微卫星标记 (Simple sequence repeat, SSR) 因具有多态性丰富、共显性等优点而被广泛应用于种群的遗传结构分析、遗传连锁图谱构建和分子标记辅助育种等。与传统SSR开发技术相比，基于EST序列开发SSR具有成本低、周期短、与功能基因关联性强等特点而被广泛应用。在海洋双壳贝类中，EST-SSR标记的开发和应用已在泥蚶 (Tegillarca granosa)(董迎辉等, 2013)、文蛤 (Meretrix meretrix) (齐晓艳等, 2013)、蛤仔 (Ruditapes variegata)(闫路路等, 2015)、缢蛏 (Sinonovacula constricta)(刘博等, 2012a、b)、马氏珠母贝 (Pinctada martensii)(王忠良等, 2015) 和虾夷扇贝 (Patinopecten yessoensis)(李云峰等, 2010) 等多种贝类中报道。

栉江珧 (Atrina pectinata) 隶属于软体动物门 (Mollusca)、瓣鳃纲 (Lamellibranchia)、翼形亚纲 (Pterimorphia)、贻贝目 (Mytiloida)、江珧科 (Pinnidae)、江珧属 (Atrina)，俗称“土杯”、“马蹄”、“骚蛤蜊”等，广泛分布于温、热带近海海域，为海产底栖贝类，具有较高经济价值 (王如才等, 2008)。近年来，栉江珧遭遇生存环境的破坏和过度捕捞，出现资源量下降、种质资源退化和遗传多样性降低等问题，因此，开展栉江珧群体的种质资源评估和保护非常有必要。

目前，有关栉江珧群体遗传结构的研究较少。主要有采用AFLP标记对栉江珧不同地理群体进行遗传多样性分析 (陈丽娜, 2012)¹⁾，而SSR标记都通过磁珠富集法开发 (陈晓姣, 2012²⁾; 白临建, 2012³⁾; 李明爽, 2008⁴⁾)。本研究基于前期的栉江珧转录组测序，从得到的EST数据库中筛选和开发微卫星标记，并应用于栉江珧青岛群体的遗传多样性分析，以期为栉江珧的种质资源评估和保护提供基础资料。

1) Chen LN. Analysis of genetic structure of the comb pen shell Atrina pectinata and development of microsatellite loci in Acrossocheilus labiatus. Master's Thesis of Jimei University, 2012 [陈丽娜.栉江珧的群体遗传结构及厚唇光唇鱼微卫星位点的研究.集美大学硕士研究生学位论文, 2012]

2) Chen XJ. Development of the microsatellite and genetic structure of Atrina pectinata population. Master's Thesis of Jimei University, 2012 [陈晓姣.栉江珧微卫星分子标记的发育及其群体遗传结构的研究.集美大学硕士研究生学位论文, 2012]

3) Bai LJ. Effects of morphometric traits on weight traits and microsatellite markers based genetic diversity in the Atrina pectinata. Master's Thesis of Shanghai Ocean University, 2012 [白临建.栉江珧形态性状对重量性状的影响及五个野生群体遗传多样性的微卫星分析.上海海洋大学硕士研究生学位论文, 2012]

4) Li MS. Identification of microsatellite markers and analysis of genetic diversity of Atrina pectinate. Master's Thesis of Nanjing Agricultural University, 2008 [李明爽.栉江珧微卫星标记的筛选及其遗传多样性的研究.南京农业大学研究生学位论文, 2008]

实验用栉江珧于2015年6月取自山东青岛野生群体，活体运回实验室，取30个个体解剖，剪取闭壳肌，于–80℃保存备用。采用常规酚–氯仿–异戊醇法提取DNA，然后用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，并用分光光度计检测DNA的浓度和纯度。

根据本实验室转录组测序获得的EST序列，利用MISA软件进行微卫星序列搜素，搜索标准为二碱基至少重复6次，三碱基至少重复5次，四碱基至少重复5次，五碱基至少重复5次，六碱基至少重复5次。采用Primer premier 5.0软件设计引物，挑取120对引物由华大基因公司合成。

