长牡蛎(Crassostrea gigas)也称太平洋牡蛎，属瓣鳃纲、珍珠贝目、牡蛎科，广泛分布于西北太平洋海域，是世界上第一大养殖贝类，也是我国四大养殖贝类之一。随着牡蛎养殖规模的扩大，我国牡蛎养殖产量逐渐跃居到世界首位，但就牡蛎产业创造的价值而言，我国远远落后于欧美等发达国家，尤其近年来，养殖长牡蛎出现品质下降、种质退化等现象，表现为出肉率低、死亡率高、肉质下降等，严重影响我国牡蛎的国际竞争力。为维护行业的健康发展、保护长牡蛎种质资源，开展优良群体的选育工作已成为必然。

牡蛎具有繁殖力高、繁殖周期短、野生群体遗传变异水平高的优点，非常适合开展选育工作(Newkirk，1983)。有研究表明，通过家系选育或群体选育能实现长牡蛎的快速生长，降低长牡蛎的夏季死亡率，提高生产性能等(Hershberger et al，1984; Dégremont et al，2007; Beattie et al，1980; Ward et al，2000; Langdon et al，2003)。Li等(2006) 发现，我国长牡蛎的养殖群体仍保持着较丰富的遗传多样性，这为实施长牡蛎的选择育种计划提供了有利条件。

群体遗传结构的研究是遗传资源利用和物种保护的基础(李昂等，2002)。进行人工选育时，一定的人工选择压力或者外部环境会使群体的遗传结构产生变化，近交几率增加以及有效亲本数的减少，导致选育群体的遗传多样性下降，甚至出现性状衰退的现象。虽然一些研究报道了贝类养殖群体的遗传多样性与野生群体相比未发生明显变化(Li et al，2006; English et al，2000; Durand et al，1993; Zhao et al，2009)，但在贝类的苗种培育和群体选育过程中，常因亲本数量过少、亲本贡献不均、雌雄比例不当、配子质量差异、人工选择交配等因素，引起有效群体的数量的降低，从而降低选育群体的遗传多样性(Hedgecock et al，1990; Boudry et al，2002; Taris et al，2006; Appleyard et al，2006)。因此，将分子标记技术应用于长牡蛎遗传育种的研究，对养殖群体的遗传变异进行监测，对群体间的各遗传参数进行评估，显得尤其重要。

微卫星(Simple Sequence Repeats)技术亦称为简单重复序列，它由1-6个碱基组成的基本序列串联而成，由于具有多态位点多、信息量大、每个位点的多态性呈共显性遗传、易与PCR技术结合、多态性检测快捷等优点，被广泛应用于水产动物遗传多样性分析和遗传图谱构建等研究中。本研究以壳宽快速生长为选育目标的长牡蛎选育群体为材料，利用微卫星(SSR)分子标记技术，对基础群体(P0) 和两代选育群体(F1和F2) 的遗传多样性进行跟踪监测，分析人工定向选育对养殖群体遗传结构的影响，为我国长牡蛎资源的保护和健康发展及更有效开展选育提供数据和资料。

本研究采集的样本为长牡蛎烟台崆峒岛选育基础群体(P0) 和连续两代选育群体(F1和F2) ，共3个群体(表 1)。基础群体系2012年采自烟台崆峒岛近海的半人工采苗野生群体，2013-2014年连续两年从壳宽快速生长的个体中留选亲本进行群体选育，保证雌雄亲本数目皆不少于50。亲本自海上采集后，经过暂养促熟阶段后，人工采集精子和卵子，并使之按一定比例混合，待受精卵孵化后进入幼苗培育及养成阶段，具体方法参见Li等(2011) 和Wang等(2012) 的报道，每个世代的样品分别从连续选育群体的成体个体中随机选择。样品采集完之后，取长牡蛎的闭壳肌保存于95%的酒精中，存放于-20℃低温冰柜中保存。

表 1(Tab. 1)

表 1 长牡蛎群体的取样时间、地点、群体类型和样本数 Table 1 The sampling location，population，time and size of C. gigas 群体Population 采样地点Sampling location 采样时间Sampling time 群体类型Type of population 样本数Sample size P0 中国烟台Yantai，China 20130525 基础群体Basic population 40 F1 中国烟台Yantai，China 20140529 F1选育群体F1 population 40 F2 中国烟台Yantai，China 20151226 F2选育群体F2 population 40

表 1 长牡蛎群体的取样时间、地点、群体类型和样本数 Table 1 The sampling location，population，time and size of C. gigas

