人类活动与气候变化双重因素造成了海洋渔业资源的不断衰退，开展重要经济渔业种群的修复与重建日益受到各国政府和学者的重视。世界范围内，增殖放流已经成为修复与重建衰退渔业种群最直接和最有效的途径，同时也是一种渔业资源管理的有效工具(Bell et al, 2008)。2006年以来，我国开展了大规模水生生物增殖放流活动，近年来的研究证明，增殖放流已对我国近岸渔业资源修复起到了积极的促进作用(程家骅等, 2010; 成为为等, 2014; 姜亚洲等, 2016)。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我国重要的渔业经济物种，近年来，由于过度捕捞和近岸环境变化加剧，其资源量一直处于下降状态(单秀娟等, 2012)。我国自20世纪80年代开展牙鲆增殖放流研究(吴鹤洲等, 1987)，2006年以来，山东等沿海地区年放流牙鲆苗种数量达数千万尾。然而，我国在牙鲆放流苗种的存活、生长及迁移路线、放流与野生种群互相作用等方面的研究较少，不利于对资源修复效果的评价。“标志放流-回捕”技术是水生生物增殖放流效果评价的主要手段。在利用人工培育苗种进行增殖放流时，选择适宜的标志方式对于评价放流种类的增殖效果显得尤为重要(Hamel et al, 2012)。在牙鲆标志放流技术方面，我国已开展了体外挂牌标记、耳石标记等研究(刘奇, 2009¹⁾; 刘芝亮等, 2013)，但体外挂牌标记存在对小规格苗种操作损伤大、放流苗种易被捕食等问题，耳石染色存在标记不易检测、易消褪等问题。因此，亟待开发更为有效的标记方式用于牙鲆小规格苗种标志放流和效果评价。

1) Liu Q. Japanese flounder marking techniques and juveniles released for stock enhancement. Masterxs Thesis of Ocean University of China, 2009 [刘奇.褐牙鲆标志技术与增殖放流试验研究.中国海洋大学硕士研究生学位论文, 2009]

编码金属标签(Coded-wire tag, CWT)于20世纪60年代开始应用于鲑鳟鱼类的标志放流(Jeffers et al, 1963)，因其具有体积小、易操作、精确度与回收率高等优点，成为应用最为广泛的标志方式(张堂林等, 2003; Simon et al, 2011)。CWT标志技术已在30多种鱼类的增殖放流和资源管理中应用，特别是在鲑鱼资源管理领域取得了较为显著的成就(Lorenzen et al, 2010; Mohr et al, 2013; Ashton et al, 2014; Hinrichsen et al, 2016)。我国近年来开始应用CWT标记放流鱼类，但仅在达乌尔鳇(Huso dauricus) (杨晓鸽等, 2013)、鳜鱼(Siniperca chuatsi) (张彬等, 2007)、蒙古鲌(Cultermongolicus) (Lin et al, 2012)等少数几种鱼类中进行了研究，尚未见对鲆鲽鱼类标记效果的报道。本研究以鲆鲽鱼类典型鱼种--牙鲆为研究对象，测试了CWT对3种规格牙鲆苗种的标记效果，以期为开发牙鲆标志放流新标记技术及增殖效果评价提供技术支撑。

1 材料与方法 1.1 实验鱼来源

本实验于2014年7-9月在山东青岛贝宝海洋科技有限公司进行。实验用鱼为该养殖场人工培育的牙鲆苗种，苗种色泽正常、大小规格整齐、健康活泼、摄食良好。本年度苗种培育所用受精卵来自于同一批野生亲鱼，苗种由产卵周期中3批次受精卵培育而来。

按照苗种规格的不同设置3个实验组：小规格组、中规格组和大规格组，每组设置1个对照和2个重复。随机选取不同规格苗种30尾，分别测定全长(TL)和体重(BW)，同时利用游标卡尺测定体厚度(BT)，计算全长与体重间的回归关系式：

小规格组：TL=-1.4761 BW²+5.7679 BW+0.6117 (R²=0.9521)

中规格组：TL=2.4064 BW²-25.8520 BW+77.5880 (R²=0.8918)

大规格组：TL=0.1159 BW²-3.0596 BW+32.145 (R²=0.9692)

实验开始前，为减少单尾鱼生长参数测量带来的人为操作胁迫，各对照组和实验组的苗种分3批次测定总体重，根据得到的回归关系式，计算各对照组和实验组全长数据。实验用苗种数量与规格见表 1。

不同规格组的苗种于实验前3 d分别放入体积为1 m³的方形抹角水泥池中暂养。实验用水为砂滤海水，池内水深为60-70 cm，水温为25-27℃、盐度为27-29、pH为7.8-8.2、溶解氧6 mg/L以上。暂养期间，投喂配合饲料，饱食投喂，每日清理培育池1次。

1.2 CWT标记操作方法

本研究所用CWT系统购自美国西北海洋技术公司(NMT公司，美国)，标签直径为0.25 mm，长度为1 mm (图 1，右图)，利用配套的标记器进行标记操作(图 1，左图上)。标记器针头外径为0.47 mm，内径为0.3 mm。

