水母毒素是目前已知的最毒的海洋生物毒素之一，其毒性是海蛇(Pelamis platuras)毒素的250倍，是河豚毒素的450倍(于华华等，2003)。水母毒素的研究始于20世纪60年代，但因获取困难、稳定性差等因素导致对水母毒素的研究明显滞后于蜂毒、蛇毒、蝎毒。水母毒素成分复杂，既含有能够溶解细胞、具有细胞毒性的多肽、酶类等，又含有一些非蛋白类小分子物质，具有广泛的生物学活性(Martins et al，2009)。磷脂酶A₂(Phospholipase A₂，PLA₂)是水母毒素中含量较为丰富的组分之一，能催化甘油磷脂第2位脂酰键的水解生成溶血磷脂和脂肪酸，参与磷脂的代谢(Glaser et al，1993; Nevalainen et al，2004a、b; Sher et al，2005)，具有神经毒性、肌肉毒性、酶活性等多种生物活性。PLA₂最先发现于哺乳动物胰液中，随后被发现广泛存在于昆虫、软体动物、蛇和海洋无脊椎动物的毒液中(Nevalainen et al，2004a、b; Razpotnik et al，2010)。根据生物来源、分子量、氨基酸序列同源性、Ca²⁺是否依赖性以及生理功能等特性的不同，PLA₂可以大致分为4类：分泌型PLA₂(Secreted phospholipase A₂; sPLA₂)、胞质型PLA₂(Cytoplasmic phospholipase A₂; cPLA₂)、胞内型PLA₂(Intracellular phospholipase A₂; iPLA₂)和PAF(血小板激活因子)- PLA₂(Feng et al，2002)。

海蜇(Rhopilema esculentum)隶属于刺胞动物门、钵水母纲、根口水母目、海蜇属，作为一种大型的可食用经济水母，在我国海洋渔业中占有重要地位。海蜇基础生物学研究深入，人工繁育、增养殖技术成熟，是研究水母毒素组成、结构和功能的理想模式生物。本研究采用转录组454 GS FLX测序和RACE技术，首次解析了海蜇Re-PLA₂-1基因的cDNA和基因组结构，分析了其mRNA在海蜇不同发育阶段的表达，这些研究结果将为进一步了解海蜇磷脂酶A₂毒素的生物功能奠定基础。

海蜇转录组的构建、454 GS FLX测序与分析见周春娅等(2013)。利用生物信息学方法检索海蜇转录组文库，寻找与已知PLA₂基因同源的EST序列。

生物信息学分析发现，海蜇EST_{(isotig15581)}与僧袍芋螺(Conus magus)的PLA₂基因具有高度的相似性。根据EST_{(isotig15581)}序列，设计特异性引物Re-PLA₂-1 F1和Re-PLA₂-1 R1扩增海蜇Re-PLA₂-1 cDNA全长(表 1)。3ʹ-RACE使用pBluescript SK(+/-)载体上的通用引物T7与Re-PLA₂-1 F1，5ʹ-RACE使用载体通用引物T3与Re-PLA₂-1 R1。PCR反应程序为94℃ 5 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，33个循环；72℃ 10 min。PCR产物经琼脂糖电泳检测后胶回收、连接、转化，获得的阳性重组子经菌落PCR验证后送上海鼎安生物科技有限公司测序。

表 1(Tab. 1)

表 1 引物序列 Table 1 Oligonucleotide primers used in this study 引物名称Name of primer 序列Sequence(5'-3') 用途 Application Re-PLA2-1 F1 CAAGATGCAGACATACAAGGGAG 3'Race/genome PCR Re-PLA2-1 R1 TCTAGTCCAGCCATAGCGATT 5'Race Race/genome PCR Re-PLA2-1 F2 TAGGGTGTTTCATTGGTGGTGT Genome PCR Re-PLA2-1 R2 TCTGTTGTTGTATCTGTCGGTGC Genome PCR Re-PLA2-1 F3 TATGTGGAAATCGCTATGGCT Genome PCR Re-PLA2-1 R3 TCTCCACGAATAAAAGGCCAT Genome PCR Re-PLA2-1 F4 CTATTTGGAACGGCATAACGG Genome PCR Re-PLA2-1 R4 CTTTGCACCATTCTGGAGAGC Genome PCR Re-PLA2-1 F5 AGTTACTTTGTTTCAAGCTCTCC Genome PCR Re-PLA2-1 R5 GCTATATTTCTGTCGTCTTCTGTTC Genome PCR Re-PLA2-1 F ACTAACTCAAACTTACGAAAGCGAC RT-PCR Re-PLA2-1 R ACGCACGGTTTGATAGTAGGC RT-PCR β-Actin F AACTGGGACGATATGGAGAAGA β-Actin PCR β-Actin R CGACCAGAGGCGTACAATGAG β-Actin PCR T7 GTAATACGACTCACTATAGGGC 3'Race-PCR T3 AATTAACCCTCACTAAAGGG 5'Race-PCR