DNA的提取采用常规酚/氯仿法，具体操作参照Li等(2006) 的方法，DNA浓度的检测通过紫外分光光度计Ultrospec 2100 pro UV/visible spectrophotometer(Amersham Inc.)来完成。用灭菌水稀释成100 μg/ml的模板DNA，-20℃备用。

本研究共选用了10个长牡蛎多态性较高的微卫星位点进行分析：ucdCg-149、ucdCg-138、ucdCg-194、ucdCg-157、ucdCg-160、ucdCg-162、ucdCg-109、ucdCg- 177、ucdCg-175和ucdCg-140(Li et al，2003)(表 2)。

表 2(Tab. 2)

表 2 10对长牡蛎微卫星位点特征 Table 2 Characteristics of the ten microsatellite loci of C. gigas 位点Locus GenBank登录号 GenBank accession No. 重复位点数 Repeat array 引物序列 Primer sequence(5′−3′) 退火温度Tm(℃) ucd-Cg149 AF468551 (GA)n(GACA)N TGATTAAACGTGGGTGATTCAG TTTCTGACTGTCCGTCTGTGA 60 ucd-Cg138 AF468542 (GA)N CCTCGAACAGCACTCCAAAT TTCAGTTCAACGCTCTTGCT 57 ucd-Cg194 AF468592 (GAT)n(GAG)N CCCAGTGAAAACTTGGAGACA TTTCGAATCGGGAAAATACG 52 ucd-Cg157 AF468558 (GA)N(TAGA)N GGGGGATGTCGGAGAAGTAT AACAGAGAAAGGTGGATTTTAGGA 58 ucd-Cg160 AF468560 (GA)n(GACA)n GGAGCCATTAACAACACCACA TCTCTCCCTTCCCCCTCTTA 57 ucd-Cg162 AF468562 (TTCA)N(AT-CT)n(GTCT)N CCAAATCACCGTTTTAGTTTGTT AGCGACACAGAGACCACCTT 52 ucd-Cg109 AF468525 (CAT)n GCTATGGTTGTCATCCTCGAA TGCCTTTATCGGTTTTGCTT 53 ucd-Cg177 AF468575 (GA)n GCTTCCGGGAATTAAACCAT TCAAGAAAAAGTCGACGGGTA 57 ucd-Cg175 AF468573 (CAT)n GGGCATGGATCAACTCCTAA CCAACCAGCCCTAGTCTGTG 55 ucd-Cg140 AF468544 (CT)N TGCTCAATTCACAGCAATCAG TCTGACTGCTGAACAGCAAAAT 60

表 2 10对长牡蛎微卫星位点特征 Table 2 Characteristics of the ten microsatellite loci of C. gigas

PCR反应体系为10 μl，包含100 ng模板DNA、1×PCR buffer、0.2 mmol/L dNTP混合液、1 μmol/L引物、1 mmol/L MgCl₂和0.25 U Taq DNA聚合酶(TaKaRa Inc.)。

PCR反应条件：94℃预变性3 min；35个循环为94℃ 1 min，退火1 min，72℃ 1 min；72℃延伸5 min。PCR反应于GeneAmp ® RCR System 9700上进行。

PCR产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，硝酸银法染色。为避免不同凝胶之间条带位置的误差，用同一个参照样品在每一块胶上进行电泳作为对照。用10 bp DNA ladder(Invitrogen)作为Marker检测等位基因位置。

使用软件POPGENE Version 1.32计算各微卫星位点在3个群体中的等位基因数N，多态性信息含量(Pic)(Botstein et al，1980)、期望杂合度(H_e)，观测杂合度(H_o)，哈迪温伯格平衡(HWE)的偏离情况(Raymond et al，1995)以及遗传分化(F_st)，固定系数(F_is)(Levene et al，1949)。用Genepop 1.4软件计算Nei(1987)群体间的相似性系数(I)和群体间遗传距离(D_A)。

运用10对微卫星引物，对长牡蛎基础群体以及连续选育两代群体的所有采集样本，进行多样性分析，10个位点在所有群体中均表现出较高的多态性，P0的平均等位基因数为16.5，F1代和F2代选育群体的平均等位基因数为12.2、12.8。3个群体的多态信息含量(Pic)平均值依次为0.9068、0.8982、0.8836。所有群体在10个位点的观测杂合度均小于期望杂合度，观测杂合度平均值范围0.5775-0.6484，期望杂合度范围为0.8594-0.9279。经过Bonferroni(Rice，1989)校正后，HWE平衡结果显示，3个群体在10个位点仍有24个群体的位点组合显著偏离HWE平衡。固定系数F_is均为正值，平均范围为0.1541-0.2341，表明3个群体在所有位点上，表现出了一定程度的杂合子缺失(详见表 3)。

表 3(Tab. 3)

