标记-回捕方法对研究鱼类的洄游、种群大小、生长率和行为等具有重要作用(Ricer，1971)。耳石是鱼类生长和早期生活史研究的重要载体(Campana et al，1985; Nielsen，1992; Pannella，1971; 杨青瑞等，2007)。荧光染料标记鱼类耳石已被广泛使用，荧光物质会在耳石上形成永久标记，可应用于鱼类不同生活史阶段的相关研究(宋昭彬等，1999)。硬骨鱼类的耳石位于鱼体内耳前庭区，一共有3对耳石，其中，大的1对为矢耳石，其余2对为星耳石和微耳石。Pannella(1971)提出鱼类日龄的概念，此后耳石鉴定已成功应用于鱼类年龄鉴定(杨青瑞等，2007)、生长分析(王菲等，2010)、物种鉴别(Assis，2003; 郭弘艺等，2010)、近缘种鉴定(潘晓哲等，2010)等研究领域，取得了诸多研究进展。

鱼类耳石的主要成分为碳酸钙并含有有机物及微量元素，一旦形成，很少发生再吸收现象，比较稳定(高永华等，2008)。同时，因其可被荧光物质染色且可形成永久标记，后来被广泛应用于鱼类的增殖放流回捕评估研究(Matsumura，2000)。耳石标记具有操作简易、省时省力、对鱼类的存活和生长发育影响小等优点，同时荧光物质标记不容易被破坏和冲洗，所以在鱼类资源量调查、标记物种的放流识别、放流后生活习性跟踪调查、放流回捕及增殖效果评价等研究领域广泛应用(van Der Walt et al，2003)。目前，常用于耳石染色标记的荧光染料主要有盐酸四环素(Oxytetracyclille，OTC)(Tsukamoto，1995)、钙黄绿素(Caleill)(Wilson et al，1987)、茜素络合物(Alizarin Complex-one，ALC)(Lang et al，1993)、茜素红S(ARS)(Unfer et al，2013; Eckmann，2003)。其中，ALC因其使用安全性高、价格低廉和对耳石染色效果好等优点成为最为常用的荧光染料之一，ALC与钙离子螯合可形成猩红色荧光标记，易于与耳石的自发荧光区别。另有研究表明，ALC在耳石上形成的标记可以在显微镜自然光源下检测，使标记检测更简单(Beckman et al，1996; 何春林等，2008)。

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)为我国近海常见的暖温性大型底栖鱼类(邓景耀等，1988; 柳学周等，2006)。近年来，因过度捕捞和环境恶化引起其自然资源量不断下降，已形不成渔获。2003年，半滑舌鳎人工繁殖技术取得突破，推动了养殖产业和资源增殖保护事业的快速发展。2006年以来，我国开展了大规模的半滑舌鳎增殖放流活动，为评估其放流增殖效果，开发适宜的放流标志技术引起业界广泛关注。本研究利用ALC浸泡标记半滑舌鳎苗种耳石，探索ALC适宜的浸泡时间和浸泡浓度，以期建立高效的耳石荧光标记检测方法，为半滑舌鳎标志放流和增殖效果评估提供群体身份识别技术支撑。

本研究在山东莱州明波水产有限公司开展，实验用半滑舌鳎苗种为该公司人工培育的健康苗种，苗种色泽正常，大小规则整齐，健康活泼，摄食良好。

使用70 d(全长3-4 cm)和170 d(全长8-10 cm)2个规格的实验鱼各1000尾，实验开始前实验鱼在底面积为25 m²的水泥池中暂养7 d。实验鱼培育条件：水温为18-20℃、盐度为28-30、pH为7.8-8.3、溶解氧5 mg/L以上。实验鱼投喂配合饲料，投喂量为鱼体重的2%-3%，每日清理培育池1次。

实验用ALC购自Sigma公司。ALC实验液配制方法：先将ALC溶于蒸馏水中，再加入少量KOH增加ALC的溶解性，配成浓度为1000 mg/L的ALC储备液(调节盐度至32)，然后用储备液加曝气的海水稀释成不同浓度的浸泡液。ALC设置5个浓度梯度：0(对照组)、50、100、150、200 mg/L。用NaHCO₃缓冲液调节溶液的pH值至8。

实验容器为圆柱形塑料桶(半径50 cm，高50 cm)，实验前用自然海水清洗实验容器2次，然后用自然海水浸泡24 h。使用20个圆柱形塑料桶(100 L)，按照数字顺序编号标记，每个桶中放置100尾实验鱼。其中，1-5号桶放置70 d鱼苗，设置1组重复；6-10号桶为170 d鱼苗，设置1组重复。将实验鱼置入实验容器前饥饿24 h，对所有盛有染色液的容器进行遮光处理，以减少环境对鱼体可能造成的胁迫影响。

