牙鲆(Paralichthys olivaceus)个体大、肉质细嫩鲜美，经济价值高，是我国海水增养殖重要的鱼类之一。近几年，对于牙鲆的研究主要集中在生化因子(温度、盐度、光照周期、光照强度)对牙鲆各个生化指标的影响、基因克隆和表达、生长、家系、疾病等方向。环境胁迫、温度、光照、养殖密度等对牙鲆繁殖内分泌功能的影响日益引起了国内外学者的关注。但关于牙鲆性腺发育成熟过程中的膜孕激素受体(mPR)的调控机制的研究却鲜有报道(史宝, 2010)¹⁾。

1) Shi B. Study on the molecular mechanisms of reproductive endocrinology in Paralichthys olivaceus and Paralichthys lethostigma. Doctoral Dissertation of Ocean University of China, 2010, 1-176 [史宝.牙鲆繁殖内分泌分子机理研究.中国海洋大学博士研究生学位论文, 2010, 1-176]

在孕激素诱导鱼类卵母细胞成熟过程中，不是通过激活卵母细胞内的核类固醇受体发挥生理作用，而是通过结合在细胞表面的膜受体快速地发挥生理功能。膜孕激素受体(mPRs)在孕激素参与的调控过程中起介导作用，自Patiño等(1990)首次报道在硬骨鱼类中发现云纹犬牙石首鱼(Cynoscion nebulosus)的卵巢组织中存在mPR以后，对于硬骨鱼类mPRs的研究逐渐开展起来。mPRs在卵母细胞成熟中发挥生理调节作用最有说服力的证据是在研究硬骨鱼类卵母细胞的孕激素受体中获得的，Zhu等(2003)从云纹犬牙石首鱼卵巢中克隆了该膜受体cDNA序列，随后在其他多种鱼类中发现有mPRs家族成员的存在(Tokumoto et al, 2006; Hanna et al, 2006; 史宝, 2010¹⁾、2013; 柳学周等, 2015)。Tokumoto等(2006)研究证明，金鱼(Carassius auratus)的卵母细胞膜上有mPRα蛋白表达。虽然前期实验克隆出牙鲆的mPRα基因，但目前还没有对mPRα基因在牙鲆组织上的表达定位研究的报道。

本研究使用qRT-PCR、Western blotting、原位杂交和免疫组化等方法研究牙鲆mPRα mRNA和蛋白在不同组织和不同发育时相卵母细胞中的表达特征，探讨mPRα在卵母细胞成熟发生过程中的作用。对牙鲆mPRα在脑和卵巢中的表达研究，可以进一步了解牙鲆的繁殖机理，为养殖生产提供新的理论参考，从而更有效地调控牙鲆的繁殖以提高它们的繁殖能力，进一步推动鲆鲽类产业发展。

1 材料与方法 1.1 实验动物

实验用牙鲆雌鱼采自山东青岛忠海水产有限公司，为野生亲鱼自然产卵后人工育苗得到的健康苗种，经室内人工养成达到性成熟的F₁代亲鱼。牙鲆雌鱼全长为40-60 cm，体重为1428.7-2508.3 g，其培育条件：全年开放流水培育，水温为8-25℃，盐度为27-31，pH为7.8-8.4，溶解氧5 mg/L以上。在牙鲆繁殖季节，挑选腹部膨大、松软的亲鱼，使用MS-222麻醉雌鱼后解剖，按照牙鲆卵巢发育的组织学特征，在显微镜下将卵母细胞按时相分类取样，从发育Ⅴ期卵巢分离到Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ时相卵母细胞，用液氮将卵母细胞速冻并-80℃保存，用于总RNA提取。雌鱼麻醉后解剖、留取各组织样品：在4℃条件下使用4%多聚甲醛(溶于0.01 mol/L磷酸盐缓冲液PBS中)固定20 h，梯度甲醇(25%、50%、75%和100%甲醇溶于0.01 mol/L PBS)脱水，在-20℃条件下保存于甲醇中的样品，一部分用于免疫组化，一部分样品用于原位杂交；部分性腺组织固定在Davidsons’s AFA中，用于验证性腺发育状况；使用液氮速冻后保存在-80℃的组织样品，用于总蛋白的提取。

