盐度是决定海洋生物分布并影响其生长、存活的重要环境因子。沿海近岸地区，尤其是河口附近，因为潮汐、降雨、高温干旱或人类活动等影响，经常发生不同程度的海水盐度波动。目前，大多数海洋经济贝类分布或养殖于潮间带、滩涂或河口地区，盐度变化可能会对贝类造成不同程度的胁迫 (Gagnaire et al, 2006; Carregosa et al, 2014)。

盐度胁迫会影响贝类的免疫功能，增加贝类感染疾病的风险。Reid等 (2003)研究发现，菲律宾蛤仔 (Ruditapes philippinarum) 血细胞THC随盐度升高而升高。高盐胁迫下，鸡帘蛤 (Chamelea gallina) 的细胞吞噬活性降低 (Matozzo et al, 2007)。随盐度上升，牡蛎 (Crassostrea virginica) 对寄生虫Perkinsus marinus和Haplosporidium nelsoni的感染率和死亡率也上升 (Ford et al, 1988; Chu et al, 1993)。盐度胁迫还会影响海水贝类的呼吸、摄食以及生长 (Navarro et al, 1998; Nakamura et al, 2005)，贝类需要调整生理活动以适应盐度的改变。研究表明，免疫反应需要消耗能量，免疫功能的变化也会导致机体能量代谢的改变 (Roch, 1999; Rolff et al, 2003; Wang et al, 2012)。因此，生理代谢变化可以在一定程度上反应海水贝类所受到的胁迫。

在复杂多变的近海环境中，贝类进化产生了独特的逆境适应机制 (Zhang et al, 2012)，了解这些机制对于海水贝类资源保护、新品种选育具有重要意义。黄边糙鸟蛤 (Trachycardium flavum) 分布于我国广东、广西和海南潮间带，是一种重要的经济贝类 (唐保军等, 2010)。受海表蒸发等因素影响，广东、海南沿海海水盐度会出现异常升高，有时达34以上 (叶龙飞, 1988; 袁淑尧等, 1998)，此时，黄边糙鸟蛤会遭遇高盐胁迫。本研究通过测定高盐胁迫下代谢率和免疫相关酶活性的变化，探讨黄边糙鸟蛤的盐度胁迫适应机制，为该贝类的养殖和资源保护提供参考资料。

黄边糙鸟蛤采自海南文昌沿海，取回实验室后挑选大小一致的个体[壳高为 (50.35±2.64) mm，体重为 (46.51±6.91) g]，清除表面附着物后放入2000 L玻璃钢桶暂养14 d，桶底铺10 cm厚细砂，暂养期间，海水盐度为31.0±0.5，通过室内空调控制水温为 (26.0±0.5)℃，每天换水1/2，早晚各投喂1次小球藻 (Chlorella pyrenoidsa) 和金藻 (Isochrysis galbana) 的混合藻液。

取暂养的黄边糙鸟蛤150只，平均分为2组，一组仍在盐度为31的海水中作为对照，另外一组直接转入盐度为37的海水中。将海水晶溶于水配制成高浓度盐水，经脱脂棉过滤后调节海水盐度至37，盐度用比重计和温度计测定。实验持续72 h，期间每天换水1/2。于实验开始后2、12、24、48和72 h测定耗氧率和排氨率。每个时间点取3只黄边糙鸟蛤，分别取肝胰腺、鳃、外套膜和斧足肌肉样品，于–80℃保存，用于组织酶活分析。

用静水法测定耗氧率和排氨率。每个1.5 L塑料呼吸瓶内放1只黄边糙鸟蛤，虹吸式注入实验用水后密封，26℃水浴，每个时间点分别设3个平行和1个空白对照。因每次实验持续2 h，故测得的耗氧率和排氨率分别为处理后1–3、11–13、23–25、47–49和71–73 h内的均值。实验结束后用虹吸法取水样分析，解剖实验用蛤，取软体部于65℃烘干24 h，称量组织干重。

