对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)严重危害着全球对虾养殖业，造成巨大的经济损失。WSSV致病宿主范围非常广，致病力也非常强，对虾感染该病毒后死亡率高达100%。然而，WSSV全基因组序列测序的完成，使研究者对WSSV的结构基因及其表达的蛋白的性质和功能有了全面的认识(陈文博等，2009)。运用蛋白质组学的方法，已经鉴别出40多种WSSV的结构蛋白，其中22种是囊膜蛋白，主要的囊膜蛋白有VP19、VP28、VP31、VP36B、VP38A、VP51B和VP53A等，主要的囊膜被膜蛋白有VP26、VP36A、VP39A和VP95等(Tsai et al，2006; Leu et al，2009)。通过免疫共沉淀法和酵母双杂交法研究了WSSV结构蛋白之间的互相作用，发现VP28、VP51A、VP19和VP37这4种蛋白位于病毒颗粒的最外层，预测它们可能在识别宿主细胞表面的模式、识别受体方面具有重要的作用(Chang et al，2010)。Yi等(2004)研究发现，VP28是WSSV侵入对虾细胞所必需的，而VP26负责将VP28蛋白与核衣壳蛋白连接起来(Wan et al，2008) 。

一般认为，对虾缺乏获得性免疫系统，只能依赖天然性免疫系统来抵抗外源病原体的入侵。然而，现在越来越多的研究发现，DNA疫苗(Rajeshkumar et al，2009; Mu et al，2012)和蛋白质亚单位疫苗(丁晶等，2013; Satoh et al，2008)可以激活对虾的免疫系统、增强对虾抵抗病毒侵染的能力，这些研究颠覆了人们对对虾免疫认识的传统思维，为寻求防治WSSV的有效途径带来了希望。DNA疫苗是在分子生物学技术基础上发展起来的特殊疫苗，它具有免疫效果好、生产成本低和临床应用方便等优点(杨海等，2013)。但DNA疫苗的本质毕竟是核酸，存在着基因转移到宿主的可能性，其使用的安全性必须放在最关键的位置。蛋白质亚单位疫苗的本质是蛋白质，生物体利用蛋白质并将其用于机体本身的生命活动，不会造成危害，是一种安全的疫苗。

本研究选取VP28和VP26这两种WSSV囊膜蛋白作为研究对象，利用毕赤酵母表达系统来组成型分泌表达这两种目的蛋白，以期为规模化制备对虾免疫增强剂提供基础数据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 质粒与菌种

表达质粒pGAPZαA和X-33毕赤酵母(Invitrogen)为本实验室-80℃保存。E.coli Competent Cells Top10购自北京天根生物科技有限公司。WSSV粗提液为本实验室-80℃保存。

1.1.2 实验试剂

pEASY-T1 simple Cloning Kit和T4 DNA Ligase购于北京全式金生物技术有限公司；Zeocin购自Invitrogen公司；快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、2 kb/5 kb DNA Marker、高纯度质粒小提试剂盒、常规PCR用2×Es Taq MasterMix和蛋白银染试剂盒购自康为世纪生物公司(CWBIO，北京)；限制性内切酶EcoRⅠ、XbaⅠ和AvrⅡ购于TaKaRa公司；葡萄糖为AMRESCO公司产品；酵母提取物(Yeast Extract)、胰蛋白胨(Tryptone)和琼脂粉均购于BBI公司，其他均为国药分析纯。

1.1.3 引物设计

根据NCBI中提交的WSSV的全基因组cDNA序列(GenBank：AF332093.3) ，设计含EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点的VP28基因引物xVP28-F、xVP28-R，VP26基因引物xVP26-F、xVP26-R。根据Invitrogen公司pGAPZαA手册提供的引物序列pGAP-F、AOX1-R，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，xVP28-F(5'-3')：CCGGAATTCATGGATCTTTCTTTCAC，xVP28-R(5´-3´)：GCTCTAGATTACTCGGTCTCAGTGC。xVP26-F(5´-3´)：CCGGAATTCATGGAATTTGGCAACC，xVP26-R(5´-3´)：GCTCTAGATTACTTCTTCTTGATTTCG。PGAP-F(5´-3´)：GTCCCTATTTCAATCAATTGAA，AOX1-R(5´-3´)：GCAAATGGC ATTCTGACATCC。引物中加下划线部分序列分别为EcoR I、Xba I酶切识别位点，且在酶切位点前引入了保护碱基。

