鲆鲽鱼类肉质鲜嫩，营养丰富，深受人们喜爱，是一类高价值水产品，在世界水产贸易中占有重要地位。中国是世界鲆鲽类养殖第一大国，养殖产量约占世界总产量的60%，养殖品种有大菱鲆(Scophthalmus maximus)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、大西洋牙鲆(Paralichthys dentatus)、漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)、石鲽(Platichthys bicoloratus)、圆斑星鲽(Verasper variegatus)、条斑星鲽(Verasper moseri)、星突江鲽(Platichthys stellatus)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)和欧鳎(Solea senegalensis)等10多个品种。其中，大菱鲆、牙鲆和半滑舌鳎是养殖量最大的3个品种，分别占主产区养殖总产量的63.7%，29.6%和5.0%。工厂化养殖是这3种鲆鲽鱼的主要养殖模式，约占养殖总产量的84.5% (国家鲆鲽类产业技术研发中心, 2010)。工厂化养殖条件下由于养殖密度较高，鲆鲽类较易感染迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、溶藻弧菌(Vibrio algino-laticus)、鱼肠道弧菌(Vibrio ichthyoenteri sp.nov.)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)等，从而引发多种细菌性疾病并迅速传播(张晓君, 2006¹⁾; 王印庚等, 2007; 陈晓凤等, 2008; 谭夕东, 2014)，严重威胁该养殖产业的健康、可持续发展。

1)张晓君.三种海水养殖鱼类的主要细菌性疾病研究.中国海洋大学硕士研究生学位论文, 2006, 22–149

恩诺沙星(Enrofloxacin)属于第三代喹诺酮类抗生素，能与细菌DNA回旋酶亚基A结合，阻止细菌DNA的复制，具有广谱抗菌活性和较强的组织分布特性，其代谢产物为环丙沙星(Ciprofloxacin)，亦有强大的抗菌活性。因其优良的临床抗菌效果，恩诺沙星在我国也早已成为防治鲆鲽类及其他水产养殖动物细菌病的常用药品(刘开永等, 2004)，但对其在水产品中的残留限量有严格要求，最高残留限量为50 μg/kg (中华人民共和国农业部, 2002)。恩诺沙星用于防治水产动物疾病时，通常按20–50 mg/kg的剂量拌饵投喂，每天1–2次，连续投喂3–5 d，并需要根据动物品种和病情适度调整用量(农业部《新编渔药手册》编撰委员会, 2005)。由于缺乏渔药基础理论研究及严格的临床用药处方制度，目前我国渔药的标签在动物种类、剂量等信息方面的标注还不够详细、明确。各类水产养殖业者在使用抗生素药物时存在较大的随意性，超量、超次数使用等标签外用药现象以及不同养殖品种都采用一个剂量等现象常有发生。这不仅容易诱发病原菌耐药性，也容易导致药物在养殖水产品中残留超标，严重影响水产品质量，威胁消费者的健康。虽然恩诺沙星在大西洋鲑(Salmo salar)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)、日本鳗鲡(Anguilla japonica)、眼斑拟石首鱼(Sciaenops ocellatus)及大菱鲆等水产动物体内的代谢和消除规律已有研究报道(Bowser et al, 1992; Stoffregen et al, 1997; 简纪常等, 2005; 房文红等, 2007; 张德云等, 2007; 李娜等, 2009)，但由于实验条件不同、实验动物规格各异，即使在同一种动物上的研究结果也存在明显差异，缺乏可比性。

本研究在相同实验条件下，选择相同规格的大菱鲆、牙鲆和半滑舌鳎，分别连续3 d灌胃给予恩诺沙星后，研究并比较了这3种鲆鲽鱼不同组织中药物的残留及消除规律，以期为我国鲆鲽类养殖生产中科学使用恩诺沙星防治疫病、制定合理的休药期、保障养殖水产品质量和安全提供参考依据。

健康的2龄大菱鲆、牙鲆和半滑舌鳎，体重为300–400 g/尾，分别饲养于山东海阳市黄海水产有限公司的43.2 m³ (6 m×6 m×1.2 m)水泥池中，60尾/池，水深为70 cm，流水、100 W气泵充气，盐度为31.7，pH为8.1，水温为(20±2)℃。实验期间，大菱鲆和牙鲆投喂升索牌专用配合饲料及冷冻杂鱼，半滑舌鳎投喂七好牌专用配合饲料，每日2次。