将8个栉江珧个体的DNA混合成基因池，模板浓度调整至100 ng/μl。PCR反应体系20 μl：0.5 U Taq酶，2 μl 10×Taq Buffer (含Mg²⁺)，2 μl dNTPs (10 mmol/L)，上下游引物 (10 μmol/L) 各1 μl，补水至20 μl。PCR扩增反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，退火温度45 s (退火温度视引物而定)，72℃延伸45 s，35个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物用8%非变性聚丙烯酰胺电泳检测，银染。根据电泳图谱确定引物的最佳退火温度。然后分别用8个个体作为对象，使用筛选出的最适退火温度进行PCR扩增，反应体系和反应条件同上，产物经8%非变性聚丙烯酰胺电泳检测，银染，用于检测引物多态性。

在栉江珧青岛群体30个个体中，根据引物筛选结果进行多态性验证，8%非变性聚丙烯酰胺电泳检测。根据电泳图谱，并参照引物设计时预期片段的大小统计条带，用POPGENE 1.31计算微卫星引物的等位基因数 (Na)、期望杂合度 (He)、观望杂合度 (Ho)，PIC-CAL计算多态信息含量 (PIC)。

在获得的127263条EST序列中，检测出含有SSR的EST序列10550条 (8.2%)，包括二核苷酸重复8132条，三核苷酸重复2010条，四核苷酸重复401条，五核苷酸重复7条。二核苷酸重复最多，占77.08%；其次为三核苷酸和四核苷酸重复，分别占19.05%和3.80%；五核苷酸重复最少，占0.07%(表 1)。

表 1(Tab. 1)

表 1 栉江珧SSR在EST中出现的频率 Table 1 The frequency of A. pectinata SSR in the EST 类型Type 数目Number 比例Rate (%) 二核苷酸Dinucleotide 8132 77.08 三核苷酸Trinucleotide 2010 19.05 四核苷酸Teranucleotide 401 3.80 五核苷酸Pentanucleotide 7 0.07 合计Total 10550 100

表 1 栉江珧SSR在EST中出现的频率 Table 1 The frequency of A. pectinata SSR in the EST

在二核苷酸重复单元中，AC/GT最多，共3096条，占38.07%；其次是AT/TA和AG/CT，分别占32.97%和28.85%；CG/CG最少，共9条，占0.11%(表 2)。

表 2(Tab. 2)

表 2 二核苷酸重复中各重复单元的数量与比例 Table 2 The number and proportion of all the repeat motifs in the binucleotide repeats 类型Type 数量Number 比例Rate (%) AC/GT 3096 38.07 AT/TA 2681 32.97 AG/CT 2346 28.85 CG/CG 9 0.11 合计Total 8132 100

表 2 二核苷酸重复中各重复单元的数量与比例 Table 2 The number and proportion of all the repeat motifs in the binucleotide repeats

在三核苷酸重复单元中，ATC/ATG最丰富，共625条，占31.09%；AAC/GTT和AAT/ATT分别有554和374条，分别占27.56%和18.61%；其次为AAG/CTT和ACC/GGT，分别占6.12%和5.30%；最少的是CCG/CGG，共2条，占总数的0.10%(表 3)。

表 3(Tab. 3)

表 3 三核苷酸重复中各重复单元的数量与比例 Table 3 The number and proportion of all the repeat motifs in the trinucleotide repeats 类型Type 数量Number 比例Rate (%) ATC/ATG 625 31.09 AAC/GTT 554 27.56 AAT/ATT 374 18.61 AAG/CTT 123 6.12 ACC/GGT 106 5.30 ACT/AGT 89 4.43 AGC/CTG 71 3.53 AGG/CCT 53 2.64 ACG/CGT 13 0.65 CCG/CGG 2 0.10 合计Total 2010 100

表 3 三核苷酸重复中各重复单元的数量与比例 Table 3 The number and proportion of all the repeat motifs in the trinucleotide repeats

利用Primer premier 5.0软件，对10550条含有SSR的EST进行引物设计，共设计3401对。随机选取120对引物合成，以8个青岛群体栉江珧个体组成的基因池为模板，退火温度上下波动5℃为梯度，对120对引物进行初步筛选。结果显示，有36对引物获得稳定、清晰的扩增片段，扩增成功率为30%；36对引物在青岛栉江珧群体中进行多态性检测，其中12对引物表现出多态性 (表 4)，多态引物比例为33.3%。

表 4(Tab. 4)

