2. 上海海洋大学水产与生命学院 上海 201306;
3. 青岛海洋科学与技术国家实验室 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室 青岛 266071
2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306;
3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071
随着水产养殖业的发展,对鱼粉的需求不断增加,导致鱼粉价格不断上涨,供不应求。植物蛋白因其来源广泛、价格低廉等优点可作为鱼粉替代源,但由于植物蛋白源含有抗营养因子、氨基酸不平衡等缺陷,限制了其在水产饲料中的添加量 (周岐存等, 2005; Bureau et al, 1998; Francis et al, 2001; Gomes et al, 1995; 陈伟, 20091); El-Saidy et al, 2003; 庄平等, 2002)。
1) Chen W. Effects of antinutritional factors on the utilization of soybean proteins by Japanese flounder, (Paralichthys olivaceus). Doctoral Dissertation of Ocean University of China, 2009 [陈伟. 抗营养因子对牙鲆(Paralichthys olivaceus)利用大 豆蛋白源的影响.中国海洋大学博士研究生学位论文, 2009]
水解蛋白是富含低分子寡肽的一类蛋白产品,通过鱼体内源蛋白酶、内切型或外切型商品蛋白酶限定性酶酶解获得,富含必需氨基酸、牛磺酸、矿物质及微量元素等 (熊光权等, 1992; Liaset et al, 2008)。饲料中添加部分水解蛋白在对增强鱼类免疫力、提高鱼类成活率、增重率及提高饲料利用率方面有一定促进作用 (李清等, 2005; Infante et al, 1997; Cahu et al, 1999; 于辉等, 2003)。近年来,各国学者就饲料中添加水解鱼蛋白对大西洋鲑 (Salmo salar)、虹鳟 (Oncorhynchus mykiss)、鲈鱼 (Dicentrarchus labrax)、牙鲆 (Paralichthys olivaceus)、大菱鲆 (Scophthalmus maximus L.)、罗非鱼 (Oreochromis niloticus) 和鲤鱼 (Cyprinus carpio) 幼鱼的影响进行了研究,发现适度使用鱼水解蛋白可显著促进生长、提高消化率以及非特异性免疫功能 (Liaset et al, 2003; 胡梦红等, 2007),但鸡肉蛋白水解物对鱼类生长性能的影响鲜见报道。
本研究以大菱鲆幼鱼为对象,研究了在高植物蛋白含量饲料中使用鸡水解蛋白和鱼水解蛋白分别替代部分鱼粉对大菱鲆幼鱼生长性能、肌肉氨基酸组成及肠道组织学结构的影响,为不同蛋白水解物在肉食性鱼类饲料中的合理利用提供理论参考。
1 材料与方法 1.1 水解蛋白的制备鱼水解蛋白采用太平洋狭鳕鱼 (Theragra chalcogramma) 鱼排。鱼水解蛋白的制备方法参照Zheng等 (2012)的方法,酶解液使用旋转蒸发仪 (BUCHI) 浓缩得到浓缩液,然后冷冻干燥保存备用。鸡水解蛋白选自商用。
1.2 鱼水解蛋白、鸡水解蛋白分子量分布及氨基酸组成测定鱼水解蛋白 (PHf) 和鸡水解蛋白 (PHc) 分子量分布采用卫育良等 (2014)的方法,氨基酸组成的测定在6 mol/L HCl中110℃水解24 h,采用日立L-8900全自动氨基酸测定仪测定。2种水解蛋白产品PHf、PHc的分子量组分及氨基酸组成分别见表 1和表 2。
本实验以红鱼粉、植物蛋白 (豆粕、玉米蛋白粉、谷朊粉) 及鱼水解蛋白 (PHf)、鸡水解蛋白 (PHc) 为蛋白源,以鱼油为脂肪源。不添加水解蛋白为对照组 (FM),2种水解蛋白分别替代10%的鱼粉蛋白,制作成3种等氮、等脂的饲料,饲料配方见表 3。所有原料粉碎过80目筛,将原料充分混匀,制成粒径为3 mm的饲料,在烘箱55℃下烘干,然后-20℃保存备用。饲料氨基酸组成见表 4。
养殖实验选用初始体重为 (4.16±0.01) g的大菱鲆幼鱼,养殖实验在烟台开发区天源水产有限公司开展。实验开始前,将鱼苗暂养14 d,使其适应养殖环境。实验采用自然光照,养殖系统采用水体体积为120 L的玻璃钢桶,养殖用水为深井海水,流水养殖模式,流速为5 L/min,水温为 (14.0±0.5)℃,连续充气,溶氧>7 mg/L,盐度为30.0±0.5,pH为7.5-8.0。生长实验开始时,停食24 h,选择大小均匀、体格健壮且体表无病的大菱鲆幼鱼,称重后随机分配在12个玻璃钢桶内 (3个处理组,每组4个重复),每桶25尾鱼,每天用实验饲料饱食投喂2次 (06:30和16:30),投喂结束30 min后,对残饵进行统计,并换水1/2。养殖周期为12周。
