热激蛋白(Heat shock proteins, HSPs)是一类在进化上高度保守的蛋白，广泛存在于生物体中。根据同源性和分子量大小，HSPs可分为Hsp110、Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40和小分子Hsp (sHsp)家族(Feder et al, 1999)。生物体细胞受到环境高温、缺氧、饥饿、病原感染、重金属、农药等各种刺激时，会激活HSPs的表达和合成，作为分子伴侣抑制细胞凋亡，保护细胞及其胞内转运功能，维持机体的自身稳定性(Vabulas et al, 2010)。此外，HSPs还参与宿主的免疫应答反应，在抗原呈递、激活淋巴细胞和巨噬细胞、激活和熟化抗原呈递细胞中发挥作用(Suzue et al, 1997; Osterloh et al, 2008)。同样，HSPs可作为免疫佐剂，在抗肿瘤和抗病原感染中发挥作用(Colaco et al, 2013)。

Hsp90是机体细胞中主要的伴侣蛋白，在非应激条件下的表达量占细胞蛋白总量的1%–2%，在诱导条件下的表达量可增至4%–6%(Pratt, 1997)。在脊椎动物中，Hsp90有多种异构体，有胞浆型的Hsp90α和Hsp90β、内质网型的Grp94、线粒体型的TRAP，它们参与细胞的多个过程，如信号传导、细胞分化、细胞增殖和凋亡、形态发生和发育、免疫反应等(Zhao et al, 2005; Wandinger et al, 2008)。在鱼类中，Hsp90参与胚胎肌肉发育(Du et al, 2008)、变态(Manchado et al, 2008)、氧化应激(Padmini et al, 2009、2011)、抗细菌感染(Cha et al, 2013)等多个过程。牙鲆(Paralichthys olivaceus)是重要的海水经济鱼类，已发现牙鲆有多种Hsp，包括Hsp10、Hsp40A4、Hsp40B6、Hsp40B11、Hsp60、Hsp70、Grp78、Hsp90α、Hsp90β和Grp94(Cha et al, 2013)，其中，Hsp90α和Hsp90β的基因序列已经公布，但它们的功能和作用机制尚未清楚。本研究拟对牙鲆Hsp90α和Hsp90β在mRNA水平的组织分布、表达及对温度和病原菌刺激的响应进行探索，为进一步阐明牙鲆Hsp90的功能和作用机制提供理论基础。

实验用健康牙鲆购于山东海阳市水产有限公司养殖基地，暂养于实验室，常规养殖管理，养殖水温(19±1)℃。实验前，每批随机取3尾鱼的内脏组织进行细菌分离，确定未经细菌感染的鱼用于后续实验。

根据NCBI收录牙鲆Hsp90α (GenBank No. DQ662233.1)和Hsp90β(GenBank No. DQ662234.1) mRNA序列设计荧光定量PCR上下游引物，以牙鲆β-actin基因(GenBank No. HQ386788.1)为内参，引物序列详见表 1。

表 1(Tab. 1)

表 1 实验所用qRT-PCR引物及序列 Table 1 Sequences of primers used in the qRT-PCR analysis 引物 Primer 引物序列 Nucleotide sequence(5'→3')     RT-HSP90αF     CCGCTGGTGGCTCCTTTA     RT-HSP90αR     CTCTCGATGTATTCTGTCTGG     RT-HSP90βF     TGACACTGGAATCGGTATG     RT-HSP90βR     TTCTCGGCAACAAGGTAG     β-actin-F     AACCGCTGCCTCCTCCTCAT     β-actin-R     TCGGGACAACGGAACCTCTC

表 1 实验所用qRT-PCR引物及序列 Table 1 Sequences of primers used in the qRT-PCR analysis

选取1月龄(20±5) g、8月龄(200±50) g、12月龄(500±50) g、24月龄(1000±100) g牙鲆各3尾，迅速取肝脏、脾脏、头肾、后肾、心、肌肉、背皮、胃、肠、鳃、腹鳍、脑和血液13个组织，放入液氮中冻存后，转至–80℃冰箱保存。

实验选用8月龄(200±50) g牙鲆。检测不同温度刺激对Hsp90基因表达影响，设置7个温度实验组(5、10、16、19、22、28和32℃)，每个温度组设置3个平行组，每平行组12尾牙鲆，每组在不同温度海水中放置1 h后，迅速取肝脏和脾脏放入液氮中冻存，后转至–80℃冰箱中保存。

