化学法、液相色谱法及气相色谱法。化学法操作繁琐费时，不适应大批量样品检测的需求(郑瑞津等，2003)；高效液相色谱法及气相色谱法操作较为简便，但高效液相法采用的Waters 5-SAX阴离子交换柱(郑瑞津等，2003; Gacesa et al，1993)分离褐藻胶M和G的效果不佳。采用PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)柱前衍生高效液相色谱法，褐藻胶M和G分离效果好，灵敏度高，受干扰峰影响小，适合快速、有效、批量样品的褐藻胶M/G值的测定(吴健等，2013)。

本研究利用PMP柱前衍生高效液相色谱法，针对5种褐藻(多肋藻、海带、裙带菜、海蒿子和萱藻)的M/G值、海带不同品种(系)M/G值进行比较，研究了海带生长期M/G值的变化规律，旨在为生产及研究提供参考依据。

收获期褐藻采集：多肋藻、“东方6号”海带、海蒿子、萱藻分别于2014年4月、6月、5月、5月采集于山东荣成宁津附近海域；裙带菜于2014年4月采集于山东荣成朱口院夼附近海域。

海带在生长期M/G值的变化：“爱伦湾”海带于2014年2-6月采集于山东荣成宁津附近海域。

同一时期海带不同品种(系)间M/G值的比较：“东方5号”、“东方6号”、“爱伦湾”、“黄官1号”海带均于2013年5月采集于山东荣成宁津附近海域 。

β-D-甘露糖醛酸和α-L-古罗糖醛酸标准品(含量≥98%)，青岛博智汇力生物科技公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP，≥98%)，Alfa Aesar公司；乙腈为色谱纯，国药集团；其他试剂均为分析纯，国药集团。Agilent 1260型高效液相色谱仪及Zorbax SB-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，美国Agilent公司。

称取适量褐藻干粉，加入30倍体积的0.5% NaCO₃(m/v)溶液，55℃水浴1.5 h；筛绢过滤藻渣，将滤液离心，取上清液。在上清液中加入适量盐酸，边加边搅拌，此时溶液中有褐藻酸产生，静置10 min，离心取沉淀。转移沉淀，加入95%乙醇，用40% NaOH调节溶液pH至8.0，静置40 min，离心取沉淀，得褐藻酸钠，40℃烘干至恒重。

称取50 mg褐藻酸钠干品于试管中，加入0.5 ml的80% H₂SO₄，室温酸解18 h。用水稀释H₂SO₄浓度至2 mol/L，沸水浴5 h，冷却至室温。用CaCO₃中和pH至7.0，离心取上清液，滤纸过滤，收集滤液，得到褐藻胶M和G单糖溶液。

称取M、G单糖标准品，用蒸馏水配制成2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mg/ml系列浓度。取200 μl标准品溶液，加入200 μl 0.3 mol/L的NaOH，混合均匀后，加入240 μl 0.5 mol/L PMP试剂，涡旋混匀，于70℃水浴加热1 h，取出冷却至室温，加入200 μl 0.3 mol/L HCl中和，氯仿萃取3次，取水相过0.22 μm滤膜，待上机。褐藻胶单糖裂解液柱前衍生步骤同上。

Zorbax SB-C18色谱柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm)，流动相为磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH= 7.0)/CH₃CN(83/17，体积分数)，流速为0.8 ml/min，柱温为30℃，进样体积为20 μl，检测器为VWD，检测波长为245 nm。

称取M和G标准品各250 mg(称量值)，分别进行酸解、衍生及液相分析。根据M、G线性回归方程计算酸解后M和G的质量(测定值)，M和G的回收率即为质量测定值与称量值之比，M/G回收系数为M回收率与G回收率的比值。

以浓度x(mg/ml)、峰面积y(×10⁴)进行回归计算，分别得到M和G的线性回归方程，M：y=1.497x- 0.012(R²=0.9998)；G：y=1.381x-0.017(R²=0.9991)。

糖醛酸在强酸作用下会受到一定程度的破坏，且不同糖醛酸破坏程度不同，因此，确定甘露糖醛酸和古罗糖醛酸强酸作用下的回收率对于测定M/G值至关重要。表 1为M和G标准品在酸解后的回收率，M、G酸解后回收率不同，G破坏程度明显大于M，在计算褐藻中褐藻胶M/G值时需要乘以校正系数1/1.86，即0.54进行校正。

表 1(Tab. 1)

表 1 糖醛酸酸解后的回收率 Table 1 The recovery rate of M and G after acidolysis 次数 No. 糖醛酸 Alduronic acid 酸解前质量Weight before acidolysis(mg) 酸解后质量Weight after acidolysis(mg) 回收率Recovery rate(%) 回收 系数 M/G 平均 值 Avg Ⅰ M 2.5000 2.0054 80.22 1.87 1.86 Ⅰ G 2.6000 1.1173 42.97 Ⅱ M 2.6000 2.2462 86.39 1.85 Ⅱ G 2.3000 1.0751 46.74