1.5 样品采集及生化指标测定实验开始时,随机取10尾鱼保存于-20℃以供后续的鱼体成分分析实验。实验结束时,停食24 h,每桶鱼称总重,然后随机取5尾鱼,保存于-20℃用于鱼体成分分析。每桶取3尾鱼,取其前肠及中肠保存于Davidson's固定液 (95%乙醇330 ml,甲醛220 ml,冰醋酸115 ml,纯水335 ml) 中,Davidson's固定液的固定24 h,此后转移至70%乙醇中保存。
饲料和鱼体样品在105℃烘干至恒重,通过失重法测定干物质含量,然后进行生化测定。粗蛋白采用凯氏定氮法;粗脂肪采用索氏抽提法;灰分的测定需先在电炉上炭化后再在马福炉中550℃燃烧3 h,失重法测定。
肠道组织切片,先用乙醇脱水,石蜡包埋,LEICA RM2235型切片机连续切片,HE染色,中性树脂封片,Nikon E800型显微镜下观察、拍照。
1.6 计算及统计分析方法增重率 (Weight gain rate, %)=100×(终末体重-初始体重)/初始体重
特定生长率 (Specific growth rate, %/d)=100× [ln (终末体重)-ln (初始体重)]/实验天数
摄食率 (Feeding rate, %/d)=100×总干物质摄食量/ [实验天数×(初始体重+终末体重)/2]
饲料效率 (Feed efficiency)=鱼体增重 (湿重)/总干物质摄食量
蛋白效率比 (Protein efficiency ratio)=(终末体重-初始体重)/蛋白摄入量
蛋白质沉积率 (Protein retention, %)=100×鱼体蛋白质贮存量/蛋白摄入量
采用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行单因素方差分析 (One-way ANOVA),当差异达到显著水平 (P < 0.05),进行邓肯多重比较 (Duncan's multiple range tests),数据表示为平均值±标准差 (Mean±SD)。
2 结果 2.1 不同水解蛋白对大菱鲆幼鱼生长性能及饲料利用的影响水解蛋白对大菱鲆幼鱼生长性能的影响见表 5。3组实验鱼的成活率在98%以上,且3组之间无显著差异 (P > 0.05)。3组实验鱼之间的摄食率无显著差异 (P > 0.05);PHf组的增重率、特定生长率与FM组之间无显著差异 (P > 0.05),但显著高于PHc组 (P < 0.05);FM与PHf组的饲料效率、蛋白质效率、蛋白质沉积率无显著差异 (P > 0.05),但显著高于PHc组 (P < 0.05)。
PHf和PHc组的鱼体化学组成中 (表 6),粗蛋白含量无显著差异 (P > 0.05),但显著高于FM组 (P < 0.05);粗脂肪含量3个实验组间无显著差异 (P > 0.05);FM、PHc组的灰分含量显著高于PHf组 (P < 0.05),FM和PHc组之间无显著差异 (P > 0.05)。
在测得的肌肉的16种氨基酸中 (表 7),PHf组鱼体牛磺酸含量显著高于其他2组 (P < 0.05),FM、PHf、PHc组呈鲜味氨基酸天冬氨酸、呈甜味氨基酸甘氨酸含量无显著差异 (P > 0.05);PHf和PHc组必需氨基酸中的组氨酸及必需氨基酸含量显著高于FM组 (P < 0.05),PHf组的必需氨基酸与总氨基酸比值、必需氨基酸与非必需氨基酸比值高于FM、PHc组,并且显著高于FM组 (P < 0.05),FM、PHc两者间无显著差异 (P > 0.05)。
不同水解蛋白对大菱鲆肠道组织结构的影响见表 8。肠道切片显示,PHf组的前肠皱襞高度显著高于FM组 (P < 0.05),PHc组前肠皱襞高度较FM组和PHf组无显著差异 (P > 0.05);PHf组的中肠黏膜皱襞高度显著高于FM和PHc组 (P < 0.05);3组实验鱼的前肠和中肠上皮细胞高度无显著差异 (P > 0.05);FM组前肠和中肠的肠壁厚度大于其他2组,且显著大于PHf组 (P < 0.05),PHc组与FM、PHf组之间差异不显著 (P > 0.05)。
