镉(Cd)作为当今世界三大重点研究的毒素之一，位列联合国环境规划署(UNEP)提出的12种具有全球性意义的化学危害物质之首以及美国毒物管理委员会(ATSDR)提出的危害人体健康的有毒物质第6位(王丽娟等，2014)。营滤食性底栖双壳类的华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis，以下简称扇贝)，对Cd累积富集能力较强，超标现象严重，正常膳食暴露水平下，产生的健康风险虽然尚在可接受范围内，但基于日容许摄入量的靶标危害系数(THQs)相对较高，即外暴露水平较高，其食用安全应引起一定的重视(姜元欣等，2013; 陈红英等，2015)。

另一方面，李凤琴等(2011)指出，食品中的污染物被机体摄入后只有从基质中释放出来的部分可对机体产生毒性作用，动物模型或体外方法模型都是探究污染物生物可给性的有效方法，而后者以其程序简单、稳定、可重复等特性，已成为评估食品安全风险的重要技术手段之一。本研究采用“全仿生消化法”模拟人体胃肠道的消化环境，对扇贝体内Cd的生物可给性进行探讨，并分析了消化液组成(酸度、无机物和有机物、消化酶)、样-液比等对Cd溶出的影响。

1 材料与方法 1.1 仪器设备与试剂

仪器设备：原子吸收光谱仪(iCE 3500，ThermoFisher)，水浴恒温振荡器(THZ-82，常州国华电器有限公司)，高速离心机(5810R，Eppendorf)，微波消解仪(Mars 5，CEM)，pH/ISE测试仪(828型，Orion)，超纯水系统(Milli-Q element A10，Millipore)。

胰液素(效价1:4000)、胆汁、牛血清白蛋白、α-淀粉酶(活力≥4000 U/g)、脂肪酶(活力≥30000 U/g)、黏液素、尿酸、胃蛋白酶(效价1:30000)等生化试剂均购于上海一基实业有限公司；氢氧化钠、浓盐酸、浓硝酸为优级纯；其余试剂均为分析纯。

实验用华贵栉孔扇贝购于厦门市第八市场，用超纯水冲洗3遍后去壳匀浆。

GBW10024(GSB-15)扇贝成分分析标准物质购于北京标新方圆技术咨询有限公司。

1.2 仿生消化液制备

参照Oomen等(2003)和林路秀等(2014)体外全仿生消化液的配制方案，分别加入胃和肠中所含的有机物和无机物，调节pH至各消化液相应的pH值，制备半仿生消化液；在半仿生消化液基础上，分别加入对应的消化酶，制备全仿生消化液，全仿生消化液在4℃下保存备用。具体配制方法见表 1。

1.3 实验设计 1.3.1 溶出平衡时间

设置4个实验组，称取扇贝样品约2 g(精确至0.001 g，平行2份)，分别加入全仿生唾液、胃液、十二指肠液和胆汁各40 ml，在37℃恒温振荡(设置不同浸提时间)后，8000 r/min离心10 min(4℃)，取上清液用0.45 μm滤膜过滤，滤液(仿生消化食糜)在4℃下保存待用。

1.3.2 影响因素

(1) 消化液组成：设置仿生唾液、胃液、十二指肠液、胆汁和全过程仿生消化液5个实验组，分别测试pH、无机/有机物以及消化酶对仿生消化的影响。浸提液分别为纯水(调至相应pH)、半仿生消化液(无消化酶)和仿生消化液，样-液比约为1:20(g/ml)。所有实验平行2份，取平均值。

(2) 样-液比 按样-液比1:10、1:20、1:30、1:60和1:120(g/ml)分别称取一定量的扇贝样品进行全过程仿生消化：先加入全仿生唾液2.5 ml，37℃恒温振荡5 min；加全仿生胃液15 ml，37℃恒温振荡2 h；再加入30 ml十二指肠液和10 ml胆汁，37℃恒温振荡7 h后，8000 r/min离心10 min(4℃)，取上清液，用0.45 μm滤膜过滤，滤液(仿生消化食糜)在4℃下保存待用。所有实验平行2份，取平均值。

1.3.3 微波消解及Cd含量测定

称取0.5 g扇贝成分分析标准物质或2 g扇贝样品(精确至0.001 g)，加入10 ml浓HNO₃，微波消解测定扇贝样品总Cd量；移取5.00 ml仿生消化滤液(消化食糜)，加入5 ml浓HNO₃，微波消解后测定扇贝Cd溶出量；将仿生消化残渣全量转移至消解罐，加入10 ml浓HNO₃消解测定残渣态Cd含量；同时进行试剂空白对照。采用石墨炉原子吸收光谱仪(iCE 3500)测定扇贝样品、仿生消化食糜和残渣中Cd的含量。

1.4 数据处理与分析

Cd的溶出率为消化食糜中Cd含量与扇贝样品中Cd总量的比值，即：

${\rm{tt}} = \left( {C \times V} \right)/\left( {\omega \times m} \right) \times 100\% $