实验鱼标记操作前饥饿24 h。CWT标记操作前，所有实验鱼都以MS-222进行麻醉，小规格、中规格和大规格苗种的适宜麻醉剂量分别为30 mg/L、50 mg/L和80 mg/L。

将麻醉的苗种置于湿润的毛巾上进行标记操作。CWT标记部位在背部肌肉(侧线弧后肌肉最厚处，背鳍基部下方约5个鳞片处，标记方向与鳞片同向) (图 2)。由受过专门技术培训的人员进行标记操作。标记时，将标记器与鱼体呈45°角，使针头自鳞下间隙处斜向插入，斜入肌肉2-3 mm深度，轻轻推动撞针将标签推入鱼体内。标记后，使用系统自带探测器(图 1，左图下)扫描被标记鱼标签部位，确认标签植入鱼体。苗种标记后，迅速置于洁净的海水中复苏。

1.3 标记苗种成活率和脱标率检测

标记操作完成后，各实验组分别选取100尾成功标记并可在3 min内复苏的苗种，继续在原池内养殖，养殖时间为30 d。养殖条件同1.1，日换水率为300%。暂养期间投喂配合饲料，投喂量为鱼体重的3%-5%。

标记苗种养殖期间，观察标记苗种的游泳行为、摄食行为。在1 d、5 d、15 d和实验结束时，使用探测器检测各实验组的CWT脱标情况，及时拣出脱标和死亡的苗种，并记录全长、体重等数据，对死亡苗种检测CWT标签是否脱落，计入成活率和脱标率。

1.4 CWT标记对苗种生长的影响

在养殖结束时，测量标记苗种的全长和体重，计算特定生长率(SGR)，通过与对照组苗种SGR的对比分析，评估CWT标记对实验鱼生长的影响，计算方法：

$ \text{SGR}=\frac{\text{ln}{{W}_{\text{2}}}-\text{ln}{{W}_{\text{1}}}}{\Delta t}\times 100 $

式中，W₁为起始个体体重，W₂为实验结束后个体体重，Δt为实验持续时间。

1.5 统计分析

实验用牙鲆苗种的生长数据表示为平均值±标准差(Mean±SD)，实验苗种死亡率、脱标率、累计死亡率等数据均为各规格实验组2个平行的平均值。利用单因素方差分析(One-way ANOVA)统计各组实验苗种死亡率、脱标率、生长的差异显著性。利用相关性分析研究标记苗种全长、体厚度与死亡率的关系。统计分析使用SPSS 16.0软件，设置显著性水平P=0.05，当P＜0.05时为差异显著。

2 结果 2.1 CWT标记对苗种行为与摄食的影响

在进行CWT标记后，不同规格的苗种都可在3 min内在清洁海水中苏醒，并正常游动，表明麻醉剂剂量和标记操作方法适宜。中规格和大规格苗种在标记后的第2天即可正常跃起摄食。小规格苗种在标记后的第3天恢复正常摄食。

2.2 苗种规格与CWT标记死亡率及脱标率的关系

本研究发现，CWT脱标均发生在标记后的4 d内，且整个实验过程中只有小规格苗种脱标率最高(3.3%)，中规格苗种的脱标率为2.4%，而大规格苗种仅为0.7% (表 2)。

用CWT标记后，小规格苗种的死亡率最高(13%) (P＜0.05)，中规格和大规格苗种标记的死亡率分别为2%和1%。相关性分析表明，标记死亡率(M)与苗种全长(TL)的关系符合模型：M=0.7254TL²-15.3220 TL+ 79.4260 (R²=0.9601) (图 3)；标记死亡率(M)与鱼体厚度(BT)的关系符合模型：M=1.3627 BT²-15.5610 BT+44.4330 (R²=0.9645) (图 4)。

2.3 CWT标记对实验鱼生长的影响

CWT标记后，各实验组的牙鲆苗种经30 d的培育，全长、体重和SGR变化结果见表 2。各实验组全长和体重生长与各自对照组差异不显著(P＞0.05)。小规格实验组苗种的SGR为0.035，其对照组SGR为0.037；中规格实验组苗种的SGR为0.015，其对照组SGR为0.017；大规格实验组苗种的SGR为0.012，其对照组为0.009。小规格组的SGR值最低，中规格组的SGR最高，但同规格实验鱼对照组与实验组SGR水平差异不显著(P＞0.05)，表明CWT标记对本实验中不同规格的牙鲆苗种全长和体重生长影响不显著。

3 讨论 3.1 CWT标记操作方法

自20世纪60年代以来，研究者们已在多种鲑形目、鲈形目和鳗鲡目等鱼类标志放流中应用CWT标签，表明CWT可用于标记小规格实验鱼且标签保持率高，是一种理想的标志方式(van Den Avyle et al, 2001; Brennan et al, 2007)，但尚未见CWT在鲽形目鱼类上应用的研究报道。本研究利用长度为1 mm的CWT标签，斜向埋植入牙鲆肌肉厚度最大的背部肌肉部位，进入鱼体内2-3 mm但并未穿透鱼体，标记成功率、标记苗种成活率和标签保持率均较高，表明本研究建立的CWT标记操作方法适宜于牙鲆等体侧扁鱼类。