表 3 长牡蛎基础群体和连续选育世代的遗传多样性分析 Table 3 Genetic diversity of the wild population and successive selection stocks of C. gigas 位点Locus 基础群体P0(n=40) 选育群体F1(n=40) 选育群体F2(n=40) ucdcg-157 N 16 11 15 Pic 0.9088 0.8169 0.9093 Ho 0.7188 0.7273 0.6563 He 0.9276 0.8462 0.9301 Fis 0.2145 0.1321 0.2832 P 0 0.0711 0 ucdcg-160 N 15 11 12 Pic 0.9027 0.8807 0.8705 Ho 0.8438 0.6667 0.7005 He 0.9241 0.9044 0.8942 Fis 0.0725 0.2611 0.5421 P 0.1670 0.0030 0.0020 ucdcg-162 N 16 11 17 Pic 0.8912 0.8651 0.9220 Ho 0.3871 0.6970 0.6563 He 0.9173 0.8909 0.9415 Fis 0.5697 0.4197 0.2919 P 0 0 0 Ucdcg-194 N 18 12 8 Pic 0.9206 0.8772 0.8344 Ho 0.2000 0.3939 0.4063 He 0.9412 0.9012 0.8651 Fis 0.7839 0.5759 0.5229 P 0 0 0 ucdcg-177 N 20 11 13 Pic 0.9161 0.8651 0.8945 Ho 0.7188 0.6970 0.8438 He 0.9360 0.8907 0.9167 Fis 0.2199 0.2134 0.0649 P 0 0 0.2724 ucdcg-138 N 19 10 12 Pic 0.9161 0.8526 0.8681 Ho 0.4688 0.5758 0.8750 He 0.9360 0.8802 0.8938 Fis 0.4913 0.3477 0.0055 P 0 0 0.1095 ucdcg-140 N 16 11 11 Pic 0.9004 0.8461 0.8732 Ho 0.5000 0.3939 0.3438 He 0.9221 0.8727 0.8983 Fis 0.4492 0.5626 0.6113 P 0 0 0 ucdcg-109 N 16 12 14 Pic 0.9176 0.8715 0.8903 Ho 0.7813 0.8788 0.7188 He 0.9375 0.8965 0.9132 Fis 0.1534 0.0050 0.2004 P 0 0.5421 0.0015 ucdcg-149 N 12 14 15 Pic 0.8762 0.9067 0.9157 Ho 0.7188 0.6970 0.8438 He 0.8998 0.9273 0.9360 Fis 0.1885 0.2446 0.0843 P 0.0070 0.0025 0.0204 ucdcg-175 N 17 15 11 Pic 0.9181 0.9108 0.8448 Ho 0.4375 0.7273 0.4688 He 0.9380 0.9310 0.8735 Fis 0.5262 0.2145 0.4549 P 0 0.0040 0 MEAN N 16.5 12.2 12.8 Pic 0.9068 0.8982 0.8836 Ho 0.5775 0.6188 0.6484 He 0.9279 0.8954 0.9066 Fis 0.1547 0.2078 0.2341  注: 哈迪-温伯格平衡偏离水平：P＜ 0.05 /10  Note: Degree of deviation of Hardy-Weinberg equilibrium: P ＜ 0.05 /10

表 3 长牡蛎基础群体和连续选育世代的遗传多样性分析 Table 3 Genetic diversity of the wild population and successive selection stocks of C. gigas

计算不同群体配对比较的F_st值，均小于0.05，遗传分化仍属于较低的弱分化水平，所有10个微卫星位点计算群体间总的遗传分化系数为0.0487，表明只有4.87%的遗传变异来自群体间，95.2%的遗传变异来自于群体内(表 4)。运用Genepop1.4软件计算长牡蛎3个群体间的遗传相似性系数(I)和遗传距离(D_A)，不同世代群体间的相似性系数为0.8814-0.9132，遗传距离为0.27121-0.5203，群体间遗传距离大的遗传相似性低(表 5)。

表 4(Tab. 4)

表 4 不同群体配对比较的Fst 值 Table 4 Fst values of pairwise comparison among all populations Pop ID P0 F1 F2 P0 F1 0.0245 F2 0.0149 0.0093

表 4 不同群体配对比较的Fst 值 Table 4 Fst values of pairwise comparison among all populations

表 5(Tab. 5)

表 5 长牡蛎3 个群体的Nei's 相似性系数和遗传距离 Table 5 Nei's genetic identity and genetic distance in three populations of C. gigas Pop ID P0 F1 F2 P0 0.5944 0.6599 F1 0.5203 0.7625 F2 0.4175 0.2712  注：对角线以上为相似性系数，以下为遗传距离  Note: Nei's genetic identity was shown above the diagonal，and genetic distances were shown below the diagonal

