南极磷虾(Antarctic krill)广泛分布于南极海域，其生殖能力极强，是全球单一物种蕴藏量最大的生物资源(Ross et al，1986)。南极磷虾直接干燥获得的南极磷虾粉是一种优质蛋白源，富含不饱和脂肪酸、磷脂和虾青素。其中，不饱和脂肪酸是海水鱼的必需脂肪酸(Li et al，2005)，磷脂是仔鱼生长发育过程中最先分解代谢的营养物质(Rainuzzo et al，1997)，虾青素的抗氧化活性远远超过现有的其他抗氧化剂(Britton et al，1995)，它能够保护大黄鱼(Larimichthys crocea)冷冻损伤的精细胞(陈海敏等，2012)，从而提高精子活力(Lignell et al，2002)，并且能够显著提高鱼类繁殖性能(Vassallo-Agius et al，2001)。另外，南极磷虾粉中的牛磺酸和风味氨基酸能刺激鱼类摄食、促进鱼类生长，是一种良好的诱食剂(赵红月等，2010; 陈超等，2012)。

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)俗称牛舌头，生长迅速，出肉率高，是我国北方传统的名贵鱼类(李思忠等，1995)。在自然海域中，半滑舌鳎雌雄个体差异大，雄鱼数量少且性腺不发达，所以自身繁殖能力很弱(庄志猛，2006 )¹⁾。亲鱼饲料的营养质量不仅影响其繁殖性能，还对卵子及仔稚鱼质量具有重要影响(Izquierdo et al，2001; Li et al，2005; 常青等，2002)，而半滑舌鳎亲鱼营养需求的研究工作才刚刚起步(赵敏等，2015; Liang et al，2014; 肖登元等，2014; 吕庆凯等，2013)，实际生产中仍然主要以冰鲜杂鱼或养成阶段的配合饲料来投喂亲鱼，还没有半滑舌鳎亲鱼的特制饵料。

1) 庄志猛. 半滑舌鳎早期发育生物学与种质资源研究. 中国海洋大学博士研究生学位论文, 2006

本研究是在基础饲料中添加不同水平的南极磷虾粉，探究南极磷虾粉对半滑舌鳎亲鱼繁殖性能及抗氧化功能的影响，以期为半滑舌鳎亲鱼的人工配合饲料的研发积累资料。

实验饲料配方及营养组成如表 1所示，以鱼粉、酪蛋白、南极磷虾粉和高筋粉为蛋白源，以鱼油和豆油为脂肪源，在基础饲料中添加0、10%、20%的南极磷虾粉配置3种等氮、等脂的实验饲料(对照组K-0、K-10、K-20)，调节鱼粉和高筋粉比例，保证蛋白含量一致，调节鱼油比例，保证脂肪含量一致，低温烘干后冷冻保存备用。南极磷虾粉购自辽宁远洋渔业有限公司，鱼粉购自七好生物科技有限公司。

表 1(Tab. 1)