恩诺沙星标准品(纯度≥98.5%)购自Dr. Ehrenstorfer GmbH公司(Augsburg, 德国)；盐酸环丙沙星标准品购自中国食品药品检定研究院；拜有利^®(恩诺沙星注射液, 5 g/100 ml)由拜耳(四川)医药保健股份有限公司生产。乙腈为色谱纯，二氯甲烷、正己烷、85%磷酸、三乙胺为分析纯。

预先使用生理盐水将拜有利稀释5倍，配制成10 mg/ml的恩诺沙星工作液，经0.45 μm滤膜过滤后备用。给药时，按照10 mg/kg的剂量，使用1 ml无针头注射器将工作液灌入空腹24 h的实验鱼胃内。给药后静置3–5 s，放入水中，不出现回吐的实验鱼进行正式实验。每天1次，连续给药3 d。

分别于给药前(0 d)和给药后1、3、6、10、15、20、25、30、35、40 d采集样品，每个时间点采集4–6尾，于尾静脉抽取血液5 ml，置于预先涂有肝素钠的离心管中，4000 r/min，离心5 min，取上层血浆。然后，立即将鱼解剖，采集鱼的鳃、肝脏、肾脏、背部肌肉和皮肤，保存于样品袋中，样品袋按取样时间编号，–20℃冷冻保存。

样品处理及药物浓度测定参照Liang等(2012)的方法进行。血浆样品在室温下自然解冻后，取1.0 ml置于10 ml离心管中，加入4 ml乙腈，漩涡振荡60 s，静置2 h，4000 r/min离心10 min，取上清液，40℃恒温水浴下氮气吹干，残渣用1 ml流动相(乙腈和磷酸混合液，详细说明见色谱条件部分)溶解，10000 r/min离心5 min，经0.22 μm滤膜过滤后，使用高效液相色谱(HPLC)法测定。

其他组织样品(肌肉、鳃、肝脏和肾脏)在室温下自然解冻后，准确称取1 g组织，加人2 ml乙腈，8000 r/min匀浆20 s；再用2 ml乙腈清洗刀头，合并两次液体，漩涡振荡10 s，静置2 h，5000 r/min离心10 min，取上清液，在40℃恒温水浴下氮气吹干，残渣用1 ml流动相溶解，加入2 ml正己烷去除脂肪，下层液经0.22 μm滤膜过滤后，用HPLC法测定。

色谱条件：Agilent1200型高效液相色谱仪包括在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱和荧光检测器。色谱柱为C₁₈分析柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，柱温为30℃，流动相为乙腈和磷酸(0.0l mol/L，pH 3.4)按17︰83的体积比混合，荧光检测器的激发波长为278 nm，发射波长为460 nm，流速为1.0 ml/min，进样量为20 μl。

浓度-时间数据采用Excel软件(Microsoft, 美国)进行拟合和计算，恩诺沙星在大菱鲆、牙鲆和半滑舌鳎体内按一级动力学消除，浓度变化可由指数消除公式描述：

式中，C_t为经过一定时间后的血药浓度，C₀为初始血药浓度，t为时间，β为消除速率常数，e为自然对数。

计算消除半衰期(t_l/2)采用公式：

根据规定的最高残留限量(MRL)，计算各组织药物浓度降至规定水平所需时间：

3种鲆鲽鱼组织中恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星的浓度检测，采用本实验室已建立的高效液相色谱检测法。该方法的最低检测限为0.01 μg/ml，恩诺沙星和环丙沙星在各组织中的回收率均在80%以上，可以满足残留检测实验要求(Liang et al, 2012)。