观察并记录鱼苗在ALC染色液中12 h、24 h、36 h的成活率情况，及时挑拣出死鱼。实验鱼死亡的标准：实验鱼腹部朝上翻转或者以异物接触鱼体未见反应。浸泡处理过程中向实验水体中充气增氧，pH保持在8左右，水温保持在18-19℃。实验结束后，将实验鱼转移至新鲜海水快速清洗，去除鱼体上的染色液，然后将实验鱼分别置于盛有新鲜海水的相同实验容器中，代谢4 h，继续去除鱼体上的ALC染色液，培育并观察实验鱼的行为变化。

ALC染色结束后，将150 mg/L组的170 d实验鱼进行养殖，以评价ALC染色处理对生长的影响，以未染色处理的实验鱼作为对照组。使用容积为2 m³的玻璃钢水槽进行养殖，养殖时间为4个月。养殖条件：水温为17-20℃、盐度为28-30、pH为7.8-8.3、溶解氧5 mg/L以上。养殖期间，投喂人工配合饲料，饱食投喂。日换水率为100%，每天清理实验容器底部。

记录实验鱼和对照组鱼在开始养殖和养殖结束时的全长和体重，日瞬时生长速率按照如下公式计算：

式中，W_i为起始体重，W_f为养殖结束后体重，t_f-t_i为饲养时间(d)，以G值为指标评价耳石标记对生长的影响。

在ALC浸泡处理过程中，在12、24和36 h自各实验组分别取实验鱼5-6尾，以MS-222(300 mg/L)麻醉致死后，以无水乙醇整体保存固定，用于观察耳石的荧光标记情况。

对200 mg/L组的养殖鱼，每30 d取实验鱼9尾，摘取耳石用于荧光标记观察，持续至养殖实验结束。耳石摘取及处理方法：首先将实验鱼以MS-222麻醉致死，然后以剪刀和解剖针快速取出耳石，区分微耳石和矢耳石，将耳石先用双蒸水清洗，再用无水乙醇脱水，晾干后，把耳石放在二甲苯溶液里浸泡透明。半滑舌鳎耳石为内凹形，使用砂纸(5000目)将耳石进行打磨处理，最后用少量中性树脂把耳石固定在载玻片上进行观察。耳石打磨处理期间，使用NIKON SMZ800体视显微镜连续观察，保证耳石处理到最佳厚度和可视度。耳石打磨完成后，使用NIKON ECLIPS 80i正置显微镜观察耳石，利用自带图像处理软件NIS-Elements AR进行拍照和图像处理。

为了清晰地观察ALC对耳石的染色效果，分别用可见光、黄绿光、蓝光和紫外光源照射激发耳石样本，各种光源的激发滤光片和阻挡滤光片的波长见表 1。

表 1(Tab. 1)

表 1 用于观察耳石ALC标记的滤光片波长 Table 1 The wave length of excitation filters and barrier filters used in the present study 光源 Light sources 波长 Wave length(nm) 激发滤光片 Excitation filter 阻挡滤光片 Barrier filter 绿光 Green light 510-560 590 蓝光 Blue light 450-490 520 紫外光 UV light 330-380 420

表 1 用于观察耳石ALC标记的滤光片波长 Table 1 The wave length of excitation filters and barrier filters used in the present study

耳石的染色标记效果以4个等级来区分标记效果，分别为无(-)、可见(+)、较明显(++)、明显(+++)。

本研究获得的实验鱼成活率数据为2个实验组的平均值，日瞬时生长速率表达为平均值±标准差(Mean±SD)，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行标记组与对照组实验鱼生长的差异显著性分析，统计分析利用SPSS 16.0统计学软件进行。设定差异显著性水平P为0.05，当P＜0.05时为差异显著，反之差异不显著。

研究发现，在50、100 mg/L ALC浓度下，浸泡36 h后，70 d和170 d鱼苗成活率均达到100%。在150 mg/L ALC浓度下，70 d鱼苗在浸泡24 h时开始出现死亡，至36 h实验结束时成活率为90%；170 d鱼苗在浸泡12 h时开始出现死亡，成活率为93%，至36 h实验结束时成活率仅为76%。而在200 mg/L ALC浓度下，70 d和170 d鱼苗在12 h即全部死亡。结果表明，随着浸泡浓度增大和苗种日龄的增加，半滑舌鳎对ALC浸泡处理的耐受力降低(表 2)，ALC的处理浓度应控制在150 mg/L以内。