表 1 糖醛酸酸解后的回收率 Table 1 The recovery rate of M and G after acidolysis

图 3为褐藻胶裂解液的液相色谱图，根据M单糖标准品(图 1)和G单糖标准品(图 2)确定9.215 min为G，10.089 min为M。M和G分离度较好，除5 min之前的试剂峰外，其他干扰峰较小，由此可推断，褐藻胶酸解较彻底，不存在未解聚的多聚体形态。

图 1(Fig. 1)

图 1 甘露糖醛酸标准品的液相色谱 Figure 1 The standard liquid chromatogram of Mannuronic acid

图 1(Fig. 1)

图 2 古罗糖醛酸标准品的液相色谱 Figure 2 The standard liquid chromatogram of Guluronic acid

图 1(Fig. 1)

图 3 褐藻胶裂解液的液相色谱 Figure 3 The liquid chromatogram of the degraded algin

沸水浴加热时间对于多聚嵌段结构的水解起到关键作用，实验探索了沸水浴加热的最佳水解时间为5 h。PMP柱前衍生高效液相色谱法作为一种准确有效的测定褐藻胶M/G值的方法，也可适用于其他褐藻胶类药物制品M/G值的测定(吴健等，2013)。

由图 4可知，收获期5种褐藻M/G值由大到小依次为多肋藻、海带、裙带菜、海蒿子、萱藻，最大值为2.22，最低值为0.60，多肋藻约为萱藻的4倍。M/G值的差异反映了不同来源褐藻胶凝胶特性的不同，M/G值高，其凝胶强度低，持水性好，弹性好，因而多肋藻、海带较适用于对弹性要求高、持水性要求好的工业领域以及要求高M含量的医药、食品等领域，例如食品涂膜、增稠剂、医药材料等(朱思明等，2003; Clark，1996; Fujihara et al，1992)。萱藻褐藻胶的G含量较高，凝胶强度大，硬度大，质地脆，持水性差，该特点不仅适用于去除有毒金属离子，而且在含钙食品中可作为胶凝剂、添加剂(朱思明等，2003; 刘树兴等，2001; Sellimi et al，2015)，另外，此类褐藻胶在纺织、橡胶等领域得到广泛应用(黄来英等，2000; 金骏等，1993; 隋战鹰，1993)。

图 1(Fig. 1)

图 4 不同褐藻种间M/G值 Figure 4 M/G ratios of different brown algae species

在生产领域，除了根据褐藻胶的特性进行原材料的选择，还应考虑原材料褐藻胶产量的高低。本研究中，多肋藻的褐藻胶含量为27.87%，海带为22.11%。多肋藻能较大程度满足对M/G值要求较高的工业领域，养殖量大、产量高的海带在此领域也颇受欢迎。

同一生长期海带品种(系)间M/G值相差不大，接近2.0(图 5)，M含量基本维持在15%左右，G含量基本维持在8%左右，褐藻胶特性颇为相似。海带M/G值存在一定差异，原因可能为气候、水温等自然条件对海带的生长带来一定影响，造成测定值的偏差。

图 1(Fig. 1)

图 5 海带不同品种(系)间M/G值以及M、G含量 Figure 5 M/G ratios and the contents of M and G in different varieties(lines)of S. japonica

为了探究海带在生长期的M/G值以及M、G含量的变化，选择2月薄嫩期至6月成熟期海带，测定M/G值以及M、G含量变化情况(图 6)。结果显示，海带在生长过程中，M/G值呈下降趋势，M含量呈下降趋势，G含量呈上升趋势，即海带在成熟期的

图 1(Fig. 1)

图 6 海带生长期M/G值的变化情况 Figure 6 The change of M/G of S. japonica during the growth period

M/G值最低。由此可以推断，海带褐藻胶在生物合成过程中是由D-甘露糖醛酸逐渐转变成L-古罗糖醛酸，此结论与纪明候(1997)所阐述的观点相吻合。海带在4月M/G值出现短暂的上升，M含量上升，G含量下降，原因可能为海带在此生长阶段由M转化为G的速率相比于海带的生长速率有所下降。

本研究比较了5种褐藻(多肋藻、海带、裙带菜、海蒿子和萱藻)种间M/G值的大小，多肋藻和海带凝胶特性较为接近，其凝胶强度小，持水性好，而萱藻凝胶特性则相反；同一时期不同海带品种(系)间M/G值差异不明显，因而褐藻胶特性相差不大。海带在整个生长期的M/G值呈下降趋势，在收获期达到最低。

以上研究结果可为褐藻胶性能选择提供参考依据。