以10 mg/kg的剂量，分别给大菱鲆、牙鲆和半滑舌鳎连续3 d经口灌服恩诺沙星后，组织中的恩诺沙星浓度变化情况如图 1所示。给药后1 d，大菱鲆血浆、肌肉、鳃、肝、肾中的浓度分别为(6.14±0.50) μg/ml、(10.21±2.20)、(18.24±11.90)、(9.33±1.87)、(30.11±10.65)μg/g；牙鲆血浆、肌肉、鳃、肝、肾中的恩诺沙星浓度分别为(5.97±0.95) μg/ml、(7.77±3.21)、(7.67±1.01)、(6.49±1.40)、(245.95±281.74) μg/g；半滑舌鳎血浆、肌肉、鳃、肝、肾中的恩诺沙星浓度分别为(3.67±1.12) μg/ml、(5.99±0.81)、(6.60±1.18)、(4.77±1.33)、(14.69±6.42) μg/g。给药后20 d，大菱鲆血浆、肌肉、鳃、肝、肾中的恩诺沙星浓度分别降至(0.33±0.26) μg/ml、(0.41±0.26)、(0.83±0.69)、(0.06±0.05)、(1.98±1.63) μg/g；牙鲆血浆、肌肉、鳃、肝、肾中的恩诺沙星浓度分别降至(0.05±0.11) μg/ml、(0.16±0.15)、(0.25±0.38)、(0.03±0.02)、(2.09±2.52) μg/g；半滑舌鳎血浆、肌肉、鳃、肝、肾中的浓度分别降至(2.18±1.49) μg/ml、(0.34±0.15)、(0.87±0.48)、(0.09±0.05)、(3.30±2.79) μg/g。给药后35 d，除半滑舌鳎的鳃和肾组织中浓度仍高于0.10 μg/g外，3种鲆鲽鱼大部分组织中的恩诺沙星浓度降至0.10 μg/g以下或未检出。

图 1(Fig. 1)

图 1 口服给药3 d后大菱鲆(a)、牙鲆(b)和半滑舌鳎(c)组织中的恩诺沙星浓度 Figure 1 Concentrations of enrofloxacin in tissues of S. maximus, P. olivaceus and C. semilaevis 3 days after oral administration a：大菱鲆；b：牙鲆；c：半滑舌鳎 a: S. maximus; b: P. olivaceus; c: C. semilaevis

不同组织间进行比较显示，大菱鲆、牙鲆和半滑舌鳎的肾组织恩诺沙星浓度在给药后1 d均为最高，且牙鲆的肾组织恩诺沙星浓度远高于大菱鲆和半滑舌鳎，约是大菱鲆的8倍，半滑舌鳎的17倍，此后，除30 d时半滑舌鳎肾组织恩诺沙星浓度略低于鳃组织外，其余各采样时间点3种鲆鲽鱼肾组织中恩诺沙星浓度均高于其他组织。由此可见，鲆鲽鱼肾组织富集恩诺沙星的能力较强。

恩诺沙星在3种鲆鲽鱼组织中的残留浓度变化适于指数消除曲线来描述，即其浓度变化符合公式，具体的消除曲线方程和参数见表 1。经计算，大菱鲆血浆、肌肉、鳃、肝和肾中恩诺沙星的消除半衰期分别为3.94、5.59、4.36、2.71、6.54 d，牙鲆血浆、肌肉、鳃、肝和肾中恩诺沙星的消除半衰期分别为2.89、4.10、4.13、2.31、3.75 d，而半滑舌鳎血浆、肌肉、鳃、肝和肾中恩诺沙星的消除半衰期分别为9.36、5.97、9.36、3.50、7.37 d。连续3 d经口灌服恩诺沙星后，3种鲆鲽鱼的血浆和组织中均能检出其代谢产物环丙沙星，但浓度较低。血浆中环丙沙星的浓度变化情况见表 2。由表 2可知，大菱鲆、牙鲆和半滑舌鳎血浆环丙沙星浓度均在给药后1 d最高，分别为0.12、0.13、0.09 μg/ml，之后逐渐降低，并分别于15、20、30 d时降至检测限以下。

表 1(Tab. 1)