(1) 采用Winkler法 (Stickland et al, 1968) 测定水中的溶解氧含量，根据下式计算耗氧率：

式中，R为单位体重耗氧率，O₀和O_t分别为实验结束时空白对照组和实验组水中的溶解氧浓度 (mg/L), V为呼吸瓶体积 (L)，W为蛤组织干重 (g)，t为实验持续时间 (h)。

(2) 采用次溴酸盐氧化法 (Solorzano, 1969) 测定水中的氨氮含量，根据下式计算排氨率：

式中，E为单位体重排氨率，N₀和N_t分别为实验结束时空白对照组和实验组水中的氨氮浓度 (µg/L), V为呼吸瓶体积 (L)，W为蛤组织干重 (g)，t为实验持续时间 (h)。

各组织样品于4℃解冻后，分别按质量体积比加入9倍预冷的生理盐水 (150 mmol/L NaCl, pH=7.4) 匀浆。制备好的匀浆液以2500 r/min、4℃离心15 min，取上清液用于酶活分析。

分析测定上清液中Na⁺/K⁺-ATP酶、超氧化物歧化酶 (SOD)、酸性磷酸酶 (ACP) 和碱性磷酸酶 (ALP) 的活力，各酶活力均采用试剂盒 (南京建成生物工程研究所) 测定，具体测定方法按照试剂盒说明书进行。采用考马斯亮蓝法测定上清液蛋白浓度。Na⁺/K⁺-ATP酶活力定义为每小时每毫克组织蛋白中ATP酶分解ATP产生1 µmol无机磷 (Pi) 的量为1个活力单位。SOD活力定义为每毫克组织蛋白在1 ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个活力单位。ACP活力定义为30 min内产生1 mg p-硝基酚为1个活力单位。ALP活力定义为15 min内产生1 mg p-硝基酚为1个活力单位。

实验数据采用平均值±标准差 (Mean±SD) 表示。采用SPSS 11.5统计软件对数据进行独立样本t检验，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著。

盐度37处理后2 h，黄边糙鸟蛤的耗氧率低于对照组，其后逐渐上升，至48 h达到最大值 (图 1)，在24和72 h显著高于对照组 (P < 0.05)。处理组黄边糙鸟蛤2 h时耗氧率显著低于24、48和72 h时的耗氧率 (P < 0.05)。排氨率在处理后2 h极显著低于对照组 (P < 0.01)，其后逐渐升高。处理组2 h的排氨率显著高于其他时间点 (P < 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 1 高盐胁迫下黄边糙鸟蛤耗氧率变化 Figure 1 Variation of oxygen consumption rate of T. flavum under hypersaline stress *表示对照组与处理组有显著差异，下同 * indicated significant difference between the control and treatment, the same as below

图 1(Fig. 1)

图 2 高盐胁迫下黄边糙鸟蛤排氨率变化 Figure 2 Variation of ammonia excretion rate of T. flavum under hypersaline stress

由图 3可知，盐度37处理后2 h，外套膜、肝胰腺中Na⁺/K⁺-ATP酶活力在12 h显著低于对照组 (P < 0.05)，在其他各时间点与对照组无显著差异。肌肉和鳃中Na⁺/K⁺-ATP酶活力与对照组无显著差异。盐度胁迫后，外套膜、肝胰腺和肌肉中不同时间点之间Na⁺/K⁺-ATP酶活力有显著差异 (P < 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 3 高盐胁迫下黄边糙鸟蛤不同组织Na+/K+-ATP酶活力变化 Figure 3 Variation of Na+/K+-ATPase activity in different tissues of T. flavum under hypersaline stress

盐度37处理后，各组织中SOD活力呈先升高后下降的趋势 (图 4)。处理后2 h，与对照组相比，各组织中SOD活力下降，其后逐渐升高；24 h，肝胰腺中SOD活力极显著高于对照组 (P < 0.01)；至72 h，各组织中SOD活力降至对照组水平。盐度处理后，各组织中不同时间点之间SOD活力存在显著差异 (P < 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 4 高盐胁迫下黄边糙鸟蛤不同组织超氧化物歧化酶活力变化 Figure 4 Variation of SOD activity in different tissues of T. flavum under hypersaline stress

