臭氧(O₃)作为强氧化剂，具有去除水产养殖系统中固体杂质、脱色除臭、氧化氨氮、降解有机物、杀菌消毒和保持养殖水质稳定的作用(Paller et al，1988; Reid et al，1994; Liltved et al，1995; Rueter et al，1995)。随着工厂化水产高效养殖模式在我国的蓬勃发展，臭氧的杀菌、消毒和净化水质等功能在工厂化封闭循环水养殖系统(Recirculating Aquaculture Systems，RAS)中得到了广泛应用。目前，国内外研究已经证明，在RAS水处理系统中，臭氧能够快速有效地杀死水体中的有害微生物，有效改善养殖水质，提高系统整体性能，确保鱼类健康生长(Davidson et al，2011)；对于养殖水体的处理，臭氧浓度为0.1-0.2 mg/L，处理时间10-30 min就可以达到很好效果(Bullock et al，1997; Summerfelt，2003; Ghomi et al，2007)；在臭氧对养殖鱼类的影响方面，由于水体中臭氧浓度过高会对养殖鱼类产生毒害作用，其对一般鱼类的安全浓度为0.008-0.060 mg/L，在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)封闭循环水养殖系统中，臭氧投加量控制在氧化还原电位(Oxidation-Reduction Potential，ORP)在350 mV以内，可达到安全高效的处理效果(周游等，2012)。

在工厂化循环水养殖系统中，利用生物膜进行水质净化是养殖水处理的核心技术，其净化效能决定了养殖水环境的稳定以及养殖生产的高效和安全。但是，臭氧对生物滤池中生物膜的影响却鲜有报道。当臭氧浓度超过一定值时，不仅会对养殖鱼类产生毒害，对生物滤池中的生物膜也将带来影响和损伤。一旦生物膜被破坏，循环水养殖系统将面临崩溃的危险。可见合理控制臭氧添加浓度是必要的(戚翠战等，2014)。因此，深入研究臭氧在养殖水处理技术中的应用，对改善养殖水质、减少病害、提高养殖密度、增加产量、保障安全生产及促进工业化养殖的快速发展具有深远意义。本研究利用珍珠龙胆石斑鱼养殖生产系统中挂有生物膜的滤料和养殖废水，模拟工厂化循环水养殖系统，通过添加不同臭氧量，研究了臭氧对生物膜活性和水处理效率的影响，以期获得RAS中安全高效的臭氧添加剂量，为实际生产应用提供理论参考。

本试验在山东莱州明波水产有限公司试验车间进行。试验时间为2013年11月12日-12月23日，为期41 d。试验系统模拟工厂化循环水系统，配置有养殖废水蓄水池、生物试验滤池、生产系统中挂有生物膜的滤料以及臭氧发生器。养殖废水蓄水池采用玻璃钢圆形池，容量为1000 L；试验用水取自珍珠龙胆石斑鱼循环水养殖废水；物理过滤采用合成纤维过滤棉；生物试验滤池采用圆形玻璃钢养殖池，直径为30 cm，深为50 cm，水深为15 cm，容量约为10 L，池底呈锥形，在池底使用气石曝气；生物滤料来自于循环水养殖系统中生物滤池内取出的已挂膜的弹性滤料。根据养殖车间内日循环次数20次，确定由废水池流向试验池的流量；根据生物滤池内滤料量与生物滤池体积比确定试验池内所放滤料量，流程见图 1。

图 1(Fig. 1)

