2. 广州市联鲲生物科技有限公司 广州 511483
2. Guangzhou Nutriera Biotechnology Co., Ltd, Guangzhou 511483
日本黄姑鱼(Nibea japonica)，属鲈形目，石首鱼科，黄姑鱼属，是一种摄食凶猛的肉食性鱼类，主要分布于中国南海及日本的南部海域(柴学军等, 2009)。黑鲷(Sparus macrocephalus)，属鲈形目，鲷科，棘鲷属，主要分布于西太平洋海域，如我国渤海、黄海、东海及台湾海峡等(马晶晶等, 2009)。2种鱼类都是目前我国东海海区常见的网箱养殖及增殖放流品种(楼宝等, 2002; Ma et al, 2008)。
小麦蛋白是小麦淀粉加工后的副产品，相较鱼粉和大豆浓缩蛋白有更高的粗蛋白含量和表观消化率(Draganovic et al, 2011; Apper-Bossard et al, 2013)，也具备Gatlin等(2007)提出的鱼粉替代蛋白源应具备的营养特性，是一种理想的饲用优质植物蛋白源。相较鱼粉，小麦蛋白具有产量大、供应稳定、价格经济等优点。因此，探究小麦蛋白替代鱼粉作为具一定养殖规模的名特优品种的饲用主蛋白，具有重大的经济意义。相比大豆浓缩蛋白，小麦蛋白还具有抗营养因子少和含硫氨基酸相对含量高等优点。本研究拟通过小麦蛋白替代鱼粉及大豆浓缩蛋白的研究，以期对肉食性海水鱼类的低鱼粉型实用配方研发提供理论参考。
血液是鱼体内一种与自身代谢、营养组成和生理健康等密切相关的流体组织。其生化指标可反映出鱼体受环境和饵料营养等因子影响的状况。肝脏是鱼体重要的代谢器官，与体内营养物质代谢密切相关。因此，鱼类血液及肝脏生化指标常用作评估其代谢状况及器官病变的重要指标，也可用于评估鱼粉替代蛋白源在饲料配方中应用的可行性及有效性。
小麦蛋白替代鱼粉对军曹鱼(Rachycentron canadum) (杨珺, 2010)1)、欧洲鲈(Dicentrarchus labrax) (Robaina et al, 1999)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)(Kaushik et al, 1995; de Francesco et al, 2004)等血清生化指标的影响均见报道，而相关研究在日本黄姑鱼和黑鲷中却尚未开展。本研究通过在饲料中添加不同比例的混合型小麦蛋白(GWT)，逐步替代优质低温干燥鱼粉(Low-temperature dried fish meal, LT-FM)或大豆浓缩蛋白(Soy protein concentrate, SPC)，研究其对日本黄姑鱼和黑鲷幼鱼血清生化指标和肝脏超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量的影响，拟在生理生化水平上对小麦蛋白在2种肉食性鱼类膨化饲料中应用的可行性及有效性作出准确评估。
1) Yang J. Study on utilization of four plant protein sources for juvenile cobia, Rachycentron canadum. Master's Thesis of Guangdong Ocean University, 2010, 21 [杨珺.军曹鱼(Rachycentron canadum)对四种植物蛋白源的利用研究.广东海洋大学硕士研究生学位论文, 2010, 21]
1 材料与方法 1.1 实验饲料实验以低温干燥鱼粉(LT-FM)、大豆浓缩蛋白(SPC)和混合型小麦蛋白(GWT)为饲用主蛋白源，其中，GWT由小麦面筋蛋白(Vital wheat gluten, VWG)、低筋面粉和牛磺酸分别以77.5%、20.5%和2.0%的比例混合而成。LT-FM、SPC和VWG 3种原料的营养组成详见表 1。实验配制了8种等氮等能饲料(粗蛋白为44.1%–45.6%、总能为21.5–22.0 MJ/kg)。其中，对照组(V0) 饲料以LT-FM(20.0%)和SPC(21.4%)为主蛋白源；6种实验饲料以GWT分别替代对照组饲料中33.3%、66.7%和100%的LT-FM蛋白(分别以VF1、VF2、VF3表示)或SPC(分别以VS1、VS2、VS3表示)；另配制联合替代组(VFS)，用GWT同时替代对照组饲料中50%的LT-FM和50%的SPC。饲料配方及其化学组成详见表 2。原料经粉碎、混匀后，使用双螺杆挤压膨化机(牧羊MY56X2A)，制成粒径为3.5–3.8 mm的膨化颗粒。实验饲料经干燥后，–20℃贮藏备用。
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表 1 饲料原料营养组成(g/kg干物质) Table 1 Composition of three feed ingredients used in the experiment(g/kg of the dry matter) |