式中，C为消化食糜中溶解态Cd含量(μg/L)；V为消化液体积(ml)；$\omega $为扇贝样品Cd含量(μg/g)；m为称样量(g)。

扇贝体内Cd的生物可给率是指扇贝样品经胃肠道消化后Cd的最大释放量，以全过程仿生消化后Cd的溶出率进行表征。

使用Excel 2007进行数据处理和图形制作。设定差异显著性水平P为0.05，当P＜0.05时为差异显著，反之差异不显著。

2 结果与讨论 2.1 扇贝样品中总镉含量

扇贝标准物质Cd含量测定结果为(1.12±0.03)μg/g，与参考值(1.06±0.10)μg/g相吻合，表明微波消解-原子吸收光谱法测定试样中Cd含量准确可靠。

实验用扇贝Cd含量较高，测定值为2.98 μg/g，这可能是因为扇贝本身对Cd的同化率较高，且Cd在扇贝体内的生物半衰期较长，在正常海区也能在体内快速累积Cd至较高浓度(赵艳芳等，2014)，因此，其食用安全风险需要引起一定的重视。

2.2 溶出平衡时间

不同振荡时间下，仿生唾液、胃液、十二指肠液和胆汁中实验用扇贝Cd的溶出平衡见图 1，仿生唾液中Cd的溶出，在20 min时达到最大值，然后趋于稳定，平衡时间最短。仿生胃液中Cd的溶出，则在2 h达到最大值，然后趋于稳定，平衡时间次之；仿生十二指肠液中Cd的溶出在7 h内逐步增长，7 h后出现明显下降现象。仿生胆汁中Cd的溶出在3 h达到最高值，然后趋于稳定。总体而言，各仿生消化液中Cd的溶出平衡时间顺序依次为：仿生唾液＞胃液＞胆汁＞十二指肠液。

王秀丽等(2013)指出，酶解时间影响酶的催化反应，随着反应时间的延长，酶解程度逐渐增大，当胃蛋白酶酶解时间大于2 h，酶解反应已充分，与本实验的结果相吻合。仅仿生十二指肠液出现酶解完全后Cd溶出率明显下降的现象，这可能是因为扇贝体内最主要的营养成分是蛋白质，占干品总重60%以上(李薇薇，2011)，而蛋白质主要的消化酶在肠液中(胃蛋白酶仅针对水溶性蛋白质)，当蛋白质酶解程度过大时，降低了产物中小肽的含量，若进一步延长酶解时间，反而会降低酶解产物得率(王秀丽等，2013)。

此外，将仿生消化液Cd溶出量的对数值(lnC)与溶出时间(t)作图，仅仿生十二指肠液和仿生胆汁lnC-t呈明显线性关系，具有一级反应的特点，线性方程分别为lnC=0.0467t+0.4581(R²=0.9530)和lnC= 0.0354t+0.7758(R²=0.8891)。

2.3 溶出量

用仿生唾液、胃液、十二指肠液和胆汁分别提取扇贝样品20 min、2 h、7 h和3 h，胃液中Cd溶出量最高(2.93 μg/g)，溶出率高达98%；唾液中最低(1.03 μg/g)，溶出率约34%；肠液和胆汁中Cd溶出量相差不大(分别为1.99 μg/g和2.22 μg/g)，溶出率约70%。

Cd溶出量高低与消化液组成和扇贝营养成分有很大关系，唾液中仅含微量淀粉酶，只能对糖类进行初步消化，而扇贝干品中糖类仅占15%左右(李薇薇，2011)，唾液对其消化能力有限。胃液能对蛋白质进行初步消化，但Cd高溶出量可能与其极低的pH值(1.07±0.07)有关。十二指肠液所含的胰液素和脂肪酶能对糖类、蛋白质和脂肪进行消化；胆汁不含消化酶，但能乳化脂肪，属于物理性的消化，对Cd溶出有促进作用；另一方面，肠液和胆汁的pH偏弱碱性，Cd溶出受到一定的制约。

2.4 影响因素 2.4.1 消化液组成

在人体消化系统中，酸度、无机/有机物、消化酶和肠道微生物均对膳食摄入Cd的形态和生物可给性方面起重要作用(Oomen et al，2003; 陈丽惠等，2013)，本研究以扇贝体内Cd在纯水(调至相应pH)、半仿生消化液(无消化酶)和仿生消化液中的溶出率变化对前三者在消化体系中所起的作用进行初步探讨。

如图 2所示，pH对唾液中扇贝样品Cd溶出的贡献率高达63%，这与唾液仅含微量内容物以及唾液本身对富含蛋白的扇贝样品消化能力有限有关。胃液中Cd极高的溶出率(＞95%)与胃液中的盐酸介质对无机镉和有机镉的浸提作用有关，如Cd金属硫蛋白在pH为2.5-3.5时，有50%的金属离子发生解离(李敏，2008)¹⁾。当pH由6.5降至1.07时，Cd溶出率提高了3.5倍，同时，极低的pH掩盖了胃液中无机/有机物和消化酶对Cd溶出率的影响。