图 1 试验系统工艺流程 Figure 1 Scheme of water treatment in the experimental system

试验中臭氧添加6个浓度，ORP值分别为300、350、400、450、500和550 mV；每个浓度臭氧连续对生物试验滤池及滤料添加处理7 d，检测生物试验滤池中挂膜滤料对养殖废水处理效能的变化以及生物膜菌群存活率。试验分为A和B两个组。A组为试验组，由臭氧发生器向养殖废水池中通入臭氧，保持水中氧化还原电位稳定，经物理过滤后，流入生物滤池。连续进行7 d的臭氧注入试验，设计氧化还原电位初始为300 mV，臭氧注入试验开 始后，在1 h、2 h、4 h、 8 h、12 h、24 h、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d共12个时间点，分别测定进出水口的氨氮和亚硝酸盐氮的含量。取样结束后立即进行测定，若无显著变化，7 d试验后将氧化还原电位提高50 mV，更换相同的滤料继续试验，直到水中的氨氮、亚硝酸盐氮含量出现显著变化。B组为对照组，不通入臭氧，其他条件与 A组一致。试验过程中，每6 h测定一次氧化还原电位，保证氧化还原电位的稳定。试验过程中B组的氧化还原电位保持在(221.3±6.8)mV。

试验期间，每12 h补充一次新的养殖废水，并保证试验池内氧化还原电位保持在稳定状态。每天监测并记录试验池的pH、DO、ORP和水温等水质指标。试验期间保持水温控制在25-26℃，盐度为25-26，pH维持在7.5-8.0，DO≥8 mg/L。

总氨氮采用次溴酸钠氧化比色法，亚硝酸盐氮采用盐酸萘乙二胺分光光度法，所选用的仪器为7230G型分光光度计；化学需氧量采用碱性高锰酸钾法；溶解氧、pH、水温、盐度和氧化还原电位等水质数据的测定，使用专业水质分析仪。

剪下弹性滤料部分毛刷，称重后，将滤料上的附着物取下，放入500 ml灭菌海水中，匀浆，制成细菌原液。异养菌数量测定选取Zobell 2216E海水培养基，每个水样涂5个平板，28℃恒温，培养48 h，观察结果。菌落人工计数，细菌总数在30-300之间最合适。

将1.4.2中制备细菌原液稀释100倍，采用吖啶橙染色直接计数法(许兵等，1992)，橙色的为活菌，绿色的为死菌，在荧光显微镜下观察计数。

采用SPSS17.0统计软件对所采集的数据进行差异显著性分析。计算测定数据平均值、标准差，以P<0.05作为差异显著，P<0.01作为差异极其显著。

试验分两组，对照组经滤料处理后的水质稳定，氨氮浓度为(0.32±0.01)mg/L，亚硝酸盐氮浓度为0.03 mg/L，平均去除率分别为21.4%、16.7%。氧化还原电位值分别设置为300、350、400、450、500、550 mV时的氨氮和亚硝酸盐氮的含量变化趋势见图 2和图 3。

图 1(Fig. 1)

图 2 不同氧化还原电位条件下出水口氨氮浓度 Figure 2 The concentration of ammonia nitrogen in the outlet of filters under different oxidation-reduction potentials

图 1(Fig. 1)

图 3 不同氧化还原电位条件下出水口亚硝酸盐浓度变化 Figure 3 The concentration of nitrite nitrogen in the outlet of filters under different oxidation-reduction potentials

氧化还原电位设定值为300 mV时，实际测量的氧化还原电位为(301.4±1.7)mV，进行臭氧处理后，氨氮含量为(0.29±0.01)mg/L，亚硝酸盐氮含量为 0.02 mg/L。未经过生物滤料的养殖废水氨氮、亚硝酸盐氮的含量分别为0.41、0.03 mg/L。氨氮和亚硝酸盐氮的去除率分别为28.3%、29.0%。

氧化还原电位设定值为350 mV时，实际测量的氧化还原电位为(350.6±1.5)mV，进行臭氧处理后，氨氮含量为(0.30±0.02)mg/L，亚硝酸盐氮含量为0.02 mg/L。未经过生物滤料处理的养殖废水氨氮、亚硝酸盐氮的含量分别为0.42、0.03 mg/L。氨氮和亚硝酸盐氮的去除率分别为29.5%、22.3%。氧化还原电位设定值为 400 mV时，实际测量氧化还原电位为(401.6±1.1)mV，进行臭氧处理后，氨氮含量为(0.27±0.01)mg/L，亚硝酸盐氮含量为0.02 mg/L。未经过生物滤料的养殖废水氨氮、亚硝酸盐氮的含量分别为0.42、0.03 mg/L。氨氮和亚硝酸盐氮的去除率分别为35.9%、32.6%。