表 1 实验饲料配方及营养组成(%干物质) Table 1 Diet formulation and proximate composition (% in dry matter) 成分组成 Ingredients 实验组 Experimental groups K-0 K-10 K-20 鱼粉Fish meal 70.0 62.0 54.0 酪蛋白Casein 5 5 5 南极磷虾粉Antarctic krill meal 0 10 20 高筋粉Wheat gluten meal 11.0 10.0 9.0 鱼油Fish oil 7.0 6.0 5.0 大豆油Soybean oil 1.0 1.0 1.0 大豆卵磷脂Soybean phospholipid 2.0 2.0 2.0 胆碱Choline 1.0 1.0 1.0 CaH2PO4 1.5 1.5 1.5 维生素C Vitamin C 0.5 0.5 0.5 1维生素混合料Vitamin mix 0.5 0.5 0.5 2矿物质混合料Mineral mix 0.5 0.5 0.5 营养成分Proximate composition(% DM) 粗蛋白Crude protein 55.3 55.3 55.6 脂肪Lipid 14.2 14.1 14.5 灰分Ash 12.7 12.4 12.3 总虾青素Total astaxanthin(mg/kg) 42.8 70.5 114.7 注：1维生素混合料(mg/kg or g/kg 饲料)：维生素A，32 mg；核黄素，45 mg；维生素，B12；0.1 mg生物素，1.20 mg；维生素D，5 mg；维生素K3，10 mg；盐酸吡哆醇，20 mg；维生素E，120 mg；肌醇，800 mg；烟酸，200 mg；硫胺素，25 mg；叶酸，20 mg；泛酸，60 mg；次粉18.67 g 2矿物质混合料(mg/kg or g/kg饲料)：氟化钠，2 mg；沸石粉，15.51 g；硫酸镁，1200 mg；硫酸锌，50 mg；氯化钴，50 mg；硫酸铜，10 mg；磷酸二氢钙，3000 mg；硫酸铁，80 mg；氯化钠，100 mg；碘化钾，0.8 mg Note: 1 Vitamin premix(mg/kg or g/kg diet): vitamin A 32 mg，riboflavin 45 mg，vitamin B12 0.1 mg，biotin 1.2 mg，vitamin D 5 mg，menadione 10 mg，pyridoxine 20 mg，vitamin E 120 mg，inositol 800 mg，tocopherol acetate 200 mg，thiamine 25 mg，folic acid 20 mg，pantothenate 60 mg，wheat flour 18.67 g 2 Mineral premix(mg/kg or g/kg)diet: NaF 2 mg; Mordenzeo 15.51 g; MgSO4·4H2O 1200 mg; ZnSO4·7H2O 50 mg; CoCl2·6H2O 50 mg; FeSO4·7H2O 80 g; Ca(H2PO4)2·H2O 3000 g; CuSO4·5H2O 10 mg; NaCl 100 g; KI 0.8 mg

表 1 实验饲料配方及营养组成(%干物质) Table 1 Diet formulation and proximate composition (% in dry matter)

本实验在山东海阳市黄海水产有限公司进行，实验鱼为人工养殖的半滑舌鳎亲鱼。从亲鱼池中随机挑选性腺未发育的3龄雌鱼(1.5 kg左右)108尾、雄鱼(0.4-0.5 kg)153尾，随机分配到3×3个直径为230 cm、高为100 cm的养殖桶中，每桶12尾雌鱼、17尾雄鱼，实验从2014年6月1日-9月1日，持续90 d。

参照柳学周等(2006)的方法，采用流水培育，水深为50 cm，日换水量为养殖水体的4-5倍，溶氧含量保持在6 mg/L以上，水温控制在20-25℃。使用白炽灯调控光照强度，光照时间由8 h逐渐延长至12 h，每周增加0.5 h。用对照组饲料暂养7 d，观察亲鱼摄食情况，并确定最终投喂量。实验开始后，用上述3种实验饲料分别饲喂3×3组亲鱼，每天07:00和19:00饱食投喂2次，投喂0.5 h后排水以清除残饵。

养殖周期结束后，每桶随机选取2尾雄鱼，称重后于尾静脉抽血，将血液低温静置4 h后，离心10 min(3000 g/min)，取上清液保存于-20℃冰箱中，取性腺、肝脏称重后保存，用于生化分析；将挤出的精液稀释100倍，在显微镜下用血球计数板测定精液浓度，每组3个重复；取精液用戊二醛固定，进行精子透射电镜分析。

饲料在105℃烘干至恒重，采用凯氏定氮法(VELP，UDK142 automatic distillation unit，意大利)测定粗蛋白含量；脂肪含量采用索氏抽提法测定(FOSS脂肪测定仪SOXTEC 2050，瑞典)；样品在马福炉中灼烧5 h(550℃)，失重法测定灰分含量；参照国标测定方法(GB/T5009.124-2003)，用日立L-8900型氨基酸分析仪测定原料氨基酸组成；血清中睾酮含量采用光化学方法检测(罗氏Cobas-6000全自动电化学发光仪)；虾青素含量参照孙来娣等(2013)的研究方法进行测定。

采用SPSS 17.0软件包对数据结果进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，差异显著后进行Tukeyxs多重比较，数据以平均值±标准差(Mean±SD)表示，差异显著水平为0.05。