表 2(Tab. 2)

表 2 不同浓度ALC对2种规格鱼苗在不同浸泡时间条件下的标记效果 Table 2 Marking effects of ALC at different concentrations on two sized tongue sole juveniles under different treatment duration 浸泡液浓度 Treatment concentration (mg/L) 样本数 Fish number (ind) 标记日龄 Fish age(d) 浸泡时间Treatment duration (h) 成活率Survival rate(%) 矢耳石 Sagitta 微耳石 Asteriscus 标记率(%) Marking rate 标记强度 Mark intensity 标记率(%) Marking rate 标记强度 Mark intensity 可见光 Visible light 荧光 Fluorescent light 可见光 Visible light 荧光 Fluorescent light 可见光 Visible light 荧光 Fluorescent light 可见光 Visible light 荧光 Fluorescent light 50 100 70 12 100 0 12 - + 0 11 - + 100 100 100 23 50 - + 28 57 + + 150 100 100 65 90 + ++ 65 85 + ++ 200 100 0 100 100 ++ +++ 100 100 + ++ 50 100 24 100 0 33 - + 0 23 - + 100 100 100 51 76 + ++ 52 79 + ++ 150 100 97 100 100 ++ +++ 100 100 ++ ++ 200 100 0 100 100 +++ +++ 100 100 +++ +++ 50 100 36 100 0 41 + ++ 0 46 - + 100 100 100 100 100 ++ +++ 91 100 ++ +++ 150 100 90 100 100 ++ +++ 100 100 ++ +++ 200 100 0 100 100 +++ +++ 100 100 +++ +++ 0(对照组 Control group) 100 36 100 0 0 - - 0 0 - - 50 100 170 12 100 0 9 - ++ 0 10 - ++ 100 100 100 26 54 - ++ 19 51 - + 150 100 93 62 86 + ++ 59 83 + ++ 200 100 0 100 100 + +++ 89 100 + ++ 50 100 24 100 2 31 - ++ 2 35 - + 100 100 100 45 79 + ++ 49 82 + ++ 150 100 89 100 100 + +++ 100 100 ++ ++ 200 100 0 100 100 +++ +++ 100 100 +++ +++ 50 100 36 100 3 42 - ++ 2 45 - + 100 100 100 89 100 + ++ 100 100 + ++ 150 100 76 100 100 ++ +++ 100 100 ++ +++ 200 100 0 100 100 +++ +++ 100 100 +++ +++ 0(对照组 Control group) 100 36 100 0 0 - - 0 0 - -

表 2 不同浓度ALC对2种规格鱼苗在不同浸泡时间条件下的标记效果 Table 2 Marking effects of ALC at different concentrations on two sized tongue sole juveniles under different treatment duration

通过可见光和荧光镜检发现，不同浓度ALC在不同作用时间下对耳石的荧光标记率不同。在50 mg/L ALC浓度条件下，36 h时对70 d和170 d苗种矢耳石和微耳石的荧光标记率均低于47%，同时荧光信号强度较弱。100 mg/L ALC浓度下，24 h对70 d鱼苗矢耳石和微耳石的荧光标记率分别达76%和79%，至36 h时对耳石的标记率达到100%；对170 d鱼苗矢耳石和微耳石在24 h的荧光标记率分别达79%和82%，至36 h时对耳石的标记率也都达到100%。150 mg/L ALC浸泡处理时，70 d鱼苗矢耳石和微耳石的荧光标记率在24h时分别达90%和85%，至36 h时对耳石的标记率达到100%，170 d鱼苗矢耳石的荧光标记率在12 h已达86%，在24 h时均达100%；在200 mg/L ALC处理组，70 d和170 d鱼苗矢耳石和微耳石的荧光标记率均在12 h时就已达100%，同时，耳石的荧光信号最强，但苗种出现大量死亡。综合考虑ALC浸泡处理后鱼苗成活率、耳石荧光标记率、耳石标记效果等因素，认为ALC对半滑舌鳎幼鱼耳石标记的适宜浓度应为100-150 mg/L(表 2)。

同时发现，借助于蓝光、黄绿光和紫外等荧光手段对耳石ALC标记效果的检测更容易辨识，可提高耳石标记的检出效率。另外，无论是70 d组还是170 d组鱼苗，不同浓度的ALC浸泡处理后矢耳石的荧光信号强度总体强于微耳石，因此，选择矢耳石作为观察对象较为适宜。