表 1 引物序列 Table 1 Oligonucleotide primers used in this study

海蜇于2015年 8月采自青岛沙子口。液氮保存返回实验室后，采用酚-氯仿法提取基因组 DNA：取约100 mg海蜇伞径进行液氮研磨，然后加入400 ml的DNA提取液[其中，Tris-HCl(pH为8.0)100 mmol/L，EDTA(pH为8.0)100 mmol/L，1% SDS 50 ml，20 mg/ml蛋白酶K8 ml]，充分混匀，55℃水浴40 min。待裂解完全后，加入等体积的酚-氯仿试剂，静置10min，12000 r/min离心15 min，去除上清液。再加入0.6体积的异丙醇静置7min，12000 r/min离心10 min，除去上清液。然后加入400 ml预冷无水乙醇，沉淀DNA约30 min后，用70%乙醇洗涤沉淀2次，自然干燥后，加入20 ml超纯水溶解。提取的DNA经1.5%琼脂糖电泳进行检测。

根据Re-PLA₂-1 cDNA全长设计5对特异性引物进行基因组序列扩增(表 1)。

利用Trizol法分别提取海蜇4个不同发育阶段：螅状体(Scyphistoma)、横裂体(Strobila)、碟状体(Ephyra)、水母体(Medusa)的总RNA，然后反转录分别合成cDNA，反应体系及反应条件按说明书要求操作(Invitrogen，美国)。

采用实时荧光定量PCR方法，检测Re-PLA₂-1在螅状体、横裂体、碟状体和水母体的表达，相关引物见表 1。RT-PCR反应在ABI 7500 Real-time PCR system(Applied Biosystems)上进行。PCR反应体系和流程参照SYBR^® Premix Ex Taq^TM Ⅱ试剂盒操作说明(TaKaRa)。样品和内参分别设3个重复。反应结束后，采用2^-ΔΔCt法和SPSS 18.0统计软件进行数据分析和统计。

用EditSeq和DNAStar软件对DNA序列和推测的氨基酸序列进行生物信息学分析；用Bioedit软件对所获得的测序结果序列进行全长拼接；ORF Finder在线程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)预测开放阅读框，并获得编码的氨基酸序列；用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)及SingalP 4.1信号肽预测(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)软件对海蜇Re-PLA₂-1进行蛋白结构域分析及信号肽预测；用ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)进行Re-PLA₂-1与其他物种PLA₂氨基酸序列的多序列比对。根据多序列比对结果，用Mega 4.1采用邻接法(Neighbor-joining)构建PLA₂的系统进化树(Tamura et al，2007)。

将3ʹ-RACE和5ʹ-RACE 获得的序列与EST_{(isotig15581)}序列进行拼接，获得海蜇Re-PLA₂-1基因的 cDNA全长序列。Re-PLA₂-1的cDNA全长序列为824 bp，包括48 bp的5ʹ非编码区(5ʹUTR)、504 bp的开放阅读框(ORF)以及272 bp的3ʹ非翻译区(3ʹUTR)，其中，3ʹUTR包括一个多腺苷酸Poly(A)尾和一个多腺苷酸化加尾信号AATAAA(图 1)。Re-PLA₂-1为分泌蛋白，信号肽由19个氨基酸组成，酶切后的成熟肽预测的分子量和理论等电点分别为18.93 kDa和7.79。

图 1(Fig. 1)

图 1 海蜇Re-PLA2-1基因全长cDNA及推测的氨基酸序列 Figure 1 Full-length Re-PLA2-1 cDNA of R. esculentum and the deduced amino acid sequence 注：下划实线表示信号肽；终止密码子用*标出；方框表示多聚腺苷酸加尾信号；3个内含子插入位点用Y标出 Note: The putative signal peptide was underlined. The asterisk(*)indicated the stop codon and the classical polyadenylation signal was enclosed in a box. The arrow(Y)marked the insertion site of three introns

BLAST分析发现，预测的海蜇Re-PLA₂-1与僧袍芋螺的PLA₂氨基酸序列相似性为41%，与刺胞动物门星状海葵(Nematostella vectensis)的PLA₂氨基酸序列Nv10-Nv12的相似性在32%-34%之间。多序列比对发现，Ca²⁺结合位点和组氨酸-天冬氨酸催化位点在所有PLA₂ pfam09056成员推测的保守结构域严格保守(图 2)。