表 1 大菱鲆、牙鲆和半滑舌鳎组织中恩诺沙星的消除曲线方程和参数 Table 1 Equations and associated indices of enrofloxacin elimination in tissues of S. maximus, P. olivaceus and C. semilaevis 物种Species 组织Tissues 消除曲线方程Elimination equation 消除半衰期t1/2 (d) 相关系数r2     大菱鲆 S. maximus     血浆Plasma ${C_t} = 6.621\;{e^{ - 0.176t}}$ 3.94 0.9819          肌肉Muscle ${C_t} = 3.288\;{e^{ - 0.124t}}$ 5.59 0.8369          鳃Gill ${C_t} = 11.815\;{e^{ - 0.159t}}$ 4.36 0.9024          肝Liver ${C_t} = 9.063\;{e^{ - 0.256t}}$ 2.71 0.9793          肾Kidney ${C_t} = 15.287\;{e^{ - 0.106t}}$ 6.54 0.8687         牙鲆 P. olivaceus     血浆Plasma ${C_t} = 10.015\;{e^{ - 0.24t}}$ 2.89 0.9725          肌肉Muscle ${C_t} = 7.296\;{e^{ - 0.169t}}$ 4.10 0.9632          鳃Gill ${C_t} = 7.475\;{e^{ - 0.168t}}$ 4.13 0.9315          肝Liver ${C_t} = 12.307\;{e^{ - 0.3t}}$ 2.31 0.9877          肾Kidney ${C_t} = 152.060\;{e^{ - 0.185t}}$ 3.75 0.9529     半滑舌鳎 C. semilaevis     血浆Plasma ${C_t} = 4.400\;{e^{ - 0.074t}}$ 9.36 0.6892          肌肉Muscle ${C_t} = 2.834\;{e^{ - 0.116t}}$ 5.97 0.8707          鳃Gill ${C_t} = 4.575\;{e^{ - 0.074t}}$ 9.36 0.9302          肝Liver ${C_t} = 7.098\;{e^{ - 0.198t}}$ 3.50 0.9629          肾Kidney ${C_t} = 11.916\;{e^{ - 0.094t}}$ 7.37 0.8241

表 1 大菱鲆、牙鲆和半滑舌鳎组织中恩诺沙星的消除曲线方程和参数 Table 1 Equations and associated indices of enrofloxacin elimination in tissues of S. maximus, P. olivaceus and C. semilaevis

表 2(Tab. 2)

表 2 大菱鲆、牙鲆和半滑舌鳎血浆中环丙沙星的浓度 Table 2 Concentrations of ciprofloxacin in plasma of S. maximus, P. olivaceus and C. semilaevis (μg/ml) 物种Species 给药后时间Time post drug administration (d) 1 3 6 10 15 20 25 30 35 大菱鲆S. maximus 0.12±0.02 0.05±0.02 0.01±0.01 0.01±0.02 ND ND ND ND ND 牙鲆P. olivaceus 0.13±0.04 0.13±0.09 0.05±0.04 0.01±0.01 0.02±0.02 ND ND ND ND 半滑舌鳎C. semilaevis 0.09±0.07 0.09±0.02 0.04±0.04 0.04±0.02 0.09±0.06 0.03±0.05 0.02±0.01 ND ND     ND表示未检测到     ND: Not detected

表 2 大菱鲆、牙鲆和半滑舌鳎血浆中环丙沙星的浓度 Table 2 Concentrations of ciprofloxacin in plasma of S. maximus, P. olivaceus and C. semilaevis (μg/ml)

药物在动物体内发生代谢反应的类型和程度不尽相同，恩诺沙星主要是通过脱去乙基代谢成具有活性作用的环丙沙星(Tyczkowska et al, 1989; 曾振灵等, 1996)。Bowser等(1992)研究恩诺沙星在虹鳟鱼体内的代谢时发现，口服给药的方式下恩诺沙星的吸收和消除都较慢。本研究采取口灌给药的方式给予3种鲆鲽鱼恩诺沙星后，恩诺沙星在各组织中的残留浓度随时间延长均出现递减的趋势。