设置2种温度(10℃和28℃)来研究温度刺激对Hsp90基因表达的影响，每个温度设置3个平行组，每组12尾，分别刺激1、3、5、8 h，处理结束后，迅速取肝脏和脾脏放入液氮中冻存，转至–80℃冰箱保存。

实验选用8月龄(200±50) g牙鲆，分感染组和对照组，每组20尾，设3个平行组。感染组每尾鱼腹腔注射0.1 ml浓度为1×10⁶CFU/ml的鳗弧菌M3活菌，对照组注射生理盐水。在注射后的0、6、12、24、72 h，分别迅速取3尾鱼脾脏组织放入液氮中冻存，转至–80℃冰箱保存。

取–80℃保存的牙鲆组织90–100 mg，用RNAiso Plus(TaKaRa)抽提总RNA，各组织RNA采用反转录试剂盒(TOYOBO)按照说明步骤合成cDNA，保存于–20℃备用。

使用TransStart Top Green qPCR Super Mix(全式金)试剂盒对牙鲆各组织cDNA在实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad)上进行检测。并利用SPSS进行统计学分析，P < 0.05为差异显著。

通过qPCR检测牙鲆Hsp90α和Hsp90β基因的mRNA在不同月龄牙鲆的组织分布，结果显示，2个基因在4种月龄牙鲆(1、8、12和24月龄)的13种组织中均有表达和分布(图 1-A、图 1-B)，Hsp90α在8月龄的牙鲆组织中的表达量较高，其中，在牙鲆的体表组织(鳃、背皮、背肌和腹鳍)和肝脏的表达量高于同组织其他3组(P < 0.05)，在内脏组织(脾脏、肾、肠、脑、胃、血和心脏)的表达量较低；Hsp90β的表达水平整体上高于Hsp90α，其中，在肝和肠的表达量较高，而在部分体表组织(鳃、背肌和腹鳍)的表达量较低。

图 1(Fig. 1)

图 1 不同月龄牙鲆Hsp90 mRNA的相对表达水平 Figure 1 Relative expression of Hsp90 mRNA in different tissues of P. olivaceus at various growth stages A. Hsp90α mRNA; B. Hsp90β mRNA a、b、c和d代表各月龄组之间的差异性，相同字母为差异不显著(P > 0.05)，不同字母表示差异显著(P < 0.05) Letters a, b, c and d present the differences among the various fish age groups; the same letters indicate no significant difference (P > 0.05) and the different letters indicate significant difference (P < 0.05)

将8月龄(200±50) g牙鲆放置于不同温度海水1 h后，取肝脏和脾脏检测Hsp90基因mRNA表达水平。结果显示，在较低温(5℃和10℃)和适宜养殖温度(16℃和19℃)，各处理组牙鲆肝脏和脾脏的Hsp90α的相对表达量较低，分别为0.51–0.60和0.03–0.04，各组之间无显著性差异(P > 0.05)(图 2-A、图 2-C)；当水温高于19℃时，肝脏Hsp90α的相对表达量显著升高(P < 0.05)，由22℃的1.26升高到32℃的238.74；而当水温高于28℃时，脾脏Hsp90α的mRNA相对表达量略升高，由28℃的5.13升高到32℃的30.49。

图 1(Fig. 1)

图 2 不同温度刺激下Hsp90α和Hsp90β mRNA在牙鲆肝脏和脾脏中的表达 Figure 2 Expression of Hsp90α and Hsp90β mRNAs in the liver and spleen of P. olivaceus after stimulation at different temperatures A：肝脏Hsp90α mRNA的相对表达量；B：肝脏Hsp90β mRNA的相对表达量；C：脾脏Hsp90α mRNA的相对表达量；D：脾脏Hsp90β mRNA的相对表达量；a、b、c和d代表各组之间的差异性，相同字母为差异不显著(P > 0.05)，不同字母表示差异显著(P < 0.05) A: Liver Hsp90α mRNA expression level; B: Liver Hsp90β mRNA expression level; C: Spleen Hsp90α mRNA expression level; D: Spleen Hsp90β mRNA expression level; Letter a, b, c and d present the differences among various fish groups; the same letters indicate no significant difference (P > 0.05) and the different letters indicate significant difference (P < 0.05)