氧化还原电位设定值为450 mV时，实际测量的氧化还原电位为(450.6±0.7)mV，进行臭氧处理后，氨氮含量为(0.25±0.01)mg/L，亚硝酸盐氮含量为 0.02 mg/L。未经过生物滤料处理的养殖废水氨氮、亚硝酸盐氮的含量分别为0.42、0.03 mg/L。氨氮和亚硝酸盐氮的去除率分别为39.9%、26.8%。

氧化还原电位设定值为500 mV时，实际测量的氧化还原电位为(500.6±0.7)mV，经过臭氧处理24 h时，氨氮和亚硝酸盐氮含量升高。在处理1 h-12 h时，氨氮含量为(0.25±0.01)mg/L，亚硝酸盐氮含量为0.02 mg/L。未经过生物滤料的养殖废水氨氮、亚硝酸盐氮的含量分别为0.40、0.03 mg/L。氨氮和亚硝酸盐氮的去除率分别为36.5%、28.1%。在处理24-48 h时，氨氮含量为(0.34±0.01)mg/L，亚硝酸盐氮含量(0.03±0.01)mg/L。氨氮和亚硝酸盐氮的去除率分别为12.2%、8.4%。

氧化还原电位设定值为550 mV时，实际测量的氧化还原电位为(550.0±0.2)mV，经过臭氧处理4 h时，氨氮和亚硝酸盐氮含量升高。在处理1-3 h时，氨氮含量为(0.21±0.02)mg/L，亚硝酸盐氮含量为 0.02 mg/L。未经过滤料的养殖废水氨氮、亚硝酸盐氮的含量分别为0.40、0.03 mg/L。氨氮和亚硝酸盐氮的去除率分别为47.5%、32.1%。在处理4 h时，氨氮含量为0.38 mg/L，亚硝酸盐氮含量为0.30 mg/L。氨氮和亚硝酸盐氮的去除率分别为5.0%和3.3%。

由试验结果可以看出，添加臭氧后，当氧化还原电位由300 mV增加至450 mV时，氨氮的去除率表现出随着臭氧浓度升高而升高的趋势，最高去除率达39.9%，亚硝酸盐氮的去除率在22.3%-32.6%之间波动，氨氮和亚硝酸盐氮的平均去除率分别为33.4%、28.2%；当氧化还原电位为500 mV时，经过臭氧24 h处理，氨氮和亚硝酸盐氮的去除率分别由36.5%、28.1%降到12.2%、8.4%；氧化还原电位为550 mV时，经过臭氧4 h处理后，氨氮和亚硝酸盐氮的去除率分别由47.5%、32.1%降到5.0%、3.3%。可见，当氧化还原电位小于450 mV时，生物膜对养殖水体的处理效果良好，当超过500 mV时，生物膜的水处理效果明显下降，在臭氧和硝化细菌共同对养殖水中氨氮和亚硝酸盐氮的去除过程中，当氧化还原电位超过500 mV时，氨氮和亚硝酸盐氮去除率却显著下降，说明在臭氧的强氧化性不减的情况下，硝化细菌的去除效能明显减弱。

利用吖啶橙染色直接计数法测得，滤料上细菌的总平均数为(2.43±0.56)×10¹⁰个/g。对照组细菌存活率开始为97.9%，试验系统运行7 d后成活率为95.6%。氧化还原电位为300 mV时，试验开始前细菌存活率为98.1%，系统运行7 d后为90.5%。氧化还原电位为350 mV时，试验开始前细菌存活率为98.7%，系统运行7 d后为91.4%。氧化还原电位为400 mV时，试验开始前细菌存活率为98.4%，系统运行7 d后为82.7%。氧化还原电位为450 mV时，试验开始前细菌存活率为99.2%，系统运行7 d后为85.8%。氧化还原电位为450 mV时，试验开始前细菌存活率为97.6%，系统运行12 h后为82.2%，系统运行24 h后为43.2%。氧化还原电位为550 mV时，试验开始前细菌存活率为98.3%，系统运行3 h后为81.8%，系统运行4 h后为31.5%。