肾脏是鱼类的重要排泄器官，恩诺沙星在胃酸作用下溶解消化，在小肠被吸收进入血液循环系统，最终绝大部分以原药形式经肾排出体外(朱秋华等, 2001)。Liang等(2012)在10、16℃两种温度条件下以10 mg/g的剂量给大菱鲆单次口灌恩诺沙星后，恩诺沙星在大菱鲆肾中的残留较多，停药72 h时的残留浓度分别为1.89、1.03 μg/g。Stoffregen等(1997)研究了动脉注射、腹腔注射、肌肉注射和口灌等多种给药方式下恩诺沙星在大西洋鲑体内的代谢动力学，其肾中的药物浓度均高于血浆、肌肉、皮、肝、鳃和脑等其他组织。国内学者研究另一种常用喹诺酮类药物诺氟沙星在大菱鲆(曲晓荣等, 2007)、牙鲆(刘秀红等, 2003)体内的残留消除规律，发现诺氟沙星在大菱鲆和牙鲆肾中的残留也较其他组织明显，停药30 d时仍有残留。这些研究结果均与本研究相似，说明鱼类肾脏是喹诺酮药物残留量较高的组织。本研究中，恩诺沙星在3种鲆鲽鱼肾中的消除半衰期依次为半滑舌鳎(7.37 d)＞大菱鲆(6.54 d)＞牙鲆(3.75 d)。由此可见，恩诺沙星在3种鲆鲽鱼肾中的残留消除规律也不尽相同，牙鲆消除最快，大菱鲆次之，半滑舌鳎最慢，存在较明显的种属差异。

给3种鲆鲽鱼连续3 d口灌恩诺沙星后，血浆中恩诺沙星的浓度均逐渐下降，至给药后20 d，3种鱼的血药浓度大小依次为半滑舌鳎＞大菱鲆＞牙鲆，恩诺沙星在半滑舌鳎血液中残留时间最长。此外，在3种鲆鲽鱼血浆和组织中均可检测到恩诺沙星的代谢产物环丙沙星，但其浓度较低，作者推测恩诺沙星在鲆鲽鱼体内的代谢方式有可能与哺乳动物相似，主要是发生脱乙基反应，生成环丙沙星，但代谢程度却远低于哺乳动物，这还有待于进一步的研究验证。由表 2可知，恩诺沙星的代谢产物环丙沙星在大菱鲆体内消除最快，停药后15 d已检测不到，其次是牙鲆，而半滑舌鳎则最慢，直到停药后30 d时才未检出。本研究中，恩诺沙星在大菱鲆、牙鲆和半滑舌鳎血液中的消除比其代谢物环丙沙星慢，这与王洪艳等(2014)的研究结果一致。

消除半衰期是决定药物消除速率的重要指标(邓树海, 1992)。比较各组织中恩诺沙星的消除半衰期，大菱鲆依次是肾(6.54 d)＞肌肉(5.59 d)＞鳃(4.36 d)＞血浆(3.94 d)＞肝(2.71 d)；牙鲆依次是鳃(4.13 d)＞肌肉(4.10 d)＞肾(3.75 d)＞血浆(2.89 d)＞肝(2.31 d)；半滑舌鳎依次是血浆(9.36 d)=鳃(9.36 d)＞肾(7.37 d)＞肌肉(5.97 d)＞肝(3.50 d)。恩诺沙星在3种鱼的肝组织中消除速率快于其他各组织，消除半衰期也最短，这可能与肝脏是药物代谢的主要器官有关。3种鱼之间进行比较，牙鲆各组织中恩诺沙星的消除速率略快于大菱鲆，而半滑舌鳎则明显较牙鲆和大菱鲆慢。据报道，恩诺沙星在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)和大西洋鲑肌肉中的消除半衰期仅为30.3 h和34.2 h (赵海军等, 2010; Martinsen et al, 1995)。

恩诺沙星的抗菌谱广，具有很强的渗透性，口服生物利用度较高，能广泛分布于组织中，在水产养殖中有较好的应用效果。我国农业行业标准NY5070– 2002(中华人民共和国农业部, 2002)对无公害水产品中渔药的残留限量做出了明确规定。其中，喹诺酮类药物恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星的最高残留限量均为50 μg/kg。依据此标准，为保证养殖鲆鲽鱼上市时肌肉等可食性组织中的药残安全达标，建议在20℃水温条件下使用恩诺沙星防治鲆鲽鱼细菌性疾病时的休药期为大菱鲆44 d、牙鲆33 d、半滑舌鳎47 d以上。