图 1(Fig. 1)

图 2 海蜇Re-PLA2-1与其他pfam09056家族PLA2s结构域氨基酸多序列比对 Figure 2 Multiple sequence alignment between R. esculentum Re-PLA2-1 and PLA2s from other species 注: 黑色表示相同氨基酸，灰色表示相似氨基酸；*和#分别表示PLA2结构域的Ca2+结合位点和组氨酸-天冬氨酸催化位点 Note: The black shadowing showed identical amino acids and the gray shadowing indicated similar amino acids. The asterisk(*)and pound sign(#)indicatd a calcium-binding site and the His-Asp catalytic active sites of a PLA2 domain respectively

选择来自不同物种的pfam09056家族的PLA₂结构域，应用MEGA 4.1程序，采用邻接法构建系统进化树见图 3。从图 3可以看出，Re-PLA₂-1与僧袍芋螺、星状海葵、长牡蛎(Crassostrea gigas)毒素PLA₂聚为GⅨ PLA₂一支，与GXⅢ、GXⅡ PLA₂共聚为pfam-collection，而其他家族共聚为cd-collection。

图 1(Fig. 1)

图 3 基于邻接法的PLA2 氨基酸序列的系统进化树 Figure 3 Phylogenetic tree of PLA2 based on neighbor-joining method

利用5对特异性引物扩增获得了5段首尾重叠的Re-PLA₂-1基因组片段，将这些片段拼接获得了全长为2671 bp的RePLA₂基因组序列。利用NCBI上Splign内含子在线分析工具将Re-PLA₂-1的cDNA与基因组序列进行比对分析。结果显示，Re-PLA₂-1基因组包含4个外显子和3个内含子(表 2、图 4)。4个外显子大小在39-388 bp之间，3个内含子大小分别为1003 bp、616 bp、494 bp。内含子的A+T含量在62.15%-67.60%之间，而外显子的A+T含量在53.46%-61.08%之间，明显高于外显子。预测的PLA₂结构域活性中心“组氨酸-天冬氨酸”(HD)二聚体和Ca²⁺结合位点天冬氨酸(D)被第2个内含子分隔在第2、3外显子中。所有内含子-外显子边界均符合“AT-CG”剪切规则，按照内含子分型原则，内含子类型分别属于0型和1型(表 2)。

表 2(Tab. 2)

表 2 Re-PLA2-1内含子/外显子长度、剪切位点及内含子类型 Table 2 Intron/exon lengths，splice junctions，and intron types of Re-PLA2-1 外显子 Exon 外显子长度 Length of exon(bp) 剪切位点Splice junction 内含子长度 Length of intron(bp) 内含子类型 Type of intron 3' 5' 1 -39 - GAGgtaagt 1003 - 2 180 ttgaagGTT TGCgtacgt 616 0 3 217 ttttagGGT CGGgtaggt 494 1 4 388 tttcagGAG - - -

表 2 Re-PLA2-1内含子/外显子长度、剪切位点及内含子类型 Table 2 Intron/exon lengths，splice junctions，and intron types of Re-PLA2-1

图 1(Fig. 1)

图 4 海蜇Re-PLA2-1 基因组结构分布 Figure 4 Genomic organization of R. esculentum Re-PLA2-1 注: 黑色方块代表外显子，黑色粗线代表内含子；数字代表外显子和内含子的位置和大小(bp)

采用实时荧光定量PCR技术分析了Re-PLA₂-1 mRNA在海蜇不同发育阶段的表达见图 5。从图 5可以看出，Re-PLA₂-1基因在海蜇的螅状体、横裂体、碟状体和稚水母4个发育阶段均有表达，但存在着明显的表达差异。其中，横裂体阶段表达量最高，碟状体阶段表达量最低，横裂体、螅状体和水母体阶段的表达分别为碟状体阶段表达的12.2、7.6和5.5倍。

图 1(Fig. 1)

图 5 Re-PLA2-1在海蜇不同发育阶段的表达 Figure 5 The expression of Re-PLA2-1 mRNA in different developmental stages ofR. esculentum ** 为差异极显著 ** were considered to be extremely significant differences

分泌型磷脂酶(sPLA₂s)是一类分子量小(14-17 kDa)、由二硫键连接的分泌蛋白，其催化活性依赖于微摩尔的Ca²⁺存在。根据分子结构的差异，sPLA₂s可以分成15个组(Groups，G)和许多亚组(Sub-Groups)(Six et al，2000)。近年来，Nevalainen等(2012)、Punta等(2011)根据保守结构域将sPLA₂s分成cd-collection和pfam- collection两大类群。sPLA₂s家族在进化上出现较早，从低等微生物到高等脊椎动物均有发现，尽管氨基酸序列差异较大，但Ca²⁺结合环、催化活性位点在不同家族sPLA₂s都严格保守，这说明sPLA₂s在不同生物的生命过程中都起关键作用(Nevalainen et al，2012)。