在较低温度(5、10和16℃)，牙鲆肝脏Hsp90β的相对表达量为132.36–139.11，显著高于高温处理组(19、22、28和32℃)的33.51–89.2 (P < 0.05) (图 2-B)；在适应养殖水温(16℃和19℃)中，脾脏Hsp90β的相对表达量较低(1.27–1.35)，而经过低温(5℃和10℃)和高温处理(22、28和32℃)，脾脏Hsp90β的相对表达量显著升高(P < 0.05)，为2.15–3.12(图 2-D)。

在10、28℃下放置不同时间，检测牙鲆肝脏和脾脏Hsp90α和Hsp90β的mRNA相对表达量。总体上，经过低温和高温的连续刺激，牙鲆Hsp90α和Hsp90β的mRNA相对表达量呈现先升高后降低的变化趋势。

在10℃处理时，肝脏的Hsp90α和Hsp90β的mRNA表达量分别在3 h和1 h时达到最大值(P < 0.05) (图 3-A、图 3-B)，脾脏的Hsp90α和Hsp90β的mRNA表达量分别在5 h和1 h达到最大值(P < 0.05) (图 3-C、图 3-D)。同时，肝脏和脾脏中Hsp90β mRNA表达量整体显著高于Hsp90α mRNA的表达水平(P < 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 3 10℃处理8 h牙鲆Hsp90 mRNA在肝脏和脾脏中的表达 Figure 3 Relative expression of Hsp90 mRNA in the liver and spleen of P. olivaceus treated at 10℃ for 8 h A：肝脏Hsp90α mRNA的相对表达量；B：肝脏Hsp90β mRNA的相对表达量；C：脾脏Hsp90α mRNA的相对表达量；D：脾脏Hsp90β mRNA的相对表达量；a、b、c、d代表各组之间的差异性，相同字母为差异不显著(P > 0.05)，不同字母表示差异显著(P < 0.05) A: Liver Hsp90α mRNA expression level; B: Liver Hsp90β mRNA expression level; C: Spleen Hsp90α mRNA expression level; D: Spleen Hsp90β mRNA expression level; Letter a, b, c and d present the differences among various fish groups; the same letters indicate no significant difference (P > 0.05) and the different letters indicate significant difference (P < 0.05)

在28℃处理时，肝脏的Hsp90α和Hsp90β mRNA表达量均在1 h时达到最大值(P < 0.05)(图 4-A、图 4-B)；脾脏的Hsp90α和Hsp90β mRNA表达量均在3 h时达到最大值(P < 0.05)(图 4-C、图 4-D)，而在最大值时，Hsp90α mRNA的表达水平显著高于Hsp90β mRNA的表达水平(P < 0.05)，且可以维持在一个较高水平。同时，肝脏和脾脏中Hsp90β mRNA表达量整体显著高于Hsp90α mRNA的表达水平(P < 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 4 28℃处理8 h牙鲆Hsp90 mRNA在肝脏和脾脏中的表达 Figure 4 Relative expression of Hsp90 mRNA in the liver and spleen of P. olivaceus treated at 28℃ for 8 h A：肝脏Hsp90α mRNA的相对表达量；B：肝脏Hsp90β mRNA的相对表达量；C：脾脏Hsp90α mRNA的相对表达量；D：脾脏Hsp90β mRNA的相对表达量；a、b、c、d代表各组之间的差异性，相同字母为差异不显著(P > 0.05)，不同字母表示差异显著(P < 0.05) A: Liver Hsp90α mRNA expression level; B: Liver Hsp90β mRNA expression level; C: Spleen Hsp90α mRNA relative expression; D: Spleen Hsp90β mRNA relative expression level; Letter a, b, c and d present the differences among various fish groups; the same letters indicate no significant difference (P > 0.05) and the different letters indicate significant difference (P < 0.05)

以鳗弧菌M3感染牙鲆，感染后72 h内检测脾脏Hsp90 mRNA的表达水平变化。与注射生理盐水的对照组相比，感染组脾脏Hsp90α的表达量在6–12 h呈现下降(P < 0.05)，在24–72 h的表达量回升(P < 0.05)，在感染后的6–24 h的表达量低于对照组，表达量仅在72 h时高于对照组(图 5-A)。同样，感染组牙鲆脾脏Hsp90β的表达量在6–24 h呈现下降；在感染后的6–24 h的表达量低于对照组，在72 h表达量急剧上升(P < 0.05)(图 5-B)。鳗弧菌感染后，牙鲆脾脏Hsp90β的变化幅度比Hsp90α大。

图 1(Fig. 1)

图 5 牙鲆感染鳗弧菌后脾脏Hsp90 mRNA的表达水平 Figure 5 Relative expression of Hsp90 mRNA in the spleen of P. olivaceus infected with V. anguillarum *代表差异显著(P < 0.05) * presents significant difference(P < 0.05)

