草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是中国重要的草食性淡水养殖鱼类，已经有1700多年的养殖历史，经过几十年的人工养殖，目前，草鱼的产量在世界淡水养殖鱼类中排名第一(沈玉帮等，2011)。

20世纪50年代以后，在中国草鱼养殖中暴发了一种严重的传染性疾病——草鱼出血病(Hemorrhage disease of grass carp)，引起草鱼大量死亡。在对该病病原学、流行病学和防控技术进行研究的过程中，研究人员建立了多株草鱼细胞系，如草鱼吻端细胞系、草鱼肾细胞系和草鱼性腺细胞系(GCO)(张念慈等，1981; 左文功等，1986; 陈燕燊，1978)等。其中，陈燕燊(1978)建立的GCO细胞系已稳定传至300多代，在淡水鱼类病毒，如草鱼出血病病毒、胭脂鱼(Myxocyprinus asiaticus)弹状病毒、淋巴囊肿病毒等(陈立祥等，1998; 张奇亚，2002)的研究中发挥了重要作用。

在检测和诊断工作中，研究人员发现GCO细胞系对鲤春病毒血症病毒(SVCV)表现出非常稳定的敏感性，并在SVCV检测的国家标准和行业标准中使用，但一直未对GCO细胞系的特性及其对SVCV的敏感性进行系统的研究和比较。本研究对GCO的生长特性、SVCV在该细胞中的增殖特性等进行了研究，以期为GCO细胞系的使用、维护和应用提供基础数据。

1 材料与方法 1.1 病毒、细胞、试剂和仪器 1.1.1 细胞系

本研究使用的4种鱼类细胞系：GCO细胞系、鲤(Cyprinus carpio)上皮瘤细胞 系(EPC)、肥头鲤(Pimephales promelas)细胞系(FHM)、大鳞大麻哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)胚胎细胞 系(CHSE-214)，均为中国科学院水生生物研究所赠。

1.1.2 病毒

SVCV 10/3株为英国环境、渔业及水产科学研究中心(The Centre for Environment，Fisheries and Aquaculture Science，CEFAS)实验室赠送；使用前测定病毒滴度，并将病毒悬液稀释至10³ TCID₅₀/50 μl待用。

1.1.3 试剂

CELL LAB ApoScreen^TM Annexin V-FITC Apoptosis Kit及DNA Prep Reagent kit购自美国Beckman公司。细胞培养液均购自GIBCO(美国)，戊二醛、秋水仙素、卡诺固定液、四氧化锇、树脂包被购自美国Sigma公司。

1.2 GCO 细胞系生物学特性 1.2.1 GCO细胞生长特性分析

将初始浓度为10⁴ cell/ml的GCO细胞悬液加入到6个12孔板中，分别置于15℃、20℃、25℃、30℃的培养箱中培养。在培养至第1、2、3、4、5、6、7天时，每个温度培养的细胞分别取3孔进行消化，测定细胞数量，绘制细胞生长曲线。

1.2.2 GCO细胞周期分析

对第345代GCO细胞系进行细胞周期研究。将细胞转至6孔板后，约35 h后细胞处于指数生长期，形成70%-80%的汇合层。用胰蛋白酶消化法收集细胞，做成单细胞悬液，室温下1000 r/min离心5 min，收集沉淀，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，1000 r/min离心5 min，收集沉淀。先用20-50 μl/ml的杜氏磷酸盐缓冲液(D-PBS)将细胞沉淀充分打散成单个细胞，用4℃预冷的70%冰乙醇1 ml重悬，4℃过夜。采用流式细胞仪(Cytomics FC 500 Beckman Coulter)进行细胞周期检测。

1.2.3 GCO细胞核型分析

采用Ye等(2006)的方法制备第345代GCO细胞染色体，进行核型分析。待细胞贴壁稳定生长36 h后，在培养基中加入0.8 μg/ml秋水仙素，孵育4 h。吸去培养基，PBS清洗，用胰蛋白酶消化，收集细胞，1500 r/min离心5 min。去上清液，加入5 ml 0.075 mol/L的KCl，低渗25 min。缓慢加入1 ml新配的预冷卡诺固定液，固定15 min。 1500 r/min离心5 min，弃上清液，重复此步骤3次。冷滴片法滴片(Freshney，2010)，待载玻片干燥后，用5%吉姆萨染液染色25 min，干燥镜检，随机统计 100个细胞分裂相的染色体数目(Levan et al，1964)。