标记部位的选择对于标记成功率影响较大，特别是对规格较小的鱼类尤为重要。在对鳜鱼的CWT标记研究中，研究者对其3个不同的部位进行了标记，并发现不同部位标记成活率等无显著差异，但以背部肌肉标记最为方便(张彬等, 2007)。CWT标记达乌尔鳇背部前、中、后部肌肉的标志保持率都可达92%以上，也表明背部肌肉是较为适宜的标记部位(杨晓鸽等, 2013)。其他一些游泳性鱼类如斑点叉尾(Ictaluruspunctatus)、蓝鳃太阳鱼(Lepomis macrochirus)、大口黑鲈(Micropterus salmoides)、金体美鳊(Notemigonus crysoleucas)等，由于身体肌肉厚度较大，可选择颊部、腹壁和鼻软骨等部位进行标记，标志保持率在91%-100%之间(Heidinger et al, 1998)。本研究选择背部肌肉作为标记部位，取得了较好的标记效果。另外，还测试了牙鲆颚弓提肌的CWT标记，结果显示，其脱牌率达8%，死亡率也达22%(未发表数据)，表明相比较而言，背部肌肉是牙鲆等体扁平鱼类进行CWT标记操作的理想部位。

3.2 适宜苗种规格选择与标记后暂养时间

CWT标签作为一种内部标记，可稳定附着在实验鱼肌肉内，避免了标记鱼因外部标记而易被捕食的风险，可大大提高标记放流苗种的成活率。即使是小规格苗种，利用CWT标记后，也不会影响苗种的游泳与摄食行为(张彬等, 2007; Mohr et al, 2013)。与其他游泳性鱼类不同的是，鲆鲽鱼类双眼位于身体一侧，且体型较侧扁，肌肉厚度较薄，标记难度较大，容易造成较高的脱标率和死亡率。本研究也发现，全长为5-6 cm的牙鲆苗种在CWT标记后出现了相对较高的死亡率(13%)，但较T型标志牌标记，CWT标记成活率明显提高(刘芝亮等, 2013)，表明其特别适合牙鲆小规格苗种标记。而利用CWT标记全长8.9 cm以上苗种时，成活率可达98%以上。本研究还发现，CWT标记牙鲆苗种后，各规格标记苗种与对照组苗种生长无差异，表明CWT标记没有对苗种生长产生明显影响，这与其他鱼类如蒙古鲌、鳜鱼等的研究结果类似(Heidinger et al, 1998; 张彬等, 2007; Lin et al, 2012)。另外，先前的研究也证实，由于CWT体积较小，标记创口微小，并且可在较短时间内愈合，组织兼容性较好，因此对鱼体的胁迫也小(Munro et al, 2003; Brennan et al, 2005)。综合考虑标记后成活率、脱标率等因素，今后在应用CWT标签标记牙鲆苗种时，苗种规格应达到全长6 cm以上。

目前，国际上多在实验室条件下预先测试不同的标志对水生生物的标记效果，标记后实验动物暂养时间越长，对于标记效果的评价就越可靠(Brattey et al, 2004)。本研究发现，CWT标记不同规格牙鲆苗种后，脱标率低于3.3%，且脱标都发生在标记后4 d内。CWT标记鳜鱼的研究表明，在CWT标记29 d内，标签保存率达97.9%，而在其后29-333 d实验期间内，标签保存率为100% (张彬等, 2007)。对欧洲鳗鲡(Anguilla anguila)、北极红点鲑(Salvelinus alpinus)幼鱼的CWT标志技术研究中，CWT标签脱落一般都发生标记后21 d内，其后不再出现脱标的情况(Thomassen et al, 2000; Kolari et al, 2006)。综合目前已有的鱼类CWT标记后暂养时间，本研究采用标记后暂养时间为30 d，完全可以实现对牙鲆幼鱼CWT标记的存活率和标签保持率的准确评价。

3.3 标记死亡率与苗种规格的关系

本研究发现，牙鲆苗种规格与标记成活率关系较为密切，小规格苗种(表 1，体厚度仅为2.5-2.9 mm)出现了相对较高的死亡率(13%)，而中规格和大规格实验鱼死亡率低，表明苗种标记死亡率具有鱼体规格依赖性的特点，这在其他一些鱼类的CWT标记实验中也有类似结果，如对蒙古鲌的CWT标记实验表明，小规格苗种在CWT标记后死亡率较高(Lin et al, 2012)。小规格苗种的标记死亡率可能与胁迫耐受力、体厚度等因素有关，具体原因有待于进一步分析确定。Lin等(2012)提出，建立实验鱼规格与标记成活率的评价模型，对于指导CWT的批量化应用具有重要意义。本研究建立了CWT标记牙鲆苗种的标记死亡率与全长、体厚度的数学评价模型，可为牙鲆标志放流时适宜标记苗种规格选择提供参考和技术支持。CWT标签由专门的设备进行检测(图 1，左图下)，灵敏度高，对带标实验鱼的检出率达100%，检出效果好，适宜在今后大规模标志放流中应用。