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表 2 饲料配方及化学组成(g/kg干物质) Table 2 Feed formulation and chemical composition (g/kg of the dry matter) |
日本黄姑鱼幼鱼由浙江省海洋水产研究所西轩岛增养殖基地提供，黑鲷幼鱼购自浙江舟山登步岛黑鲷苗种场。暂养2周后，禁食1 d，用MS-222轻微麻醉，选取健康和体格匀称的个体，随机分配至48个250 L圆形玻璃纤维养殖缸(每种鱼24个养殖缸)。养殖密度分别为日本黄姑鱼26条/缸，初始体重为(12.83± 0.91) g，黑鲷35条/缸，初始体重为(15.40±0.02) g。
1.3 养殖系统与饲料投喂养殖实验在浙江省海洋水产研究所中挪海水鱼类营养与饲料联合实验室进行。采用室内流水养殖系统，实验用水为沉淀砂滤后的海水，盐度约为28，每缸进水速率为2 L/min，缸中放置1个纳米气石，保证溶氧 > 6.0 mg/L。实验期间，平均水温为28℃，采用自然光照，养殖时间为59 d，每种饲料喂养3个缸的实验鱼。采用人工投喂，每天4次(06:40, 09:50, 13:00和16:10)，每次30 min，确保实验鱼明显饱食。投喂前5 min，停水停气以便观察摄食状况，投喂结束后，用虹吸法收集残饵并定量，再进行缸底吸污。
1.4 样品采集与分析养殖结束后，MS-222轻度麻醉所有实验鱼，称重。每缸随机取5条鱼，进行血液样本(尾静脉抽血)和肝脏样品采集。将采集有血样的EP管置于冰盒中，待其完全凝固后，4000×g、4℃，离心10 min，取上清，液氮速冻，–80℃保存待分析。肝脏样品在冰盘上充分研磨后，迅速转移至1.8 ml的冻存管中，液氮速冻后，–80℃保存待分析。
血清总蛋白(TP)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和葡萄糖(GLU)等含量，谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性均使用美国Beckman Coulter AU5800系列全自动生化分析仪及该公司总蛋白(双缩脲法)、甘油三酯(GPO-POD法)、总胆固醇(酶法)、葡萄糖(氧化酶法)、丙氨酸氨基转移酶(速率法)和天冬氨酸氨基转移酶(速率法)等试剂盒测定。血清和肝脏SOD活性(WST-1法)及肝脏丙二醛(MDA，TBA法)含量采用南京建成试剂盒测定。
1.5 统计方法使用SPSS 17.0软件对实验鱼各指标进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，若差异显著(P < 0.05)，则进行Duncan多重比较分析。对联合替代组和对照组实验鱼的各指标进行独立样本t检验，显著性水平为P < 0.05。
2 结果 2.1 GWT替代LT-FM或SPC对日本黄姑鱼的影响本研究分析了用GWT按不同比例替代饲料中的LT-FM或SPC，对日本黄姑鱼血清生化指标(TP、TG、TC、GLU含量及ALT、AST、SOD活性)、肝脏MDA含量和SOD活性的影响见表 3。从表 3可以看出，养殖结束时，GWT替代LT-FM对黄姑鱼血清中的TP和TG含量、ALT和AST活性、肝脏SOD活性和>MDA含量均无显著影响(P > 0.05)，但对血清中的TC和GLU含量及SOD活性等均影响显著(P < 0.05)。其中，GWT 100%替代LT-FM组的血清TC和GLU含量最低，SOD活性最高。GWT替代SPC，对黄姑鱼血清生化指标和肝脏抗氧化指标的影响均不显著(P > 0.05)。
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表 3 GWT替代LT-FM或SPC对日本黄姑鱼血清生化指标及肝脏抗氧化指标的影响 Table 3 Effects of dietary LT-FM or SPC replaced by GWT on plasma biochemical indices, liver anti-oxidative indices of N. japonica |
用GWT同时替代饲料中50% LT-FM和50% SPC，对日本黄姑鱼血清生化指标及部分肝脏指标的影响见表 4。从表 4可以看出，替代组除TG和GLU含量显著低于对照组(P < 0.05) 外，其他指标较对照组均无显著差异(P > 0.05)。