对照组在试验开始和结束时滤料细菌成活率差异不显著。实验组在试验结束时，当氧化还原电位为300-450 mV时，滤料细菌成活率比试验开始时减少约10%，可能是臭氧对滤料外层细菌有一定的杀灭作用；当氧化还原电位为500 mV时，臭氧处理前12 h与300-450 mV时的结果基本一致，臭氧处理24 h后细菌成活率开始明显下降；当超过500 mV时，细菌存活率明显下降。这表明高浓度臭氧添加对硝化细菌造成了严重伤害，硝化细菌数量显著减少，进一步说明了，臭氧浓度增加去除率反而显著下降的原因。

生物膜法是一种以各种滤料为载体，通过微生物形成的生物膜去除养殖水体中化学物质(包括氨氮和亚硝酸盐氮等)的方法(高喜燕等，2009)。利用生物膜法去除养殖水体中的有害物质，在此条件下生长的生物膜主要由氨氧化细菌、硝化细菌、反硝化细菌、光合细菌、藻类(光照条件下)和原生动物等组成，其中大部分通过细菌的代谢活动被降解(张正等，2012)。生物膜法对养殖水体中化学物质的去除效果良好，张正等(2012)研究表明，海水循环水养殖系统中生物滤池经快速挂膜，对氨氮、亚硝酸盐和化学需氧量(ChemicalOxygen Demand，COD)的去除率分别为52.04%、26.82%、62.94%。齐巨龙等(2010)通过研究循环水养殖系统中预培养生物滤膜得出，养殖池排水口的氨氮含量为0.44 mg/L，进水口的氨氮含量为 0.05 mg/L，一次性平均去除率为88.64%。李岑鹏等(2009)利用循环水处理系统处理鳗鲡养殖污水，氨氮、亚硝酸盐氮和COD的平均去除率分别为25.2%、52.2%、52.6%。臭氧也可以去除循环水养殖系统水体中的化学物质，宋奔奔等(2011)通过研究臭氧对大菱鲆半封闭循环水养殖系统水质净化作用得出，向低压喷淋式溶氧器添加0.26 mg/L的臭氧后，总氨氮去除率约为18%，亚硝酸盐氮去除率约为8%。由此可见，生物膜是利用生物去除水中氨氮、亚硝酸盐氮和COD，臭氧是通过强氧化剂化学减少水中的有害物质。

在本研究中，对照组对氨氮和亚硝酸盐氮的去除率分别为21.4%、16.7%，细菌存活率为95.6%。当氧化还原电位在300-450 mV范围内时，经过臭氧处理168 h，氨氮和亚硝酸盐氮的平均去除率分别为33.4%、28.2%，细菌存活率平均为88.1%；当氧化还原电位为500 mV时，经过臭氧24 h处理，氨氮和亚硝酸盐氮的去除率分别由36.5%、28.1%减少到12.2%、8.4%，细菌存活率由82.2%降到43.2%；当氧化还原电位为550 mV时，经过臭氧4 h处理后，氨氮和亚硝酸盐氮的去除率分别由47.5%、32.1%降到5.0%、3.3%，细菌存活率由81.8%降到31.5%。当氧化还原电位小于450 mV时，滤料对养殖水体的处理效果良好，细菌存活率稍有下降；在超过500 mV时，高浓度的臭氧可对细菌造成巨大伤害，导致水处理效果明显下降。因此，综合考虑封闭循环水系统工艺流程、设备可控性和安全性等因素，以及不同规格和不同品种养殖鱼类对臭氧的适应力或耐受力的差异，建议将封闭循环水系统中养殖池内和生物滤池内的氧化还原电位控制在400 mV之内为宜。本研究结果与周游等(2012)在臭氧前后置工艺变化对循环水半滑舌鳎养殖系统水环境的影响试验中，得到的臭氧投加量要控制在ORP指标350 mV以内的结果非常接近。