南极磷虾粉与鱼粉化学组成和氨基酸组成对比如表 2所示，其中，南极磷虾粉的蛋白含量低于鱼粉，而脂肪含量为鱼粉的2倍；另外，南极磷虾粉的灰分含量略低于鱼粉，而虾青素含量为290.40 mg/kg，是鱼粉的13倍。南极磷虾粉中风味氨基酸含量占总氨基酸含量的42.46%，高于鱼粉中的比例。

表 2(Tab. 2)

表 2 南极磷虾粉与鱼粉化学组成和氨基酸组成比较(%干物质) Table 2 Chemical composition and amino acid composition of krill and fish meal(% in dry matter) 项目 Items 南极磷虾粉 Antarctic krill meal 鱼粉 Fish meal 化学组成Chemical composition 蛋白质Protein 54.88 68.99 脂肪Lipid 16.60 7.81 灰分Ash 12.55 14.62 虾青素Astaxanthin(mg/kg) 290.40 22.08 氨基酸组成Amino acid composition(g/100 g) 天冬氨酸**Asp 7.42 5.57 苏氨酸*Thr 2.24 2.99 丝氨酸Ser 2.33 2.70 谷氨酸**Glu 9.99 9.34 甘氨酸**Gly 3.42 4.23 丙氨酸**Ala 3.07 4.04 半胱氨酸Cys 0.45 0.80 缬氨酸*Val 2.70 3.57 甲硫氨酸*Met 2.33 1.54 异亮氨酸*Ile 2.66 3.01 亮氨酸*Leu 4.12 5.24 酪氨酸Tyr 2.01 2.31 苯丙氨酸*Phe 3.93 3.62 赖氨酸*Lys 4.64 5.64 组氨酸*His 1.12 2.31 精氨酸*Arg 3.54 4.07 牛磺酸Tau 0.33 0.38 ∑AA 56.30 61.36 ∑DAA 23.91 23.18 ∑DAA/∑AA 42.46 37.77 *为必需氨基酸，**为风味氨基酸，AA为氨基酸总量，DAA为风味氨基酸总量 *: Essential amino acids; **: Delicious amino acids; AA: Total amino acids; DAA: Total delicious amino acids

表 2 南极磷虾粉与鱼粉化学组成和氨基酸组成比较(%干物质) Table 2 Chemical composition and amino acid composition of krill and fish meal(% in dry matter)

南极磷虾粉对半滑舌鳎雄鱼繁殖性能的影响如表 3所示，各实验组存活率、性体比、肝体比均无显著性差异(P>0.05)；K-10组精液浓度和血清中睾酮含量略高于对照组，但无显著性差异(P>0.05)。

表 3(Tab. 3)

表 3 南极磷虾粉对半滑舌鳎雄鱼繁殖性能的影响 Table 3 Effects of dietary krill on the reproductive performance of male tongue sole 项目Items 实验组Experimental groups K-0 K-10 K-20 存活率Survival rate1(%) 87.90±5.71 87.10±6.00 87.37±10.71 性体比 Sex index 2(%) 0.56±0.04 0.64±0.06 0.54±0.08 肝体比 Hepatosomatic index3(%) 1.24±0.07 1.11±0.35 0.99±0.13 精液浓度 Sperm concentration4(109 ind/ml) 9.34±0.47 9.48±0.15 9.39±0.18 睾酮含量 Testosterone content(nmol/L) 0.20±0.11 0.21±0.06 0.19±0.10 注：1存活率(%)=成活鱼尾数/投放鱼尾数×100；2性体比(%)=精巢重量/雄鱼体重×100；3肝体比(HSI %)=肝脏重/雄鱼体重×100；4精液浓度(ind/ml)=80个小方格细胞总数/80×400×10000×稀释倍数 Notes: 1Survival rate(%)= survived fish/total fish; 2Sex index(%)= semen weight/body weight×100; 3Hepatosomatic index(%)= liver weight/body weight×100; 4Sperm concentration(ind/ml)= cell number of 80 grid/80 × 400 × 10000 × dilution factor