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表 4 GWT替代50% LT-FM和SPC对日本黄姑鱼血清生化指标及肝脏抗氧化指标的影响(平均值±标准差, n=3) Table 4 Effects of 50% replacement of LT-FM and SPC by GWT on plasma biochemical indices, liver anti-oxidative indices of N. japonica (Mean±SD, n=3) |
用GWT按不同比例替代饲料中LT-FM或SPC对黑鲷血清生化指标及部分肝脏指标的影响见表 5。
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表 5 GWT替代LT-FM或SPC对黑鲷血清生化指标及肝脏抗氧化指标的影响 Table 5 Effects of dietary LT-FM or SPC replaced by GWT on plasma biochemical indices, liver anti-oxidative indices of S. macrocephalus |
由表 5可知，养殖实验结束时，除肝脏SOD活性外，其余指标均无显著影响(P > 0.05)。其中，GWT替代LT-FM时，肝脏SOD活性随替代比例增加而显著升高，100%替代组的肝脏SOD活性最高，显著高于对照组(P < 0.05)，但较33.3%和66.7%替代组无显著差异(P > 0.05)。GWT替代SPC时，33.3%和66.7%替代组的肝脏SOD活性显著高于对照组和100%替代组(P < 0.05)。
2.4 GWT替代50%LT-FM和50%SPC对黑鲷的影响用GWT同时替代50% LT-FM和50% SPC对黑鲷血清生化指标及部分肝脏指标的影响见表 6。从表 6可以看出，替代组除肝脏SOD酶活显著高对照组(P < 0.05) 外，其他指标较对照组均无显著差异(P > 0.05)。
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表 6 GWT替代50% LT-FM和SPC对黑鲷血清生化指标及肝脏抗氧化指标的影响(平均值±标准差, n=3) Table 6 Effects of 50% replacement of LT-FM and SPC by GWT on plasma biochemical indices, and liver anti-oxidative indices of S. macrocephalus (Mean±SD, n=3) |
鱼类可通过改变自身代谢模式(包括蛋白质和能量代谢方式)，以适应不同营养特性的饵料及摄入水平。在正常生理状态下，鱼体可通过合成及分解代谢的调节，使自身营养指标处于相对稳定状态。TP、TG和GLU是蛋白质、脂质和糖类三大营养物质消化吸收后在鱼体血液里的最主要存在形式。血液中一定含量的营养物成分是维持鱼类生存所必需的。同时，血液中营养物含量的变化也可反应出机体三大营养物质代谢的基本情况。因此，鱼类的血清生化指标通常用作判定鱼体健康与否的标准。肝脏是蛋白质合成的主要场所，鱼血清中的TP和鱼体肝脏功能密切相关，血清中TP含量一定程度上可以反映肝脏的健康程度和饲料的质量状况(宋文新, 2009)1)。也有研究指出，血清中蛋白质的含量与免疫补体的含量有一定的关联(Sitjà-Bobadilla et al, 2005)。本研究中小麦蛋白替代鱼粉或大豆蛋白的所有处理对日本黄姑幼鱼、黑鲷幼鱼均未产生显著影响。孙宏等(2014)、黎慧等(2014)和彭翔等(2012)的研究也发现，在饲料中添加植物性蛋白不会引起黑鲷TP的显著改变。
1) Song WX. Study on the partial replacement of fish meal by fermented soybean meal in the diet for juvenile black sea bream. Master's Thesis of Zhejiang University, 2009, 42 [宋文新.黑鲷幼鱼饲料中发酵豆粕部分替代鱼粉的研究.浙江大学硕士研究生学位论文, 2009, 42]
血清中TG和TC含量与鱼体内脂肪代谢相关，而GLU则与糖类代谢密不可分。本研究中，小麦蛋白替代鱼粉或大豆蛋白的处理对黑鲷血清中TG、TC和GLU均无显著影响，相同的替代处理在赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)研究中也有相似的结果(未发表)。高比例小麦蛋白替代LT-FM会引起日本黄姑鱼TC的显著下降。植物蛋白替代鱼粉引起养殖动物血清TC含量下降的现象在虹鳟(de Francesco et al, 2004; Kaushik et al, 1995)、欧洲鲈(Robaina et al, 1999)、金头鲷(Sparus aurata) (Gómez-Requeni et al, 2004)、大菱鲆(Psetta maxima) (现命名为Scophthalmus maximus) (Regost et al, 1999)等研究中也有报道。