表 5 长牡蛎3 个群体的Nei's 相似性系数和遗传距离 Table 5 Nei's genetic identity and genetic distance in three populations of C. gigas

遗传多样性是生物多样性的基础，与其生存繁衍和进化潜力密切联系。人工群体选育的目的是在维持选育群体具有一定遗传多样性的基础上，获得具有目标性状的选育新品种。在长期累代选育过程中需要保持足够的遗传变异水平及一定的遗传响应，这就需要加强对选育群体的遗传结构的研究与监测。本研究结果中，选育群体较野生基础群体，等位基因数及多态信息含量均略有下降，但二者都保持在较高水平上；同样，在杂合度方面，选育群体也未出现明显下降的现象，各群体都表现出了较高的遗传多样性。有很多学者认为，选育群体较野生群体会出现遗传多样性下降的现象。王庆志等(2012) 在对以快速生长为选育目标的长牡蛎连续三代选育群体进行研究发现，选育群体与野生群体和基础群体比较，等位基因丰富度下降了14.5%和8.7%。赵广泰等(2010) 在对大黄鱼连续4代选育群体遗传多样性与遗传结构的微卫星分析时发现，4个世代群体遗传多样性指标值渐次下降，F1-F4代13个微卫星位点的平均多态信息含量从0.638下降到0.524，平均等位基因数从5.462下降到4.308。类似报道在合浦珠母贝(Pinctada margarififera)(Durand et al，1993)、大珠母贝(Pinctada maxima)(Lind et al，2009)和长牡蛎(English et al，2000; Hedgecock et al，1990)等种类也出现过。本研究中的各代群体的遗传多样性程度并未出现显著性下降，分析原因可能是繁育亲本的数目较多，而且选育初期经历的世代数比较少的缘故。此外，本研究未对选育群体自幼虫至成贝养成的各阶段中的长势弱小的个体进行人工淘汰也是遗传多样性水平保持相对稳定的原因。

本研究中，在对各位点进行F_is值分析时发现，各群体出现了一定程度的杂合子缺失现象，并导致几乎所有位点显著偏离HWE平衡，分析原因可能是在选育过程中由于人工选择的压力过分注重生长性状，使得与这些性状有关的基因保留下来，一些无关的基因丢失了，导致基因纯化加快从而产生杂合子缺失的现象，另外，实验取样数目过少或者取样不均匀也可能与之有关联。此外，无效等位基因的存在(Ball et al，1987; 张志伟等，2006)也可能对结果产生干扰。

遗传分化指数F_st是反映群体之间的亲缘关系的重要参数，本研究中两两比较所得F_st值均小于0.05，3个世代群体间遗传分化较弱，群体间总的遗传分化系数为0.0487，根据Wright(1978) 对遗传分化指数的界定，F_st值介于0-0.05之间，表示群体遗传分化较弱，表明经过连续人工选育，群体间的遗传结构差异不明显，群体仍保持了足够的选育潜力。究其原因，可能与人工选育过程中亲本数较多，雌雄比例平衡或者没有将生长迟缓的个体筛除有关，此外，选育的世代太短也是影响因素(Li et al，2011; Wang et al，2012)。由Nei(1987)方法计算的3个群体的遗传相似系数为0.8814-0.9132，群体间的遗传距离0.2712-0.5203，相邻世代的遗传距离逐步减小，遗传相似性逐步增大(详见表 4)，说明随着选育时间的推进，选育群体的遗传背景趋于一致，遗传结构也在逐步趋向稳定。以上结果表明，选育群体的遗传结构在选择压力下会发生一定程度上的改变，朝向目标性状一致的方向变化，并逐步趋向稳定，而这恰恰正是选择育种期望取得的结果。

本研究中的长牡蛎亲本来源于山东烟台崆峒岛野捕的自然野生个体，具备很高的遗传多样性，是开展良种选育的理想材料。在继代选育过程中，每一代都是从上一代中挑选壳宽生长快且体质健壮的优良个体繁育而来，故选育的后代在生长性状方面有着较为优良的表现。本研究结果表明，持续的人工选育对长牡蛎壳宽选育群体的遗传结构产生了显著影响，继续保持一定的选择压力不会对群体产生不良影响，虽然人工选育带来的必然结果是遗传多样性的下降，但此程度处于较低水平，长牡蛎选育群体仍有较大的选育潜力。在今后的选育工作中，完善各项管理工作的同时，还应充分考虑增加有效群体数量，以防止近交几率的提高，以保证长牡蛎良种选育工作的顺利进行。