2. 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071;
3. 青岛海洋科学与技术国家实验室 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室 青岛 266071
2. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071;
3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071
脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)是我国沿海重要的中小型经济虾类之一，以黄、渤海产量最高，具有生长速度快、繁殖能力强、环境适应性广等优点。近年来其养殖面积迅速扩大，成为沿海滩涂地区主要的特色水产养殖品种(王兴强等, 2008)。但是，目前脊尾白虾养殖的苗种主要依赖捕捞野生天然苗或投放抱卵亲虾自行繁殖，而上述方式无法避免种质来源不稳定和携带病源等问题的干扰(梁俊平等, 2012; 梁俊平, 20131))。影响脊尾白虾养殖产业可持续发展的瓶颈问题是良种缺乏，培育生长速度快、抗逆性强的优良品种是产业亟需解决的问题(李吉涛等, 2013; 王有昆等, 2015)。
1) Liang JP. Study on the technology of artificial breeding and expression of genes involving in reproducing of Exopalaemon carinicauda. Doctoral Dissertation of Ocean University of China, 2013 [梁俊平.脊尾白虾全人工繁育及繁殖相关基因的研究.中国海洋大学博士研究生学位论文, 2013]
回交作为杂交育种的重要手段，旨在通过杂交子代与亲本的再次杂交，从而使杂交后代进一步加强轮回亲本的某些优良性状，减少杂交后代性状的分离，同时保留非轮回亲本的某些优良性状。因此，回交更有利于提高品种的优越性、有利于正确选择具有某些特定性状的优良品种。回交育种已经在农作物中广泛应用，何云霞等(2009)1)应用回交育种和QTL聚合改良粳稻抗旱性；赵福宽等(2004)用高代回交材料筛选与番茄(Lycopersicon)耐冷性相关的RAPD分子标记。鱼类中也有相关报道(Sekino et al, 2005; Ruan et al, 2010)，如利用微卫星技术对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、萨罗罗非鱼(Sarotherodon melanotheron)及其正反杂交鱼的正反回交子代进行了遗传变异分析，探讨了回交的遗传效应(李腾云等, 2008; 吴俊伟等, 2015; 刘于信等, 2009)；储志远等(2011)利用132对SSRs标记和63对EST-SSRs标记对柏氏鲤(Cyprinus pellegrini Tchang)和荷包红鲤(Cyprinus carpio var. wuyuanensis)抗寒品系回交子代的84个个体进行检测，并与生长性状进行了相关性分析。
1) He YX. Improving drought tolerance of japonica rice by BC breeding and QTL pyramiding. Doctoral Dissertation of Shenyang Agricultural University, 2009 [何云霞.应用回交育种和QTL聚合改良粳稻抗旱性.沈阳农业大学博士研究生学位论文, 2009]
近年来，微卫星技术在脊尾白虾遗传育种研究中得到了广泛地应用(马朋等, 2011)。贾舒雯等(2012)、Jia等(2013)利用微卫星对脊尾白虾3个不同地理群体的遗传多样性和遗传结构进行了分析。王日芳等(2016)2)利用微卫星对近交家系的遗传多样性分析，得出3个近交家系7-9世代的纯合率已经达到56.21%-77.59%，并且家系间已呈分化趋势。由于虾类大多属于一年生，目前，在虾类中进行回交并开展相关研究较少。本研究利用脊尾白虾一年可多次性成熟的特性，首次构建了脊尾白虾的回交家系，采用25个微卫星标记对3个回交家系进行了遗传多样性分析，旨在分子水平上探讨回交家系的遗传特性，为脊尾白虾遗传育种工作提供理论依据。
2) Wang RF. Genetic diversity in inbred lines of Exopalaemon carinicauda based on microsatellite loci. Master's Thesis of Shanghai Ocean University, 2016 [王日芳.脊尾白虾近交系遗传多样性的微卫星分析上海海洋大学硕士研究生学位论文, 2016]
1 材料与方法 1.1 家系构建及样品采集从浙江象山野生群体和山东日照野生群体中选择体型好、个体大、性成熟的个体作为原始亲本。3个回交家系及杂交家系F1的构建方法：A.象山♀ × (象山♀ ×日照♂)♂；B.日照♀ ×(日照♀×象山♂)♂；C. (象山♀ ×日照♂)♀ ×日照♂；F1.象山♀ ×日照♂。
1.1.1 回交群体的幼体培育和养殖每个回交家系各取500尾Ⅰ期蚤状幼体，单独放入200 L桶中，采用常规方法培育。不同家系同一阶段的培育条件一致。幼体以褶皱臂尾轮虫(Brachinonus plicatilis)、卤虫(Artemia sinica)为主要饵料，每天换水10%，连续充气培养。幼体转成仔虾后，每个家系各取300尾仔虾，转入500 L桶中，继续养殖，养殖条件保持一致。
待各家系个体养成成虾，各家系随机选取30尾，取肌肉，放入95%乙醇保存，待提取DNA。
1.2 基因组DNA的提取基因组DNA的提取参照刘萍等(2000)传统酚氯仿方法，从脊尾白虾腹部肌肉中提取基因组DNA，溶解于灭菌ddH2O中，稀释至60-80 ng/μl备用。