1.2 实验试剂

Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ内切酶，T4 DNA快速连接酶购自NEB，Dig RNA Labeling Kit (SP6/T7)碱性磷酸酶标记的地高辛抗体以及NBT/BCIP显色试剂盒购自Roche公司。引物的合成由TaKaRa生物公司完成；Trans5α(DH5α)表达菌感受态细胞、动物组织蛋白提取试剂购自北京全式金公司(TransGen Biotech)；HRP标记的羊抗兔IgG抗体购自上海生工公司。Taq聚合酶、SYBR Premix Ex Taq、RNAiso Plus、DNA marker和RNA酶抑制剂购自TaKaRa公司，蛋白浓度测定试剂盒购自Thermo Scientific公司，多聚甲醛、MS-222购自于Sigma公司，去离子甲酰胺购自AMRESCO公司，蛋白酶K购自默克公司，山羊血清购自博奥森公司，蛋白胨和酵母粉购自OXOID公司。

1.3 总RNA提取、cDNA的合成和荧光定量PCR

牙鲆mPRα mRNA在第Ⅴ时期的不同发育阶段卵母细胞的表达分析：每个卵母细胞发育时相设置4个重复，从第Ⅴ时期的牙鲆中分别挑取Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ时相卵母细胞，提取总RNA进行反转录并参照TaKaRa公司的PrimerScript^TM RT Reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒合成cDNA第一链并用于基因表达分析。正反引物分别为YP-mPRα-F (TCTTGGTGAA GTGGCAGGAGAT)和YP-mPRα-R (CGCTGAAGGAG AGGTAGGTGAA)。荧光实时定量PCR (qRT-PCR)反应体系20 μl：1 μl cDNA模版，0.5 μl引物(10 μmol/L)，10 μl SYBR Premix ExTaq^TM Ⅱ和8 μl ddH₂O。采用两步法PCR扩增程序，反应条件为95℃预变性30 s，95℃ 5 s，58.5℃ 30 s共40个循环。使用β-actin基因(β-actinF：5′-GAAATCGCCGCACTGGTT-3′；β-actinR：5′-GCCCATACCCACCATCACTC-3′)作为内参对照，用以校正所有样品中RNA的量。qRT-PCR及信息的收集都在Mastercycler ep realplex实时定量PCR仪(Eppendorf公司)上进行。程序运行完成后进行熔解曲线分析以确定引物及反应是否正常。每个样品设置3个平行复孔，重复3次实验，设阴性对照，以确认实验结果的可靠性。

1.4 mPRα/pBST-18质粒的构建

根据牙鲆mPRα cDNA序列，设计引物，由大连宝生物合成。上游：5′-AAGCTTAGCCCTGTGGTTCA CCGCATC-3′；下游：5′-GAATTCAACGGCACGTACA CGCTTTCG-3′。预期扩增产物长度为360 bp。扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，65℃复性30 s，72℃延伸1 min，重复30个循环，最后72℃延伸10 min，1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。重组质粒构建：采用凝胶回收试剂盒回收并纯化PCR产物。分别用限制性内切酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ对回收的PCR产物和载体pBST-18进行双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳检测后，试剂盒回收。通过T4快速连接酶进行连接，将PCR产物克隆到pBST-18载体中。再将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取PCR检测阳性克隆，扩增培养，小量提取质粒，用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ进行双酶切鉴定，然后测序验证。

1.5 地高辛标记mPRα正、反义RNA探针的合成和纯化

将扩增后的阳性菌落提取的质粒分别用限制性内切酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶切，使其完全线性化，1%琼脂糖电泳检测并回收。回收的酶切片段即为合成正、反义RNA探针的模板。按Roche公司的DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)试剂盒说明书分别用SP6、T7转录酶进行体外转录，详细操作参照产品说明书，合成地高辛标记的正、反义RNA探针。合成的RNA探针用1%琼脂糖电泳和紫外分光光度计鉴定检测。