当ALC浸泡处理时间为12 h时，可见光和荧光下均可发现耳石荧光染色信号，但效果不明显。处理24 h时，无论是可见光下还是荧光下都有较好的耳石染色信号，处理36 h时，虽然标记的荧光信号强度随着浸泡时间增加而增强，但24 h和36 h的荧光反应强度没有显著差异，反而死亡率随时间的延长呈上升趋势(表 2)，因此，ALC浸泡处理半滑舌鳎苗种的适宜时间以24 h为宜。

本研究发现，茜素络合剂对半滑舌鳎耳石的染色效果较好，在显微镜下观察容易辨识标记，又能长时间保留染色效果。

使用蓝光、黄绿光和紫外光检查实验鱼耳石发现，蓝光对染色耳石观察的效果最佳，其次为黄绿光，再次为紫外光(图 1)。对实验鱼自实验开始连续4个月进行耳石取样，发现各取样月份实验鱼耳石的染色信号强度差异不大，即使在第4个月其信号强度与第1个月时并无明显差异(图 1)，表明茜素络合剂耳石的染色效果较为持久。

图 1(Fig. 1)

图 1 ALC对半滑舌鳎耳石的标记效果 Figure 1 Marking effects of ALC on otoliths of juvenile tongue sole a：自然光下耳石整体；b：标记后1个月耳石(黄绿光)；c：标记后1个月耳石(蓝光)；d：标记后1个月耳石(紫外光)；e：标记后3个月耳石(黄绿光)；f：标记后3个月耳石(蓝光)；g：标记后3个月耳石(紫外光)；h：标记后4个月耳石(黄绿光)；i：标记后4个月耳石(蓝光)；j：标记后4个月耳石(紫外光)；k：标记后4个月耳石整体观(黄绿光)；l：标记后4个月耳石整体观(蓝光)(注：图 1-a、k、l标尺为500 μm，其他图片标尺为250 μm，图中箭头示荧光标记部位) a. unmarked sagittae; b. marked sagittae after one month(green light); c. marked sagittae after one month(blue light); d. marked sagittae after one month(UV light); e. marked sagittae after three months(green light); f. marked sagittae after three months(blue light); g. marked sagittae after three months(UV light); h. marked sagittae after four months(green light); i. marked sagittae after four months(blue light); j. marked sagittae after marked four months(UV light); k. whole marked sagittae after four months(green light); l. whole marked sagittae after four months(blue light)(Note: Bars indicated 500 μm in figures 1-a，k，l，and 250 μm in other figures. The arrows indicated marking sites)

在4个月的养殖实验中，ALC实验组和对照组实验鱼未出现死亡。单因素方差分析表明，养殖过程中ALC实验组与对照组间在全长、体重方面无显著差异(P>0.05)(表 3)，可见ALC标记对半滑舌鳎苗种的养殖生长无明显影响。

表 3(Tab. 3)

表 3 150 mg/L ALC 处理对170 d半滑舌鳎鱼苗生长的影响 Table 3 Effects of ALC of 150 mg/L on the growth of tongue sole juveniles 类别 Groups 实验开始 Beginning of experiment 实验结束 End of experiment(120 d) 日瞬时增长率 Daily instantaneous growth rate(%) 全长 Total length(cm) 湿重 Wet weight(g) 全长 Total length(cm) 湿重 Wet weight(g) 对照组 Control group 9.35±0.39 3.95±0.37 15.15±0.26 34.93±1.71 2.44±0.45 实验组 Experimental group 9.28±0.38 4.05±0.34 15.18±0.55 35.15±2.67 2.39±0.36

表 3 150 mg/L ALC 处理对170 d半滑舌鳎鱼苗生长的影响 Table 3 Effects of ALC of 150 mg/L on the growth of tongue sole juveniles

近年来，在海洋鱼类的耳石标记所使用的指示剂中，ARS和ALC已经逐渐取代了OTC和钙黄素，其原因主要在于ARS和ALC对鱼体造成的损害较小，标记后鱼类食用安全性高，标记部位产生相对较弱的自发荧光。而OTC是一种抗生素，且OTC随盐度的增大，游离OTC与钙结合，导致OTC标记效果衰退，不适宜标记海水鱼类耳石。