表 3 南极磷虾粉对半滑舌鳎雄鱼繁殖性能的影响 Table 3 Effects of dietary krill on the reproductive performance of male tongue sole

南极磷虾粉对半滑舌鳎雄鱼精巢中虾青素含量的影响见表 4，K-20组精巢虾青素含量显著高于其他两组(P<0.05)，K-10组精巢虾青素含量略高于对照组，但并无显著性差异(P>0.05)；K-10组与K-20组精巢SOD的活性无显著性差异(P>0.05)，但均显著高于对照组(P<0.05)；随着饲料中南极磷虾粉添加量的增加，精巢中MDA的含量显著降低(P<0.05)。南极磷虾粉对半滑舌鳎雄鱼血清和肝脏中SOD活性和MDA含量的影响如表 5所示，K-10组与K-20组血清、肝脏中MDA的含量无显著性差异(P>0.05)，但均显著低于对照组(P<0.05)。半滑舌鳎精子透射电镜观察(图 1)显示，K-10组精子质膜和线粒体结构完整，而对照组的部分精子质膜及线粒体溶解破碎。

表 4(Tab. 4)

表 4 南极磷虾粉对半滑舌鳎雄鱼精巢虾青素含量、SOD活性和MDA含量的影响 Table 4 Effects of dietary krill on astaxanthin contents，SOD activities and MDA contents in semen of male tongue sole 项目Items 实验组Experimental groups K-0 K-10 K-20 虾青素含量Astaxanthin content(mg/kg DM) 35.14±4.00a 38.56±3.68a 54.54±4.41b SOD活性SOD activity(U/mg prot) 36.27±3.71a 60.73±4.88b 64.67±5.05b MDA含量MDA content(nmol/mg prot) 31.64±3.56a 17.54±3.00b 9.86±0.87c 注：同行数据中的不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同 Note: Data within the same row with different superscripts are significantly different(P<0.05)，same as below

表 4 南极磷虾粉对半滑舌鳎雄鱼精巢虾青素含量、SOD活性和MDA含量的影响 Table 4 Effects of dietary krill on astaxanthin contents，SOD activities and MDA contents in semen of male tongue sole

表 5(Tab. 5)

表 5 南极磷虾粉对半滑舌鳎雄鱼血清、肝脏中SOD活性和MDA含量的影响 Table 5 Effects of dietary krill on SOD activities and MDA contents in serum and liver of male tongue sole 项目Items 实验组Experimental groups K-0 K-10 K-20 血清SOD活性 Activity of SOD in serum(U/ml) 127.65±20.43 200.00±29.37 184.68±44.03 肝脏SOD活性 Activity of SOD in liver(U/mg prot) 22.99±0.94 22.18±0.81 22.31±1.46 血清MDA含量 Content of MDA in serum(nmol/ml) 100.02±14.56a 60.07±8.35b 39.46±2.28b 肝脏MDA含量 Content of MDA in liver(nmol/mg prot) 8.87±0.94a 6.24±0.43b 7.05±0.64b

表 5 南极磷虾粉对半滑舌鳎雄鱼血清、肝脏中SOD活性和MDA含量的影响 Table 5 Effects of dietary krill on SOD activities and MDA contents in serum and liver of male tongue sole

墨鱼粉、鱿鱼粉、南极磷虾粉是亲鱼饵料极具价值的原料成分，其中，南极磷虾粉富含极性脂和非极性脂，极性脂中的磷脂和非极性脂中的虾青素均能提高卵子质量(Watanabe et al，1991)。Verakunpiriya等(1996)研究发现，用含有10%南极磷虾粉的饲料饲养黄尾(Seriola quinqueradiata)亲鱼，能提高黄尾亲鱼的卵子质量，推测可能是南极磷虾粉中的极性脂对卵子质量的提高起到促进作用。已有研究表明，在饲料中添加虾青素能提高亲鱼的繁殖性能(Hansen et al，2016; Ahmadi et al，2006)，Sawanboonchun等(2008)研究发现，在饲料中添加73.7 mg/kg虾青素，可以提高大西洋鳕鱼(Gadus morhua L.)的卵子和仔鱼质量，而在本研究中，K-10组中虾青素含量为70.5 mg/kg，但对该组半滑舌鳎亲鱼的精液浓度和睾酮含量并无显著性影响(P>0.05)，其原因可能是虾青素只对雌鱼繁殖性能有促进作用，而对雄鱼影响较小或者没有影响；或是饲料中42.8 mg/kg的虾青素已经满足半滑舌鳎雄鱼的需求，过高的添加量对雄鱼繁殖性能没有显著性影响(P>0.05)。