1.6 原位杂交分析mPRα mRNA在成熟雌鱼各组织中的定位

采用Roche公司的DIG Wash and Block Buffer Set、Blocking Reagent和NBT/BCIP Stock Solution试剂盒进行。二甲苯脱蜡处理3次(每次5 min)，无水乙醇处理2次(每次10 min)，95%、70%、50%乙醇各5 min逐级脱水。4% PFA-PBS固定10 min。PBS洗涤3次，每次10 min。0.2 mol/L的HCl处理10 min。PBST冲洗2次，每次10 min。10 μg/ml蛋白酶K消化10 min。PBST冲洗3次(每次5 min)。加入含tRNA和肝素预杂交液，70℃预杂交8 h，再加入反义RNA探针200 ng的杂交液，70℃过夜。50%无tRNA和肝素的预杂交液和50% 2×SSC、70℃，15 min，0.2×SSC、70℃，1 h。1×MAB室温5 min。含10%山羊血清的封闭液室温封闭，6 h。1:500封闭液稀释的抗体，4℃过夜。PBST室温冲洗6次(每次15 min)；碱性磷酸缓冲液室温2次(每次10 min)。加200 μl BCIP/NBT底物溶液，置黑暗处显色，观察颜色变化。待显色达到理想着色后，PBST洗涤5次(每次5 min)终止反应，4% PFA-PBS固定10 min，PBST洗3次(每次5 min)；酒精梯度脱水、二甲苯透明，封片，拍照。

1.7 成熟雌鱼各组织中mPRα蛋白定量表达

取冻存的各组织(约100 mg)，加入1 ml动物组织蛋白提取试剂，使用Pro精密手持匀浆器充分匀浆，冰浴中静置30 min，于4℃、12000 r/min离心30 min，取上清液即得到组织蛋白提取液。12% SDS-PAGE电泳检测提取蛋白的质量，并使用蛋白测定试剂盒测定组织总蛋白浓度。

分析牙鲆mPRα蛋白序列选择抗原表位，合成相应的免疫多肽；将合成的多肽常规免疫新西兰大白兔，制备抗体。使用多克隆抗体进行Western blotting检测。12% SDS-PAGE蛋白电泳，每孔上样量约80 μg，220 V 25 min。缓冲液泡凝胶15 min，转印按胶的大小剪滤纸和PVDF膜，将滤纸在缓冲液中浸泡15 min。PVDF膜甲醇中浸泡1 min，缓冲液中浸泡15 min活化，按阳极-滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸-阴极的顺序放入半干式转膜仪400 mA 25 min，取出PVDF膜，1×PBST洗涤。5%脱脂奶粉溶液封闭(1×PBST稀释)室温3 h，洗涤，加一抗和3%BSA (1:2000)，摇床，室温2 h，洗涤。二抗(羊抗兔IgG抗体)(1×PBST 1:2000稀释)摇床，室温2 h，洗涤，DAB显色拍照，分析灰度。

1.8 mPRα蛋白在成熟雌鱼各组织中的定位表达

将保存在100%甲醇中的样品取出，使用无水乙醇处理2次，每次10 min；二甲苯透明，石蜡包埋，7 μm厚度石蜡切片，37℃烘干。具体免疫组化切片处理过程和条件如下(阴性对照：1×PBS代替一抗，其余步骤同下)：二甲苯脱蜡2次，每次5 min；梯度乙醇复水各3 min；1×PBST洗涤；3% H₂O₂(溶于甲醇中)室温孵育15 min封闭内源酶；洗涤；0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液微波炉加热沸腾后，中低档保持95℃ 20 min，自然冷却至室温修复抗原；洗涤；3% BSA封闭(溶于1×PBST)摇床上室温振摇2 h；抗mPRα抗体稀释(1:1000)，溶于3% BSA滴加到载玻片上，使其完全覆盖组织切片，湿盒中室温过夜；洗涤；二抗即羊抗兔IgG抗体(1:1000稀释在1×PBST中)滴加到载玻片上，湿盒中室温1 h；洗涤；DAB显色；洗涤；苏木精染液复染3-5 min；0.1% HCl分化复蓝，立即自来水冲洗；梯度乙醇脱水；二甲苯透明2 min；封片；拍照。