蛋白水解物是富含寡肽和游离氨基酸的蛋白制品,在自制的鱼水解蛋白及购买的鸡水解蛋白中,80%以上分子量小于1000 Da (PHf, 91.92%; PHc, 83.97%) (表 1),含有丰富的必需氨基酸和呈味氨基酸等 (表 2),具有良好的诱食性。本研究3组实验鱼的摄食率之间无显著差异 (P > 0.05),说明组间的生长差异不是由饲料的适口性造成。Silk等 (1985)研究表明,小肽和游离氨基酸具有独立的吸收机制。小肽的吸收具有吸收速度快、耗能低、载体不易饱和等特点 (何吉祥等, 2003)。Srichanun等 (2014)研究发现,小肽和游离氨基酸含量高的蛋白水解物会降低尖吻鲈 (Lates calcarifer Bloch) 稚鱼的生长性能,分析其原因可能是这些小分子肽及游离氨基酸使刷状缘膜酶产量减低,游离氨基酸过早通过肠道导致必需氨基酸吸收不平衡或是游离氨基酸过多导致氨基酸分解代谢增强等,从而引起生长性能降低。多项研究表明,适当添加鱼水解蛋白可以促进鱼类的生长性能及提高饲料利用 (Tang et al, 2008; Zheng et al, 2012; Kotzamanis et al, 2007)。
本研究中,PHf组的增重率、特定生长率与FM组之间差异不显著 (P > 0.05),但显著高于PHc组 (P < 0.05),说明添加鱼水解蛋白的实验组优于鸡水解蛋白组,PHc组的饲料效率、蛋白质效率、蛋白质沉积率显著低于其他2组 (P < 0.05),说明水解鸡肉蛋白组的饲料利用较低。从鱼水解蛋白与鸡水解蛋白的分子量分布上看无明显差异,必需氨基酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸及赖氨酸鸡水解蛋白低于鱼水解蛋白 (表 1,表 2),但饲料氨基酸蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸及赖氨酸无显著差别 (表 4)。造成生长和饲料利用差异的原因可能是鱼蛋白水解物中含有的牛磺酸是鸡水解蛋白的6.25倍,牛磺酸是一种水溶性氨基酸衍生物,是重要的条件必需氨基酸,在高植物蛋白饲料中可显著促进肉食性鱼类的生长。本研究中,鸡水解蛋白组的牛磺酸水平与鱼水解蛋白组及对照组相比较低,因而可能影响了大菱鲆的生长性能及饲料利用。
Oliva-Teles等 (1999)研究发现,鱼水解蛋白没有改善大菱鲆幼鱼的生长及饲料的利用情况,而本研究是在鱼粉含量较低的条件下添加蛋白水解物,鱼水解蛋白组跟对照组在生长上无显著差异 (P > 0.05),可能的原因是Oliva-Teles等 (1999)的对照组含有68.6%的鱼粉,分别以5%、10%和15%鱼水解蛋白替代鱼粉,实验饲料中鱼粉最低组为46.3%,鱼水解蛋白的作用被高鱼粉所掩盖,而本研究对照组鱼粉含量为15%,而水解蛋白实验组鱼粉含量仅为8%,大大低于的Oliva-Teles等 (1999)的鱼粉用量。
本研究通过观察实验鱼的肠道组织变化,从而评价水解蛋白对大菱鲆幼鱼肠道发育的影响作用。黏膜高度、肠上皮细胞高度、肠壁厚度是评价肠道组织结构变化的重要指标。黏膜高度、肠上皮细胞高度、肠壁厚度从前肠至中肠有逐渐减低的趋势,添加水解蛋白的2组实验鱼的前肠和中肠黏膜皱襞高度大于FM组,并且PHf与FM组差异显著 (P < 0.05)。黏膜皱襞数量和高度升高,肠道吸收面积增大,吸收营养物质的能力提高。Bonaldo等 (2006)和Peng等 (2013)研究大豆蛋白分别对埃及鳎 (Solea aegyptiaca) 幼鱼、大菱鲆幼鱼肠道显微结构的影响,发现高水平添加大豆蛋白对其肠道有不利影响,说明蛋白质质量对幼鱼肠道的发育有影响。杨玉荣等 (2006)研究发现,日粮中添加80-120 g/kg的大豆活性肽能够提高肉鸡生长初期肠道杯状细胞的数量,增加肠道绒毛长度与隐窝深度的比值,说明适量添加水解大豆蛋白对肉鸡肠道发育有促进作用。肠壁厚度、小肠的节律性伸缩及食糜的机械消化效率密切相关,因此,肠壁厚度会影响小肠的吸收功能。陈付菊等 (2013)研究表明,随着年龄的增加,青海湖裸鲤 (Cymnocypris przewalskii) 肠壁厚度逐渐增加,证明青海湖裸鲤可能通过增加肠壁厚度提高肠道的消化吸收功能。Bonaldo等 (2011)研究混合植物蛋白对大菱鲆幼鱼生长、肠道组织变化时发现,肠道组织学变化跟生长没有相关关系。本研究与Bonaldo等 (2011)实验结果相似,大菱鲆的生长跟肠道组织结构变化相关性不高。添加水解蛋白对大菱鲆幼鱼肠道黏膜皱襞数量及高度有促进作用,尤其是PHf组的促进作用更明显,但水解蛋白组的肠壁厚度小于对照组,与黏膜皱襞长度的结果相反,其原因有待于进一步研究。
4 小结在高植物蛋白含量的大菱鲆饲料中,用鱼水解蛋白替代10%的鱼粉蛋白不影响大菱鲆的生长,鱼水解蛋白在生长性能上优于鸡水解蛋白,且更能改善大菱鲆肠道组织学结构。
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