Kaushik等(2004)指出，饲料中植物蛋白的添加可能促进了胆汁酸盐的排泄，并抑制了肠道中胆固醇的重吸收，进而表现为血清中TC含量的下降。也可能是鱼粉等高胆固醇物质在饲料中使用量的下降引起，而与添加的植物蛋白类别无关。小麦蛋白替代LT-FM对日本黄姑鱼血清TC影响显著，而相同替代对黑鲷TC则无显著影响，这可能是不同鱼类的营养代谢机制不同所导致。血清GLU含量与动物的摄食水平和饲料中的营养因素相关(Nelssen et al, 1985)。在本研究中，小麦蛋白替代LT-FM引起了日本黄姑鱼血清中GLU含量的显著下降。表明在饲料鱼粉含量已较低(20.0%)的情况下，用小麦蛋白进一步替代鱼粉可能会导致不良效果，也反应出日本黄姑鱼对饲料配方中鱼粉用量的减少较黑鲷更为敏感。
3.2 小麦蛋白对日本黄姑鱼和黑鲷血清ALT、AST、SOD活性和肝脏SOD活性、MDA含量的影响谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)是与体内三大营养(蛋白质、脂质和糖类)物质以及氨基酸代谢过程紧密相关的2种酶。ALT主要参与谷氨酸和丙酮酸间的转氨作用，而AST则主要与谷氨酸和草酰乙酸之间的转氨作用相关。2种酶皆存在于鱼的肝脏中，且其活性高低是鱼体内蛋白质合成和分解代谢强弱的重要体现。正常的生理状况下，血清ALT活性极低，只有在肝功能发生障碍或肝细胞受损时，ALT才会被释放到血液中，并表现出较高的血清ALT活性。当肝脏或者机体的肌肉组织发生障碍时，血清中AST活性显著上升。血清中ALT和AST的活性可反映出鱼体肝脏的受损伤情况(Nyblom et al, 2004; 梅琳等, 2015)。本研究中，不同替代处理对日本黄姑鱼和黑鲷血清ALT、AST均无显著影响。黑鲷LT-FM替代组的ALT和AST测定值分别为17.8 U/L和83 U/L，而SPC替代组的ALT和AST测定值分别为15.9 U/L和76 U/L。以上测定值均低于刘颖等(2010)报道的黑鲷血清ALT(42.7 U/L)、AST(86.0 U/L)值。此差异可能与黑鲷的规格和饲养条件(环境因素或饵料因素)有关。但有关日本黄姑鱼血清ALT、AST的数据尚无报道。
肝脏中SOD活性、MDA含量及血清SOD活性，常作为鱼类非特异性免疫指标，其活性及含量与鱼体内存在的自由基相关(陈度煌等, 2013)。SOD具有清除鱼体内自由基的能力，可增强鱼体吞噬细胞的吞噬活性，促进与免疫相关蛋白的合成(向枭等, 2012)。鱼肝脏MDA含量，常用来指示机体内脂质的过氧化程度(宋志明等, 2015)。MDA的测定常与SOD的测定同步，SOD活力的高低间接反映机体清除自由基的能力，而MDA含量的高低则间接反应机体细胞受氧自由基攻击的程度。小麦蛋白含较高的谷氨酰胺，可占粗蛋白的35%–40%。谷氨酰胺可作为谷胱甘肽合成的前体，在鱼体内氧自由基的清除中扮演重要角色(Trichet et al, 2010)。Zhu等(2011)研究发现，杂交鲟鱼(Acipenser schrenckii♀×Huso dauricus♂)的血清SOD活性随饲料中谷氨酰胺添加量的增加而升高。在饲料中添加适量的谷氨酰胺(0.9%–1.2%)，能显著提高杂交鲟幼鱼的血清非特异性免疫和抗氧化胁迫能力。Cheng等(2012)以杂交条纹鲈(Morone chrysops× Morone saxatilis)为研究对象，发现饲料中添加谷氨酰胺会显著增加细胞间超氧阴离子数量，而后者能迅速刺激机体产生免疫应答，从而起到疾病防御的作用(Siwicki et al, 1994)。本研究中，小麦蛋白高比例替代LT-FM组(66.7%和100%替代组)的日本黄姑鱼血清SOD活性显著升高，小麦蛋白替代LT-FM组、SPC组以及联合替代组黑鲷的肝脏SOD活性在较高替代水平均表现出显著增长。因此，小麦蛋白可能因其谷氨酰胺含量的较高，在一定程度上促进了日本黄姑鱼和黑鲷非特性免疫应答。小麦蛋白替代一定量的鱼粉对日本黄姑鱼血清SOD活性有显著提升，而替代SPC对日本黄姑鱼血清SOD活性无影响，表明血清SOD活性与饲料中蛋白源混合比例或小麦蛋白添加水平有关。小麦蛋白替代鱼粉会引起日本黄姑鱼血清SOD活性的提升，而在黑鲷中表现为肝脏SOD活性的上升，说明不同鱼类对同种植物蛋白原料在利用机制上可能存在差异。
4 结论基于本研究结果，小麦蛋白替代鱼粉能引起日本黄姑鱼血清GLU的显著下降，但替代大豆浓缩蛋白时未发现类似现象。表明日本黄姑鱼较黑鲷对低鱼粉饲料中鱼粉用量的进一步下降更为敏感。小麦蛋白替代鱼粉或(和)大豆浓缩蛋白均未对黑鲷血清生化指标造成任何影响，且饲料中适量添加小麦蛋白能一定程度上提高肝脏SOD的活性。
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