表 4 栉江珧多态性EST-SSR引物序列及参数 Table 4 Primer sequences and parameters of polymorphic EST-SSR in A. pectinata 引物 Primer 重复单元 Repeat motif 上游引物序列 (5'-3') Forward primer sequence 下游引物序列 (5'-3') Reverse primer sequence 预扩片段大小 Expected size (bp) 退火温度 Annealing temperature (℃) c65097_g1 (GTG)7 TGGGGTCAACCACTAGGACA TGCGAGTTCCGGTTAATCCC 241 57.5 c55835_g1 (AC)9 GACCATCCAAGACCAGCTCA CGGTTTGTGTGTTCAAGCCA 247 55.4 c29478-g1 (TG)8 CGACAACGCCAATTCTGACC TTGAAGCGGTCAGGCGTATT 149 55.4 c73921_g1 (GA)8 CTCATGCATGCATAGCAGTGT TTGTCTGTCCATCCCTCCCT 119 55.4 c72420_g2 (TGTC)5 CCCCCTAGCACATATCAAACA TGTTGTCATCAGGAGGAGGA 205 55.4 c73582_g4 (CTGT)5 TATCTGTCTGTCTGCCTGCC CAGCCTCGATGACGCAAATG 172 57.4 c73109_g2 (CTGT)5 TGTCCATCTTGCTGTCTGTCC TGACACACAGACAGCAAGACT 135 55.4 c72142_g2 (GT)10 GCTTGTAAGCGCTTATGAACCT CCCACACATCATACCCATGC 170 56.2 c67726_g1 (AT)11 CCATGTGGAGTCCAGTGCAT TCTAGGGGCCACAAAGCAAC 181 54.1 c69026_g3 (CA)11 TCACAGTTGGACAGGTCTTTGT ATTCAGAGCAGGTGCCAGTC 226 57.4 c62721_g1 (CAA)7 AGAGGCTTTCACAAACAACAAC TCTTCCATCAAGAGCAGCGG 264 54.6 c67433_g5 (CA)9 GGCAGACCCTTGATGTACCA GGCAAAACAAGAAACAAAACGCA 232 60.8

表 4 栉江珧多态性EST-SSR引物序列及参数 Table 4 Primer sequences and parameters of polymorphic EST-SSR in A. pectinata

利用筛选的12对多态性引物对青岛海区栉江珧群体的30个个体进行遗传变异分析，结果见表 5。12对引物共获得到42个等位基因，每对引物在青岛栉江珧群体中检测到2–5个等位基因，平均每个位点有3.5个等位基因，其中，c62721_g1位点的等位基因最少 (2个)，c67433_g5位点的等位基因最多 (5个)。观测杂合度Ho、期望杂合度He、多态信息含量PIC分别为0.167–0.667、0.432–794、0.368–0.746，平均观测杂合度Ho、平均期望杂合度He、平均多态信息含量PIC分别为0.417、0.604、0.526。依据PIC判断标准：PIC < 0.25为低度多态，0.25 < PIC < 0.5为中度多态，PIC > 0.5为高度多态，12个多态性位点中，有6个高度多态位点 (PIC > 0.5)，6个中度多态位点 (0.25 < PIC < 0.5)，可以看出栉江珧EST-SSR在青岛群体中表现出较高的多态性，说明青岛栉江珧群体遗传多样性水平较高。

表 5(Tab. 5)

表 5 青岛海区栉江珧群体EST-SSR分析统计 Table 5 Statistics of the EST-SSR analysis for the Qingdao population of A. pectinata 基因座位Locus 等位基因数Na 观测杂合度Ho 期望杂合度He 多态信息含量PIC c65097_g1 4 0.633 0.667 0.590 c55835_g1 3 0.400 0.623 0.541 c29478_g1 3 0.667 0.567 0.496 c73921_g1 3 0.533 0.432 0.383 c72420_g2 4 0.167 0.584 0.483 c73582_g4 4 0.233 0.625 0.562 c73109_g2 4 0.467 0.607 0.541 c72142_g2 3 0.300 0.513 0.428 c67726_g1 3 0.200 0.583 0.479 c69026_g3 4 0.467 0.758 0.697 c62721_g1 2 0.567 0.494 0.368 c67433_g5 5 0.367 0.794 0.746 平均值Mean 3.5 0.417 0.604 0.526