1.9 数据统计分析

使用SPSS 17.0软件中的单因素方差分析(One-way ANOVA) (Tukey’s HSD检验)、Duncan’s多重比较分析和AIC.AlphaView成像分析系统(Cell Biosciences Inc)分析蛋白灰度。P < 0.05为差异显著。

2 结果 2.1 第Ⅴ期卵母细胞不同时相mPRα mRNA相对表达量比较

将牙鲆成熟期卵巢中卵母细胞分为5个时相。如图 1所示，mPRα基因的表达最高值出现在牙鲆发育Ⅴ时相的卵母细胞(P < 0.05)。表明mPRα在卵母细胞的成熟期Ⅴ时相发挥重要的作用，其他时相有表达，但表达量低于Ⅴ时相(图 1)。

2.2 mPRα蛋白和mRNA在不同组织中的表达

对牙鲆不同组织中mPRα总蛋白表达量进行Western-blotting检测，结果见图 2，mPRα蛋白表达量在脑、卵巢中相对较高，其他组织中也有表达，但表达量相对较少。

用所标记的正反义探针分别与牙鲆卵巢、肝脏、头肾、肾脏、脑组织中mRNA进行原位杂交反应。如图 3所示，作为阳性对照的A、B、C、D、E、F、G反义探针显示阳性结果，作为阴性对照的图 3-a、b、c、d、e、f的正义探针没有杂交显色信号。用多克隆抗体分别与牙鲆卵巢、肝脏、头肾、肾脏、脑组织蛋白进行免疫反应，结果如图 4所示，一抗孵育的A、B、C、D、E、F，放大结果1、2、3、4、5、6显示免疫显色结果，用1×PBS代替一抗孵育作为阴性对照的图 4-a、b、c、d、e、f的没有免疫显色信号。

图 3-A和图 4-A显示，在成熟卵巢组织中，mPRα mRNA和蛋白在卵母细胞膜上显著性表达。图 3-B、C、D、E显示，在其他组织中有mPRα mRNA表达，但定位不明显。图 4-B、D显示，mPRα蛋白在头肾、脑中有表达。图 3-C和图 4-C图显示，在肝脏，mPRα蛋白主要在胆小管周围显色。图 3-E和图 4-E显示，mPRα蛋白主要在肾脏的肾小管部位表达。

3 讨论 3.1 mPRα在卵母细胞成熟过程中的表达分析

在多种硬骨鱼类中发现mPRs的存在(Tokumoto et al, 2006; Berg et al, 2005; Hanna et al, 2006)。史宝(2010)¹⁾首先在牙鲆中克隆得到了mPRα全长序列，李晓晓(2013)²⁾研究发现，mPRα mRNA在雌性牙鲆卵巢不同的繁殖周期中均有表达，当卵巢发育至Ⅴ期时，mPRα的表达量达到最大值。本研究通过实时荧光定量技术分析牙鲆卵巢发育至Ⅴ期不同时相卵母细胞的表达，结果显示，mPRα mRNA表达的最高值出现在第Ⅴ时相卵母细胞中；处于第Ⅴ时相卵母细胞mPRα mRNA的高表达量进一步证明，mPRα在介导孕激素促进卵母细胞成熟的生理调节功能上发挥重要的作用。mPRα参与诱导卵母细胞成熟在硬骨鱼类中已有报道(Kazeto et al, 2005a、b; Thomas et al, 2004; Tokumoto et al, 2012)，但本研究首次将mPRα表达研究范围扩展到牙鲆卵母细胞不同时相中。RNA原位杂交、免疫组化结果显示，mPRα mRNA和蛋白都在牙鲆卵巢成熟期的卵母细胞膜上显著表达，进一步证明其作为膜上受体参与孕激素的调控作用。金鱼中也发现在卵母细胞膜上有mPRα蛋白表达(Tokumoto et al, 2012)，与本研究的结果相似。