不同鱼类对荧光标记物的敏感性不一样，随之带来的标记效果也不一样。Tsukamoto等(1998)用一些小型鲤科鱼类的仔稚鱼进行ALC耳石标记实验，表明产生可检测标记的ALC适宜浓度为200 mg/L或者更高。而欧阳斌等(1999)报道，用ALC浸泡标记鲫(Gobiocypris rarus)和彭泽鲫(Carassius auratus var. Pengze)时，150 mg/L浓度时出现鱼体死亡，200 mg/L时鱼体全部死亡。本研究发现，利用ALC浸泡标记半滑舌鳎时，100 mg/L组未发生死亡，而150 mg/L出现少量死亡，200 mg/L浓度时鱼苗则全部死亡，表明高浓度ALC可造成半滑舌鳎苗种较高的死亡率。同时发现，ALC浓度在100-200 mg/L时均能对半滑舌鳎幼鱼矢耳石和微耳石产生良好的标记效果，且标记效果随着浸泡时间的延长而增强，但浸泡时间为24 h和36 h时的标记效果差异不显著。另外，实验鱼死亡率与浸泡时间和浸泡浓度成正比关系，在 200 mg/L ALC浓度下实验鱼死亡率达100%，150 mg/L ALC浸泡24 h时2种规格鱼苗死亡率仅为11%和3%。结果表明，ALC适合浸泡标记半滑舌鳎耳石，其适宜标记浓度为100-150 mg/L，适宜标记时间为24 h。

本研究发现，随着ALC浓度增大和浸泡时间延长，耳石标记效果逐渐增强(表 2)，这与Liu等(2009)、Katayama等(2007)对褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)的研究结果一致。Liu等(2009)研究发现，ALC对褐牙鲆浸泡标记的最佳浓度为300 mg/L，ALC标记组与对照组间在养殖过程中全长、湿重无显著差异。Lagardère等(2000)研究了ALC对大菱鲆的标记最适浓度为120 mg/L，同时表明其对大菱鲆的生长无影响。在本研究中，半滑舌鳎浸泡标记的最佳浓度在100-150 mg/L之间，ALC实验组与对照组间在养殖过程中无显著差异，这与Lagardère等(2000)的研究结果一致。而在200 mg/L浓度下，死亡率达到100%，与牙鲆的标记结果不同，可能是由不同物种对荧光染料的适应性不同造成的。另外，本研究还发现，ALC对鳍条的染色效果也较好，浸泡3个月的鳍条硬棘的染色效果清晰可见。

已有研究表明，影响ALC对鱼类耳石标记效果的因素主要有鱼日龄(宋昭彬等，1999)、荧光物质浓度(Tsukamoto et al，1989)、浸泡时间(Beckman et al，1996)。作者认为，随着鱼日龄的增大，标记效果逐渐降低，荧光物质在鱼类耳石中沉积的原理是鱼的新陈代谢促使荧光物质随着碳酸钙进入耳石，参加下一轮的碳酸钙沉积，随着时间的增加，带有荧光物质的碳酸钙沉积越来越多，逐渐形成一个荧光环。鱼日龄越大，新陈代谢降低，碳酸钙沉积随之减慢，使得荧光环变小或变淡。本研究发现，ALC对70 d鱼苗的标记效果好于170 d鱼苗。荧光物质浓度对标记效果有明显的影响，本研究中，50 mg/L和100 mg/L ALC虽能染色耳石，但效果不明显。而150 mg/L和200 mg/L ALC染色效果则较为明显，可见荧光物质浓度越高，染色越明显。王正鲲等(2015)发现茜素络合物对唐鱼(Tanichthys albonubes)耳石染色的适宜浓度也随日龄增大而增加，与本研究结果相似。赵亚鹏等(2013)利用茜素络合物标记滇池金线鲃(Sinocyclocheilus grahami)仔稚鱼耳石时同样发现，在相同浸泡强度下，20日龄仔鱼耳石标记效果优于90日龄稚鱼，其原因可能是低日龄苗种培育密度大，对于荧光染料的利用率可能会高。影响标记效果的另外一个因素为浸泡时间，浸泡时间越长，染色效果越明显。但考虑到鱼体生理胁迫耐受力，浸泡时间不宜过长。除此之外，观察耳石之前对耳石的处理也是检测标记效果的重要原因，半滑舌鳎耳石形状略显不同，耳石中心位置突起对观察耳石、检测染色效果有很大影响，需要对耳石进行打磨处理变薄，从而更容易观察和检测。

Tsukamoto(1995)研究了马苏大马哈鱼(Oncorhynchus masou)经ALC浸泡标记后，荧光标记的长期检测方法和标记保留时间，表明马苏大马哈鱼耳石上形成的ALC荧光标记持续保留时间至少为3年。Liu等(2009)利用茜素红对牙鲆耳石进行标记暂养60 d后，也发现耳石荧光标记未出现消褪，而本研究发现，利用ALC浸泡标记半滑舌鳎苗种耳石后120 d，耳石上形成的荧光标记仍然清晰可见，表明ALC对半滑舌鳎耳石的标记效果是长期保持的，该标记方法可用于半滑舌鳎苗种的标志放流和增殖效果评估。