1.2.4 GCO细胞系对SVCV的敏感性分析 1.2.4.1 病毒生长曲线

准备足够的GCO细胞，用胰蛋白酶消化后，加入新鲜的细胞培养液。测定细胞浓度，稀释至10⁵ cell/ml。在9个12.5 cm²的细胞瓶中，接入3 ml GCO细胞悬液。24 h后接种300 μl滴度为10³ TCID₅₀/50 μl的SVCV悬液，置于20℃下培养。每隔24 h，取3瓶，反复冻融3次，用细胞培养液进行10倍系列稀释，待用。在96孔板中，接种新鲜的GCO细胞，测定每瓶细胞中SVCV的滴度。根据Yan等(2011)的方法，绘制20℃时SVCV在GCO细胞中的生长曲线。

1.2.4.2 GCO细胞系和其他常用鱼类细胞系对SVCV易感性的比较

SVCV在不同细胞内滴度测定：在4个25 cm²的细胞瓶中，分别准备GCO、EPC、FHM和CHSE-214细胞系。在各细胞系最适培养温度下培养24 h后，接种500 μl滴度为10³ TCID₅₀/50 μl的SVCV悬液，置于20℃培养，每天观察是否出现细胞病变效应(CPE)。待CPE完全后，反复冻融3次。准备新鲜的EPC细胞用于病毒滴度的测定。

SVCV诱导不同细胞凋亡情况分析：根据Riccardi等(2006)的方法，分别将GCO、CHSE-214、EPC和FHM细胞转至6孔板中。24 h后，每孔接种100 μl滴度为10³ TCID₅₀/50 μl的SVCV悬液，并设置空白对照，置于20℃培养箱中培养48 h。用胰蛋白酶消化细胞，制成细胞悬液，用冰PBS洗涤细胞2次，弃上清液。用试剂盒中的1×结合缓冲液重悬细胞，细胞浓度达到1×10⁶-1×10⁷ cell/ml。每个实验管中加入10 μl Annexin V-FIT，轻柔涡旋震荡，避光冰置15 min，然后加入380 μl冰冷的1×结合缓冲液，再加入10 μl碘化丙啶(PI)，用于之后仪器分析。

1.2.4.3 电镜观察SVCV感染GCO细胞

用SVCV病毒感染单层GCO细胞，在CPE出现明显时，收集细胞。1500 r/min离心10 min，用PBS洗涤2次后，用含2.5%戊二醛的PBS(0.1 mol/L，pH为7.2)固定过夜。再用PBS洗涤细胞，用1%四氧化锇固定90 min后，最后用PBS洗涤2次。用梯度浓度的乙醇脱水，树脂包被，超微切片机(Reichert-Jung)超薄切片，用透射电镜(JEOL JEM-1000CX II，日本)观察(100 kV)。

2 结果与分析 2.1 GCO细胞系特性 2.1.1 生长特性

GCO细胞系是从草鱼性腺组织分离建立的连续细胞系，呈上皮样形态，细胞间存在接触抑制，无重叠生长(图 1)。从GCO细胞的生长曲线(图 2)可以看出，25℃最适宜GCO的生长。GCO在贴壁生长后，第1天生长较慢，第2天生长开始加快，进入对数生长期，持续3 d左右后进入平台期。

2.1.2 细胞周期

应用流式细胞仪对第345代的GCO细胞进行细胞周期检测，发现GCO核型正常，为二倍体(图 3)。GCO在G1期的DNA含量占88.03%，在S期的DNA含量占1.78%，表明GCO增殖活力旺盛。

2.1.3 细胞核型

对100个分裂中期的细胞进行染色体数目统计分析。结果显示，在GCO细胞系染色体中，2n=48的分裂相占(98%)(图 4)，二倍体染色体数目出现频率非常高，其他非整数倍体只占了很小的比例。