1)李敏. 水产品中镉污染的安全评价及其不同形态的影响研究. 中国海洋大学硕士研究生学位论文，2008，48-66

无机/有机物的引入使十二指肠液、胆汁和全过程仿生消化液中Cd溶出量较单纯酸度影响增长了76%、111%和54%，这可能是因为无机盐阳离子(如Ca²⁺、Mg²⁺、K⁺等)的竞争吸附效应以及Cl^-等无机阴离子与Cd²⁺形成可溶性配合物均可促进消化食糜中Cd的溶解平衡(王祖伟等，2012、2008)。

十二指肠液和胆汁中消化酶对Cd溶出的贡献显著，约占总溶出量的40%，远大于pH和无机/有机物的影响，因此，肠液和胆汁中Cd溶出时lnC-t呈线性关系的主因可能是受酶反应所控制，消化酶能促进食物中糖、脂肪、蛋白质水解生成小分子物质，从而通过影响Cd配合物的配体组成提高Cd的溶出率(林路秀等，2010)。酶效应对于全过程仿生消化液中Cd溶出效果的影响更明显，约占总溶出量的51%，胆汁的乳化作用可能会促进十二指肠液中酶反应的进行。

2.4.2 样-液比

在消化液配比为0.25:1.5:3:1的体系中，扇贝样品与消化液比例在1:10-1:120时，Cd溶出率在62%-69%之间，没有显著差异，但1:20和1:30处理时溶出量略高于其他比例。体外仿生消化在土壤中污染物的研究中应用更为广泛，Oomen等(2003)总结了仿生消化在土壤中污染物生物可利用率中的应用发展过程时指出，土-液比变化对土壤中污染物生物可利用率的影响可能主要来自扩散限制溶解动力学，土-液比变化对生物可利用率的影响不大，称样过多可能会降低其生物可利用率，但扩散本身不是其限制因素。虽然扇贝与土壤的基质不同，但仿生消化的作用机理相似，样-液比同样对扇贝体内Cd溶出率影响不大。

2.5 扇贝样品Cd生物可给性分析

饮食摄入是人体污染物暴露的主要途径之一，体外仿生消化研究污染物经口生物利用率也成为评估食品安全风险评估的重要手段。污染物经口生物利用率(Bioavailability)是描述污染物在胃肠道释放(生物可给性，Bioaccessibility)、吸收(穿过小肠上皮细胞的部分)、在肠道或肝脏中代谢(首过效应)，最终到达机体循环系统的过程(李凤琴等，2011; Oomen et al，2003)，而全过程仿生消化食糜中Cd含量即代表Cd在胃肠道的最大释放量，即扇贝体内Cd的最大生物可给率约为70%。

由图 2可知，在胃液强酸条件下，扇贝体内Cd溶出率一度高达95%以上，但胃却不是Cd的主要吸收器官，人体吸收膳食中Cd的主要部位在十二指肠，十二指肠对Cd的吸收率是空肠和回肠的2倍(徐敏，2009)¹⁾，胃粘膜的阻隔作用和上皮细胞的不断代谢更新可能是Cd在胃中不易被吸收的原因，而肠道内Cd溶出率低于胃则应归因于pH骤升后Cd的沉淀和再吸附(付瑾等，2012)。

1) 徐敏. 小鼠镉的蓄积性毒性试验及残留分析研究. 四川农业大学硕士研究生学位论文, 2009, 1-3

人体对膳食中Cd的吸收率一般在10%以下(吴大伟等，2010)，基于消化管和血管间的生物膜是类脂质膜(林路秀等，2010)，后续可进一步通过脂质体模拟生物膜确认Cd的生物可利用性并进行食品安全评价。

3 结论

(1) 不同仿生消化液对扇贝体内Cd溶出平衡时间不同，依次为：仿生唾液＞胃液＞胆汁＞十二指肠液，仅后2种仿生消化液中Cd溶出量lnC与时间t呈线性关系，具有一级反应的特点。

(2) 扇贝体内Cd在不同仿生消化液的溶出量顺序为：胃液＞胆汁≈十二指肠液＞唾液。消化液pH是影响Cd溶出量的重要因素，而在近中性条件下(pH 6-8)，酶解反应对Cd溶出量影响显著。

(3) 样-液比在1:10-1:120之间，扇贝体内Cd溶出率没有显著差异，表明样-液比对Cd的生物可给率影响不大。

(4)全过程仿生消化液作用下，扇贝体内约有70% Cd释放溶出，即最大生物可给率为70%。

致谢: 福建省水产研究所郑盛华、席英玉和罗冬莲等参与本研究的分析和讨论，谨致谢忱。