海蜇Re-PLA₂-1具有sPLA₂s的典型特征：磷脂酶Pfam09056家族严格保守的Ca²⁺结合位点和催化活性中心“HD”二聚体(图 3)。多序列比对和系统进化分析结果都表明，Re-PLA₂-1不但与僧袍芋螺PLA₂具有较高的相似性(41%)，而且与僧袍芋螺、长牡蛎、水螅等聚类于GⅨ一簇，说明Re-PLA₂-1也是pfam09056 GⅨ PLA₂家族成员之一。目前，在僧袍芋螺中发现的磷脂酶A₂是唯一确定的pfam09056 GIX PLA₂s的成员，但其三维结构还未见报道(McIntosh et al，1995; Nevalainen et al，2013)。因此，GⅨ家族磷脂酶Ca²⁺结合及催化活性中心结构域均基于已知三维结构的紫红链霉菌(Streptomyyce violaceoruber)pfam09056 GIV PLA₂s进行预测(Sugiyama et al，2002)。紫红链霉菌PLA₂s N端天冬氨酸(Asp)和亮氨酸(Leu)共同参与Ca²⁺的结合，而刺胞动物PLA₂s则衍变为天冬酰胺(A sn)和甘氨酸(Gly)，这一变化的具体生物学意义目前还不清楚(Nevalainen et al，2012)。Re- PLA₂-1含有11个半胱氨酸(Cys)，能形成5对二硫键。在以“HD”二聚体为核心的催化位点具有GⅨPLA₂ pfam09056家族成员保守氨基酸序列(ala/ ser-Cys-X-X-His-Asp-X-Cys-Tyr-X-Cys)的特征，其中，Ca²⁺结合结构域缺失，Ca²⁺的结合可能也是由N端的Asn和Gly共同介导完成的(Nevalainen et al，2012)

sPLA₂在动物中广泛存在，但不同种类的sPLA₂基因组结构差异明显。人的GⅡA磷脂酶A₂基因组中均含5个外显子4个内含子(Seilhamer et al，1989)，而GⅠB磷脂酶的基因组中却含有4个外显子和3个内含子(Jeyaseelan et al，2000)。同时，同一家族的sPLA₂在不同物种中其基因组结构也不相同。蜜蜂(Apis mellifera)和蝎子(Anuroctonus phaiodactylus)的GⅢ磷脂酶的基因组均含有4个外显子，人的则有7个外显子，而果蝇(Drosophila melanogaster)的GⅢ磷脂酶A₂具有2-6个不等的外显子个数(Valdez-Cruz et al，2007; Xin et al，2009)。海蜇Re-PLA₂-1与GⅠB磷脂酶基因组结构相似，均具有4个外显子和3个内含子，说明海蜇Re-PLA₂-1可能具有某些与GⅠ磷脂酶相似的基因组进化方式(Jeyaseelan et al，2000)。

PLA₂s种类众多，其表达模式和分布随着发育过程发生改变。小鼠(Muroidea sp.)的GⅠB、GⅡA、GⅡD、GⅡE、GⅡF、GⅤ和GⅩ sPLA₂s在其胃肠道中均有表达，但在其他组织中分布不同(Eerola et al，2006)。意大利蜂毒PLA₂的表达随其日龄和季节发生而变化，如其羽化早期毒囊内表达量很低，羽化后的8-10 d表达量急剧增加，并在随后的成年期保持不变(Owen et al，1990)。本研究发现，Re-PLA₂-1在海蜇生活史各时期均有表达，其中，横裂体阶段表达量最高，碟状体表达量最低，2个阶段的表达量相差高达12倍。不同发育阶段Re-PLA₂-1的表达差异可能与海蜇在不同发育阶段的摄食方式有关。研究表明，海蜇不同发育阶段具有不同的摄食方式，螅状体依靠触手捕获食物，碟状体依靠缘瓣捕获食物，而水母体则依靠口腕和肩板表面上的吸口完成(刘春洋等，2011)。而利用免疫组化的方法定位地中海水母磷脂酶毒素的分泌部位发现，其磷脂酶毒素是由刺丝囊分泌的(Sher et al，2005)，而刺丝囊素作为水母的捕食和防御的重要武器，在其生活史的不同发育阶段均具有重要作用。因此，海蜇Re-PLA₂-1尽管在不同发育阶段的表达模式不同，但均在海蜇捕食、防御和食物消化中具有重要作用。