1) Shi B. Study on the molecular mechanisms of reproductive endocrinology in Paralichthys olivaceus and Paralichthys lethostigma. Doctoral Dissertation of Ocean University of China, 2010, 1-176 [史宝.牙鲆繁殖内分泌分子机理研究.中国海洋大学博士研究生学位论文, 2010, 1-176]

2) Li XX. Study on the physiological function of membrane progestin receptor in the reproductive cycle of flatfish. Master's Thesis of Shanghai Ocean University, 2013, 1-73 [李晓晓.膜孕激素受体在鲆鲽类繁殖周期中的生理功能研究.上海海洋大学硕士研究生学位论文, 2013, 1-73]

3.2 mPRα表达与定位分析

本研究用Western blotting检测mPRα蛋白在牙鲆不同组织的表达，结果显示，mPRα蛋白在性腺、脑中表达量较高，在肝、肾、头肾组织中表达较低。RNA原位杂交、免疫组化结果显示，mPRα mRNA和蛋白都在卵巢成熟期的卵母细胞膜上显著表达，李晓晓(2013)¹⁾发现牙鲆mPRα mRNA较丰富地表达于脑、垂体和卵巢组织，而在头肾、肾等组织中表达相对微弱。本研究发现，牙鲆mPRα蛋白在不同组织中的表达量分析结果和mPRα mRNA表达量变化的结果大体一致，为mPRα mRNA在组织中的表达提供了佐证。Zhu等(2003)采用Northern杂交方法在云纹犬牙石首鱼的繁殖和神经内分泌组织检测到mPRa的表达，在成熟的云纹犬牙石首鱼的卵母细胞检测到mPRa蛋白阳性信号，与本研究的结果相似。Kazeto等(2005a、b)在斑点叉尾(Ietalurus punetaus)检测到mPRa mRNA表达，主要分布在脑、垂体和性腺中。

1) Li XX. Study on the physiological function of membrane progestin receptor in the reproductive cycle of flatfish. Master's Thesis of Shanghai Ocean University, 2013, 1-73 [李晓晓.膜孕激素受体在鲆鲽类繁殖周期中的生理功能研究.上海海洋大学硕士研究生学位论文, 2013, 1-73]

牙鲆mPRα作为孕激素受体的一种，其mRNA和蛋白在脑中表达丰富，表明了mPRα参与介导牙鲆孕激素调控其神经内分泌系统。本研究采用RNA原位杂交、免疫组化以及Western blotting方法在性成熟雌性牙鲆的免疫相关组织(肾脏和头肾)检测到mPRα mRNA和蛋白表达，并在肾脏的肾小管附近表达丰富；另外，在肝脏组织主要在胆小管中表达。因此，在牙鲆中，孕激素也可能通过mPRα在系统交互连接部位和组织行使其调控免疫系统的功能，而且mPRα参与介导孕激素调控雌性牙鲆机体的神经-内分泌-免疫网络系统(内分泌调控为主)，但具体机制尚不明了。

mPRα属于膜孕激素受体家族的一员，相近的亚型还有mPRβ和mPRγ，关于这3个亚型的研究报道相对比孕酮受体膜组分(PGRMC)多；在国内仅见本课题组对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)(史宝等, 2013)和条石鲷(Oplegnathus fasciatus)(史宝等, 2015)开展的膜孕激素受体mPRα通过下丘脑-垂体-性腺轴调控繁殖的研究。本研究探明了卵母细胞成熟过程mPRα mRNA的时序表达特征、mPRα基因和蛋白在繁殖相关组织的定位分析，但关于mPRα参与卵母细胞成熟、抑止细胞凋亡和调控激素分泌的机制、自身启动子和外源激素影响下mPRα基因转录调控机制以及mPRα真核表达产物及其促进卵母细胞成熟作用的研究尚不明了，如何解析这些问题需今后更深入的探索。本研究为进一步研究膜孕激素受体的功能特征以及繁殖过程的生理作用奠定重要的理论基础。