表 5 青岛海区栉江珧群体EST-SSR分析统计 Table 5 Statistics of the EST-SSR analysis for the Qingdao population of A. pectinata

本研究利用栉江珧转录组测序获得的127263条EST序列进行SSR筛选，检出率为8.2%，结果与缢蛏EST中SSR比例 (8.89%) 相似 (刘博等, 2012a)，但该比例低于马氏珠母贝EST-SSR出现频率 (13.34%) (王忠良等, 2015)，高于菲律宾蛤仔 (Ruditapes philippinarum) EST-SSR出现频率 (3.57%)(闫喜武等, 2011)。造成这种差异的原因主要有筛选标准、数据库大小以及物种的不同。如，张秀英等 (2012)以3个不同标准对栉孔扇贝同一BES文库进行SSR筛选，筛选率随着筛选标准的提高而降低。同样，数据库丰富程度不同也会造成EST-SSR位点出现频率不同，王忠良等 (2015)和石耀华等 (2008)分别从马氏珠母贝74007和6979条EST序列中筛选得到9872和243个EST-SSR位点，其位点出现频率分别为13.34%和3.48%。在凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 中也有相似的报道，王艳红等 (2011)和马宁等 (2013)对凡纳滨对虾不同数量的EST序列进行EST-SSR筛选，其筛选率也不同。

本研究中，栉江珧EST微卫星中以二核苷酸重复所占比例最高，其次是三核苷酸重复，分别占77.08%和19.05%，这和马氏珠母贝 (石耀华等, 2008) 和凡纳滨对虾 (王艳红等, 2011) 的研究结果相似。在位点多态率方面，本研究设计合成了120对EST-SSR引物，其中，36对引物获得稳定、清晰的扩增位点，扩增成功率为30.0%；12对引物表现出多态性，多态引物比例为33.3%，其比率分别低于G-SSR的63.15%、62.5% (李明爽, 2008)¹⁾和81.25%、80.76% (白临建, 2012)²⁾。这与泥蚶 (周小龙等, 2013)、文蛤 (齐晓艳等, 2013) 和红鳍东方鲀 (郝君等, 2007) G-SSR位点多态率高于EST-SSR位点多态率结果相似。

1) Li MS. Identification of microsatellite markers and analysis of genetic diversity of Atrina pectinate. Master's Thesis of Nanjing Agricultural University, 2008 [李明爽.栉江珧微卫星标记的筛选及其遗传多样性的研究.南京农业大学研究生学位论文, 2008]

2) Bai LJ. Effects of morphometric traits on weight traits and microsatellite markers based genetic diversity in the Atrina pectinata. Master's Thesis of Shanghai Ocean University, 2012 [白临建.栉江珧形态性状对重量性状的影响及五个野生群体遗传多样性的微卫星分析.上海海洋大学硕士研究生学位论文, 2012]

刘博等 (2012a)得到的缢蛏EST-SSR平均观测杂合度Ho (0.569) 和平均期望杂合度He (0.490) 分别低于吴雪萍等 (2014)的结果 (缢蛏基因组SSR的Ho为0.6866，He为0.7525)。闫路路等 (2015)在研究基于转录组平台的蛤仔微卫星标记也得到了相似的结果，其所得的Na、Ho、He和PIC也分别低于Yasuda等 (2007)和An等 (2009)通过G-SSR得到的结果。本研究也得到了与之基本一致的结果，平均每个位点产生3.5个等位基因，Ho、He、PIC分别为0.417、0.604、0.526。与白临建 (2012)²⁾通过基因组来源SSR所得平均位点、Ho、He分别为6.43、0.4215、0.5857相比，除He略高外，其他均低，造成He略高的原因可能是标记本身不同造成的，也可能是实验所用的地理群体不同造成的，白临建 (2012)²⁾是使用蓬莱长岛县的栉江珧群体进行多态性引物的筛选，而本研究使用青岛地区的栉江珧进行多态性引物的筛选，具体原因有待于进一步探究。

本研究获得的12对EST-SSR引物，具有多态性丰富、稳定性高和重复性好等优点，并可应用于栉江珧群体的遗传多样性分析，揭示了栉江珧青岛群体的种质资源现状，将为栉江珧的种质资源保护提供重要的参考资料。