2.2 GCO 细胞系对 SVCV 的敏感性 2.2.1 病毒生长曲线

SVCV接种GCO细胞出现典型CPE(图 5)后，检测SVCV的滴度，并绘制病毒的生长曲线(图 6)。

2.2.2 GCO和其他几种常用鱼类细胞系对SVCV易感性的比较

SVCV分别接种GCO、EPC、FHM和CHSE-214。出现CPE后，根据殷震等(1997)的方法测定TCID₅₀(表 1)。从表 1可以看出，SVCV在GCO和EPC的滴度明显高于FHM和CHSE-214。

2.2.3 SVCV诱导不同细胞凋亡

通过流式细胞仪检测SVCV诱导的GCO、EPC、FHM和CHSE-214。发现SVCV引起GCO的凋亡率为38.0%，EPC为30.7%，FHM为17.5%，CHSE-214为13.3%(图 7)。

2.2.4 电镜观察SVCV感染GCO细胞系

将SVCV接种GCO细胞后，电镜观察可见，在GCO细胞质内有典型弹状病毒颗粒(约为140 nm，图 8)。

3 讨论

本研究通过对GCO细胞生长曲线绘制和形态学观察等发现，GCO细胞的适宜生长温度为15-28℃，最适生长温度为25℃。一种细胞系的生长温度在一个宽泛的范围，使该细胞系具备了可以分离淡水鱼病毒和冷水鱼病毒的潜力(Nicholson et al，1987)。GCO细胞系的这一特点使得它未来可以广泛地用于水生动物病毒的分离。通过对GCO细胞系细胞周期、染色体核型的分析发现，GCO细胞系呈典型的二倍体特征，染色体数为2n=48，这与舒琥等(2014)和Beck等(1984)描述的草鱼的染色体特征相符，说明GCO细胞系保持着稳定而正常的草鱼生理学特征，未发生变异，是可靠的病毒分离与检测的工具。

目前，SVCV病毒已经在世界范围内广泛存在，可以感染鲤鱼(肖克宇等，2004)、鲫鱼(Carassius auratus)(Rougée et al，2007)等多种鲤科鱼类，造成鱼类多器官感染。SVCV存在多种分离株，如欧洲株、亚洲株等。世界动物卫生组织(OIE)推荐使用EPC分离SVCV病毒，但就目前的现状，EPC不足以全面地对进出口鲤科鱼类SVCV感染情况进行监测，这就需要寻找更多的SVCV敏感细胞。

本研究通过接种SVCV病毒，检测细胞凋亡、CPE观察、病毒粒子观察，发现SVCV能够很好地在GCO细胞内增殖，出现明显的病变。与其他已知的SVCV易感细胞相比，GCO细胞对SVCV更加易感，可以快速出现CPE，病毒滴度更高。研究结果显示，GCO细胞可以作为分离SVCV病毒的可靠实验工具。

研究表明，GCO对多种水生动物病毒有敏感性。张奇亚等(2012)用草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV，也称为草鱼出血病病毒Grass carp hemorrhage virus，GCHV)感染GCO细胞，通过电镜在GCO细胞内观察到病毒粒子，诱导GCO细胞形成含多个细胞核的合胞体，细胞变大并发生崩解。这一现象说明，GCO细胞可以用来分离GCHV病毒，但敏感性不如草鱼肾脏细胞(CIK)(肖雪，2007)¹⁾。江育林等(1999)用GCO细胞从甲鱼(Amyda sinensis)中分离到甲鱼虹彩病毒(STIV)，孙颖杰等(2009)用GCO细胞从石鲽鱼(Platichthys bicoloratus)中分离到牙鲆(Paralichthys olivaceus)弹状病毒。GCO细胞具有生长活力强、细胞纯度高、细胞形态典型以及对病毒的特异性高等优点，是一个具有广阔应用前景的生物模型。

1) 肖雪. 草鱼呼肠孤病毒人工感草鱼的条件筛选和病理学研究. 四川农业大学硕士研究生学位论文, 2007, 2–3