1.2 方法 1.2.1 VP28和VP26基因的获得

取-80℃保存的WSSV粗提液作为模板，以引物对xVP28-F/xVP28-R和xVP26-F/xVP26-R分别进行普通PCR扩增，反应体积为50 μl，反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，62℃/58℃退火30 s(VP28/VP26) ，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。采用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收VP28和VP26目的片段。

pGAPZaA目的基因重组表达载体的构建使用EcoRⅠ和XbaⅠ对空载pGAPZaA、VP28和VP26基因进行双酶切，切胶回收后T4连接酶于25℃连接30 min。转化大肠杆菌Top10感受态细胞，在含25 μg/ml Zeocin LB平板上进行抗性筛选，挑取阳性克隆委托生工生物工程(上海)股份有限公司测序，将测序正确的重组表达质粒分别命名为pGAPZaA、pGAPZaA-VP28和pGAPZaA-VP26。

1.2.3 重组表达质粒电转化毕赤酵母

使用AvrⅡ酶切线性化重组质粒pGAPZaA、pGAPZaA-VP28和pGAPZaA-VP26。参照Invitrogen公司毕赤酵母操作手册制备X-33酵母感受态细胞。将线性化质粒电击转化X-33酵母，然后涂布于含100 μg/ml Zeocin YPDS平板上，30℃培养3 d左右，筛选阳性克隆。提取阳性酵母基因组DNA作为模板，以pGAP-F和AOX1-R作为上下游引物进行普通PCR扩增，阳性重组酵母分别为X-33/pGAPZaA-VP28和X-33/pGAPZaA-VP26，X- 33/pGAPZaA作为空白对照。

1.2.4 重组酵母的表达与检测

挑取阳性重组酵母分别接种至5 ml Zeocin抗性的YPD液体培养基中，在30℃、250 r/min的条件下过夜培养。取200 μl上述活化菌液接种至装有50 ml新鲜YPD培养基的250 ml三角摇瓶中，30℃、250 r/min振荡培养72 h。4℃、12000×g离心3 min，上清液经液氮速冻后，保存于-80℃冰箱。

分别取40 μl X-33/pGAPZaA-VP28、X-33/pGAP ZaA-VP26和X-33/pGAPZaA蛋白发酵上清液，加入10 μl 5×蛋白质上样缓冲液，混匀后，99℃金属浴10 min，然后12000 ×g离心2 min，取离心后的上清液上样，取5 μl蛋白质分子量标准作为分子量参照，进行SDS- PAGE蛋白质电泳。电泳结束后，分别采用R-250考马斯亮蓝染色和蛋白质银染来检测目的蛋白。

2 结果 2.1 VP28 和VP26基因的扩增

VP28和VP26的基因是以WSSV的DNA粗提液为模板，进行普通PCR扩增得到的，琼脂糖凝胶电泳结果如图 1所示，在500-750 bp之间有明显的条带，这与预测的VP28和VP26基因的片段大小均为632 bp相符。

2.2 pGAPZaA-VP28和pGAPZaA-VP26重组质粒的鉴定

用T4 DNA Ligase将酶切后的片段与具有相同黏性末端的pGAPZaA表达载体连接，从而构建好重组表达载体，将得到的连接产物转化大肠杆菌Top10，经Zeocin抗性筛选后，挑取抗性单克隆进行菌落PCR鉴定，PCR产物电泳结果见图 2，与目的条带应为1172 bp的理论值相符。取阳性克隆测序，测序结果经MEGA 5.05软件分析，可证明重组表达载体序列完全正确，无移码错配。

2.3 重组酵母发酵上清液SDS-PAGE电泳考染结果

挑取阳性酵母转化子进行发酵，发酵上清液用于蛋白质凝胶电泳，电泳结束后采用考马斯亮蓝R-250染色，染色结果见图 3，结果显示，与空载pGAPZaA相比，含有VP28和VP26目的基因的酵母上清液的电泳没有特异的条带。因此，需要采用更灵敏的检测方法来确定目的蛋白是否成功表达。