高盐度胁迫下，黄边糙鸟蛤外套膜和鳃中ACP活力呈先升高后降低的趋势，在24 h显著高于对照组 (P < 0.05)，在48和72 h下降 (图 5)。肝胰腺中ACP活力在12 h显著低于对照组 (P < 0.05)，随后逐渐升高，在72 h显著高于对照组 (P < 0.05)。与对照组相比，肌肉中ACP活力无显著差异。肝胰腺中ACP活力显著高于其他各组织 (P < 0.01)。高盐胁迫下，各组织中不同时间点之间ACP活力出现显著变化 (P < 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 5 高盐胁迫下黄边糙鸟蛤不同组织酸性磷酸酶活力变化 Figure 5 Variation of ACP activity in different tissues of T. flavum under hypersaline stress

盐度37处理后，与对照组相比，黄边糙鸟蛤外套膜和肌肉中ALP活力无显著差异 (图 6)。鳃中ALP活力在2 h和12 h极显著低于对照组 (P < 0.01)，其后升高，在48 h显著高于对照组 (P < 0.01)。肝胰腺中ALP活力变化趋势与鳃相似，在24 h和72 h显著高于对照组 (P < 0.05)。肝胰腺中ALP活力显著高于其他各组织 (P < 0.01)。盐度处理后，各组织中不同时间点之间ALP活力出现显著变化 (P < 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 6 高盐胁迫下黄边糙鸟蛤不同组织碱性磷酸酶活力变化 Figure 6 Variation of ALP activity in different tissues of T. flavum under hypersaline stress

当外界盐度发生突然改变时，海水贝类通过关闭贝壳保护内部组织免受伤害 (Pierce, 1971)。Brown等 (1981)报道，Bullia digitalis在盐度升高或降低时会关闭水管。本研究中，盐度处理初期，黄边糙鸟蛤贝壳开放程度明显降低，这可能是导致2 h耗氧率下降的原因。盐度胁迫条件下，呼吸率的降低也是贝类在不利环境中保存能量的一种方式 (Brown et al, 1990)。为了维持内环境的稳定，当环境改变时，海水无脊椎动物会进行生理补偿 (Bayne, 1973、1998; McMahon et al, 1991)。补偿后，如果新的稳定态与环境改变之前一致，说明补偿是完全的；如果新的稳定态与之前的不一致，说明补偿不完全，仍然存在环境胁迫 (Bayne, 1973)。本研究中，耗氧率12 h后逐渐升高，可能是贝类对盐度改变的生理补偿所致。唐保军等 (2010)的研究中，盐度缓慢升至36、40并暂养7 d后，黄边糙鸟蛤耗氧率与对照组 (盐度32) 无显著差异，表明达到完全补偿需要的时间与盐度胁迫程度有关，具体机制需要进一步研究。

作为主要的氮代谢终产物，氨离子参与海水动物渗透调节 (Silvia et al, 2004)。本研究中，高盐度处理后，排氨率下降，这与之前慢性盐度胁迫下的研究报道一致 (唐保军等, 2010)。其他贝类中也有类似报道：织纹螺 (Nassarius festivus) 从盐度25转入30、35后72 h，排氨率下降 (Cheung, 1997)。在高盐度胁迫下，双壳贝类组织细胞体积缩小并快速合成游离氨基酸，以应对高渗压力 (Baginski et al, 1977)，首先合成丙氨酸，其后为甘氨酸、牛磺酸等 (Baginski et al, 1977; Henry et al, 1980; Deaton et al, 1985)。丙氨酸的合成需要将游离铵离子固定转化为丙酮酸酯或2-酮戊二酸，游离铵离子来自尿酸代谢、蛋白降解以及代谢氨等 (Zurburg et al, 1981)。本研究中，在2 h，排氨率显著低于对照组，可能因为黄边糙鸟蛤通过对代谢氨氮的重新利用以应对高渗胁迫；随着内环境逐渐达到新的平衡状态，排氨率也逐渐上升；至72 h排氨率又下降，表明机体尚未达到稳定态。对照组黄边糙鸟蛤的排氨率在48 h出现上升，可能为个体差异所致，多重比较显示，各时间点之间排氨率无显著差异。