机体内过多的自由基能攻击各种生物大分子，引起DNA损伤、脂质过氧化等一系列氧化损伤，进而导致生物体病变(Jin et al，2001)。孔凡华等(2012)研究发现，以南极磷虾粉替代鱼粉饲养大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)，能够促进机体内氧自由基的清除，提高机体抗氧化功能。南极磷虾粉中富含虾青素，其清除自由基的能力远超过现有的其他抗氧化剂，它可以在性腺成熟过程中，激发氧化应激效应来抑制机体氧化，保护脂质、DNA等生物关键因子(Liñán-Cabello et al，2003)。已有研究表明，饲料中添加虾青素可以显著降低血清中MDA含量，提高机体的抗氧化能力(Li et al，2014; Wang et al，2006)。本研究发现，K-20组精巢中SOD活性显著高于对照组(P<0.05)，MDA含量显著低于对照组(P<0.05)，而SOD是机体清除自由基的关键酶，MDA是自由基引发的脂质过氧化反应的最终产物，这两个指标可以综合反映机体的抗氧化能力。作者推测，本研究中K-20组精巢中高含量的虾青素，发挥了清除自由基的作用，从而提高了精巢的抗氧化功能，有效防止精子质膜氧化损伤，保证DNA完整性。

陈海敏等(2012)研究发现，在冷冻液中添加虾青素能够提高大黄鱼精子质量，保护质膜和线粒体结构完整性，而质膜是精子细胞的最外层结构，是精子细胞的生理屏障，其结构完整性是保障精子各项功能正常运行的基础。本研究发现，南极磷虾粉添加组的精子质膜结构完整(图 1-A)，而对照组的精子质膜破碎溶解(图 1-B)。作者推测，这可能与虾青素在生物膜上特殊的定位定向及其保护线粒体的功能相关。

图 1(Fig. 1)

图 1 半滑舌鳎精子透射电镜观察(×100000) Figure 1 TEM image showing ultrastructure of spermatozoa of tongue sole(×100000) A：K-20组精子质膜结构完整；B：对照组精子质膜破碎溶解；C：K-20组精子线粒体结构完整；D：对照组精子线粒体开始破碎溶解 A: Plasma membrane structural integrity of K-20 group; B: Plasma membrane in the process of dissolving of the control group;C: Mitochondrion structural integrity of K-20 group; D: Mitochondrion in the process of dissolving of the control group

线粒体不仅是生成自由基的基础场所，它还是自由基损伤的主要靶子。因此，清除线粒体内的自由基，可以有效降低脂质过氧化反应。文佳等(2010)认为，维生素E可以有效清除线粒体中的氧化自由基，改善线粒体脂质过氧化反应。Kurashige等(1990)研究表明，虾青素抑制线粒体脂质过氧化反应的性能优于维生素E。本研究发现，K-20组精子中线粒体结构完整(图 1-C)，而对照组中有的线粒体已经部分破碎溶解(图 1-D)，这也验证了K-20组精巢抗氧化活性高于对照组。K-10组与K-20组受精卵中SOD活性高于对照组，可能正是饲料中添加南极磷虾粉，提高了雄鱼精巢的抗氧化功能，保护精子免受自由基损伤，提高精子抵御自由基损伤的能力，进而提高了受精卵SOD活性。

综上所述，在本实验条件下，饲料中添加10%和20%的南极磷虾粉均未能显著提高半滑舌鳎雄鱼的繁殖性能，但能显著提高雄鱼的抗氧化功能。