2.4 重组酵母发酵上清液SDS-PAGE电泳银染结果

利用蛋白质银染法来进一步检测酵母发酵上清液中的目的蛋白，银染结果见图 4，与空载pGAPZaA酵母表达上清液组相比，pGAPZaA-VP28和pGAPZaA- VP26酵母表达上清液组在箭头所指的平行位置有明显的特异性条带。根据蛋白分子量标准预测VP28和VP26的蛋白分子量在32 kDa左右。

3 讨论

随着基因工程和生物技术的发展，在体外表达功能蛋白已经成为一种高效可行的获取蛋白疫苗的方法。在对虾白斑综合征防治的研究中，WSSV重组蛋白可以诱发虾体产生抗WSSV侵染反应的结果已被许多研究者所证明，而这些WSSV重组蛋白被称为蛋白质亚单位疫苗，其中研究最多的是VP28病毒囊膜蛋白。魏克强等(2005) 利用杆状病毒感染家蚕蛹来成功表达VP28蛋白，Fu等(2008) 构建了pBS-H1-VP28枯草芽孢杆菌表达载体，并在枯草芽孢杆菌成功表达VP28蛋白，Satoh等(2008) 利用大肠杆菌成功表达了VP28和VP26蛋白，养殖实验均证明WSSV重组蛋白具有增强虾体抗WSSV感染的能力。

本研究使用毕赤酵母表达系统分泌性表达VP28和VP26目的蛋白，选用的表达载体是pGAPZaA，它属于组成型的表达载体，因为该表达载体的启动子是pGAP(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)，使用该启动子表达目的蛋白时不需要使用甲醇诱导。毕赤酵母表达系统属于真核表达系统，对翻译后的蛋白质可以进行一定的加工，有利于真核生物蛋白的表达和活性的保持，优于原核表达系统。此外，表达产物可以分泌到细胞外，便于目的蛋白的纯化与分离，适合规模化生产。目前，利用该表达系统已经成功表达很多功能蛋白，如β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、羧肽酶B和羧酸酯酶等(Waterham et al，1997; Sears et al，1998; 张平涛，2008¹⁾ ; Delroisse et al，2005)。使用组成型表达系统不需要更换碳源，发酵周期短，且可以采用连续发酵的方式进行大规模发酵，这些都给酵母发酵产业带来了新的视角和机遇。但是，使用毕赤酵母组成型表达系统外源蛋白时，有一个最主要的限制，就是本系统不能用于表达对酵母细胞有害的蛋白质。此外，毕赤酵母组成型表达系统能否高效分泌性表达外源蛋白，还与目的基因插入酵母基因组的位置与拷贝数、选用何种信号肽序列以及酵母培养条件(如温度、pH值、溶氧和营养物等)等有密切关系。

1) 张平涛. 鼠羧肽酶原B和蛇毒金属蛋白酶Alfimeprase两种蛋白在毕赤酵母中表达研究. 厦门大学硕士研究生学论文，2008

本研究首次尝试在毕赤酵母中组成型分泌表达VP28和VP26目的蛋白，经检测成功表达，但目的蛋白的表达量较低，推测有以下原因：(1) 发酵条件不合适：实验采用摇瓶小量发酵，无法控制发酵液的pH值、溶氧量以及营养物质的供给；(2) 没有筛选到高效表达的菌株：目的基因不同拷贝数的插入，甚至不同的阳性菌株，目的蛋白的表达量都有可能不同，实验缺乏有效的检测高效表达菌株的方法；(3) 信号肽选用不合适：本研究采用的是酵母本身的信号肽序列-α-交换因子，该信号肽可能不适合引导VP28和VP26分泌表达；(4) VP28和VP26蛋白本身可能不适合在毕赤酵母中组成型分泌表达。因此，还需要大量相关的研究来解释这一现象的真实原因。尽管如此，本研究还是能为研究WSSV蛋白亚单位疫苗的研究提供实践经验和基础数据，为WSSV蛋白亚单位疫苗的规模化使用的前景奠定一些基础。