Na⁺/K⁺-ATP酶对维持细胞中Na⁺、K⁺稳态发挥着重要作用，可有效调节和维持机体渗透压 (Cheng et al, 2002; 沈永龙等, 2013)。本研究中，外套膜、肝胰腺中Na⁺/K⁺-ATP酶活力在12 h显著低于对照组，表明Na⁺/K⁺-ATP酶参与黄边糙鸟蛤渗透稳态 (Osmolaity homeostasis) 调节。高盐度下Na⁺/K⁺-ATP酶活力降低的现象在其他贝类中也有报道。盐度自23骤升至26后，青蛤 (Cyclina sinensis) 鳃中Na⁺/K⁺-ATP酶活力下降，在第15天达到最小值后逐渐回升趋于平稳，但仍低于初始值 (林听听等, 2012)。盐度自30升至35、40后，魁蚶 (Anadara broughtonii) 稚贝鳃中Na⁺/K⁺-ATP酶活力下降，分别在24 h和12 h出现最小值后回升，但均低于对照组 (蔡星媛等, 2015)。

环境突然变化会影响海水无脊椎动物的免疫功能，激活机体的NADPH氧化酶系统，导致耗氧率上升 (呼吸暴发)，产生大量活性氧 (ROS)。活性氧能够杀伤异物，但也会损害机体的膜组织、DNA和酶等 (Roch, 1999; Finkel et al, 2000)。SOD是机体抗氧化防御系统的重要组成部分，可清除体内活性氧自由基 (Hermes-Lima et al, 1998)。Monari等 (2007)报道，盐度自34升至40后，鸡帘蛤血清中Cu/Zn-SOD活力升高。将仿刺参 (Apostichopus japonicas) 自盐度30转入盐度35海水中，其体腔液中SOD活力在3 h极显著升高 (P < 0.01)，其后下降至对照组水平 (Wang et al, 2008)。本研究中，各组织中SOD活力均呈现“先降低再回升，然后下降”的变化规律，说明胁迫初期黄边糙鸟蛤体内自由基浓度降低，进而黄边糙鸟蛤产生应激反应，体内生成大量自由基，SOD等抗氧化酶被诱导激活以清除过多的自由基。

ACP和ALP是重要的水解酶，具有促进血细胞吞噬、清除异物的作用 (Cheng, 1978)。本研究中，胁迫初期黄边糙鸟蛤肝胰腺、鳃中ACP和ALP活力先降低，表明高盐度胁迫影响了黄边糙鸟蛤的免疫酶活性。这与盐度骤升后近江牡蛎 (C. hongkongensis) 血淋巴ALP活力的变化一致 (时少坤等, 2013)。酸性磷酸酶还是检测溶酶体的标志酶 (Cajaraville et al, 2000)，ACP活力的变化，表明高盐度胁迫影响了溶酶体的稳定性。

本研究还发现，黄边糙鸟蛤的免疫反应具有组织特异性。对照组黄边糙鸟蛤外套膜SOD活力显著高于其他组织 (P < 0.05)，肝胰腺中ACP和ALP活力显著高于其他组织 (P < 0.05)。这种组织差异性在其他贝类中也有报道。紫贻贝 (Mytilus edulis) 鳃中SOD活力较高 (Manduzio et al, 2004)，而褐贻贝 (Perna perna) 鳃和肝胰腺中SOD活力相当 (Almeida et al, 2005)。浅沟蛤 (Scrobicularia plana) 肝胰腺中ACP和ALP活力较高，其次为鳃、足、水管和外套膜 (Mazorra et al, 2002)。这种组织差异性可能与蛋白的合成、转运有关，具体的机制需要借助免疫细胞化学、原位杂交等技术进一步开展研究。