Hsp90的表达和分布在鱼类研究中已有较多的报道。在模式生物斑马鱼的研究中发现，Hsp90在脑、肝脏与肌肉中均有表达(Murtha et al, 2003)，在塞纳加尔鳎(Solea senegalensis)的心脏、骨骼肌、皮肤和胃等多个组织中也检测到Hsp90的表达(Manchado et al, 2008)。本研究检测不同发育时期牙鲆13个组织中Hsp90的表达情况，同样发现，Hsp90α和Hsp90β在牙鲆多个组织中均有表达，预示Hsp90在牙鲆的发育阶段及各部分组织中具有一定作用。Hsp90在不同组织的表达量有一定差异，Hsp90α在24月龄成年牙鲆的肠和头肾表达量较高，Hsp90β在脑、肠和脾脏中表达量较高，这与之前的研究报道相吻合(张俊玲等, 2010)，Hsp90在不同组织中的差异表达可能与组织的功能有关。

已有研究证明，Hsp90α主要为诱导型表达，而Hsp90β在大多数组织中主要为组成型表达(Millson et al, 2007)。本研究发现，相比较于Hsp90β的相对表达量，Hsp90α在各个组织中大多处于较低水平，Hsp90α在8月龄牙鲆的肝脏、鳃、背皮、肌肉和腹鳍相对表达量高于其他3组的同组织(P < 0.05)，Hsp90β在24月龄肌肉和腹鳍中高于其他3组的同组织，其他组织均在12月龄牙鲆中表现为高表达(P < 0.05)，整体呈现随体重增加而上升的趋势，说明Hsp90α和Hsp90β可能在不同的生长发育时期和细胞周期调控等生理过程中起作用(Sreedhar et al, 2004)。

热休克蛋白的产生体现了生物的进化，它可以提高生物体的适应能力，特别是耐热能力。Lindquist (1986)研究表明，HSPs的生成量与热耐受呈正相关。在草鱼(Ctenophryngodon idellus)(周鑫等, 2013)和鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)(Sathiyaa et al, 2001)的研究中，Hsp90同样随温度的升高而上调。本研究同样发现，在牙鲆的肝脏和脾脏组织中，Hsp90α mRNA表达量随温度的增高而增加，且反应迅速。经不同温度刺激后，牙鲆Hsp90α的表达水平迅速变化，在高温时变化幅度较Hsp90β明显，说明牙鲆Hsp90α的表达比Hsp90β更容易受高温的影响。通过10℃和28℃刺激发现，Hsp90α和Hsp90β mRNA表达量有所差异，在低温时Hsp90β mRNA的表达量高于Hsp90α的表达量，说明Hsp90β可能在低温时发挥不同的作用。

HSPs在鱼类免疫反应中发挥作用。例如，当虹鳟(Oncorhynchus mykiss)受到肾杆菌或鳗弧菌感染时，Hsp70表达升高(Forsyth et al, 1997; Ackerman et al, 2001)；当鲈鱼(Sparus sarba)受到藻胶弧菌感染时，Hsp70的表达量下降，而Hsp60和Hsp90的表达量不变(Deane et al, 2005)。本研究发现，当牙鲆受到鳗弧菌感染时，Hsp90α和Hsp90β的表达先缓慢下降，而后分别在感染后24 h、72 h升高，变化的趋势与之前的研究有所不同(Cha et al, 2013)，当牙鲆受到链球菌感染后6 h，包括Hsp90α和Hsp90β在内的多个HSPs基因的表达量升高，之后出现下降趋势。Hsp90可以识别病原模式分子(Pathogen-associated molecular pattern, PAMP)，参与宿主的先天性免疫反应(Colaco et al, 2013)。链球菌和鳗弧菌分别为革兰氏阳性和阴性菌，具有不同的PAMP分子，与牙鲆Hsp90存在不同的识别机制，这可能是导致两个结果存在差异的原因之一。

Hsp90广泛的生物学功能，在人类的抗氧化、抗衰老、抗损伤和抗肿瘤药物等多个领域受到广泛的关注(Eustace et al, 2004; Li et al, 2007)。然而，目前，水生动物HSPs的研究相对滞后。本研究系统分析了不同发育期牙鲆Hsp90在各组织中的表达差异，以及对温度、病原菌的应激反应，为更好地利用Hsp90提供了理论数据。