1.3 脊尾白虾基因组DNA的微卫星分析选取自行开发的多态性较好的25对微卫星标记引物(表 1)，交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR扩增体系(20 μl)：2 μl基因组DNA (60-80 ng/μl)，正、反向引物(100 μmol/ml)各1 μl，10 μl 2× TsingKeTM Master Mix，6 μl灭菌水。PCR反应程序：95℃预变性5 min，95℃变性40 s，退火温度(49℃ -63℃) 40 s，72℃延伸40 s，30-35个循环，72℃充分延伸10 min。PCR扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、银染检测，数码相机拍照。
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表 1 脊尾白虾微卫星引物的序列 Table 1 Microsatellite primers of E. carinicauda used in this study |
胶染色后，在灯照下通过与DNA分子量标准(PBR322 DNA marker)对比判读每尾个体的基因型大小及基因分型。其中，无扩增条带则为无效等位基因，1条条带的为纯合子，2条条带的为杂合子。利用群体遗传分析软件PopGene 32，计算3个回交家系25个标记位点的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、多态信息含量(PIC)，遗传距离(D)，并计算各家系间Nei氏标准遗传距离(1972)，进行系统聚类分析。计算3个回交家系、野生群体、杂交家系在25个微卫星座位的平均基因纯合率(个体样本为纯合子的基因位点数占全部基因位点数的百分比)。
2 结果 2.1 遗传多样性3个回交家系各个位点的遗传多样性参数Na、Ho、He、PIC见表 2。25个位点在3个家系中共检测到62个等位基因。各家系的等位基因数分别为56、54、51，3个回交家系共同存在39个等位基因，其中，A家系的等位基因数最多。经进一步计算，将3个回交家系、杂交家系、野生群体的25个位点的遗传多样性的相应指标平均值罗列在表 3，可更直观的进行家系间的差异对比。由表 3可知，A、B和C家系的平均等位基因Na分别为2.21、2.18、2.09；观测杂合度Ho分别为0.3805、0.3703、0.2489；期望杂合度He分别为0.3629、0.3998、0.2503；多态信息含量PIC分别为0.3257、0.3391、0.2585。A、B回交家系呈现中度多态(0.5 < PIC < 0.25)，而C回交家系为低度多态(PIC < 0.25)，相较于野生群体与杂交家系显著降低。
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表 2 各回交家系25微卫星位点的遗传多样性参数值 Table 2 The genetic parameters of 25 microsatellite loci of each backcross family |
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表 3 各群体在25个微卫星位点上的遗传多样性参数 Table 3 Genetic diversity parameters of 25 microsatellite loci of each population |
3个家系25个位点中分别有部分位点发生纯合(表 4)，其中，ECL10在3个回交家系中都发生了纯合，ECL13、ECL19、ECL25位点在B、C家系中发生了纯合，ECL04在A、B家系中发生纯合，ECL31在C家系中表现为纯合。基因纯合率是每个个体的纯合座位占总检测座位的比率。各家系的平均纯合率分别为53.86%、56.53%、63.33%，显著高于野生群体基因纯合率(16.91%)和杂交家系的基因纯合率(15.38%)(表 4)。且在3个家系中各发现了一个无效等位基因位点(如表 4所示，A家系中的无效等位基因位点ECL25，B家系中的无效等位基因位点ECL23，C家系中的无效等位基因位点ECL06)。
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表 4 各群体的纯合位点及纯合率 Table 4 Homozygous sites and homozygosity rates of each population |
使用PopGene软件，计算出脊尾白虾3个回交家系的Nei氏标准遗传距离和遗传相似系数(表 5)，遗传距离介于0.0899-0.1649，遗传相似度介于0.8479-0.9140。B家系和C家系之间的遗传距离最短，A家系和C家系拥有相对长的遗传距离。通过UPGMA法构建的聚类图(图 1)显示，B家系和C家系先聚为一支，再与A群体聚为一支。
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表 5 3个脊尾白虾回交家系间的遗传距离(D，对角线下)及遗传相似性(Ⅰ，对角线上) Table 5 Nei's genetic distance (D, below diagonal) and genetic identity (Ⅰ, above diagonal) among three backcross families |
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图 1 基于遗传距离的UPGMA聚类图 Figure 1 UPGMA clustering tree based on D genetic distance |
本研究分析了3个回交家系在25个位点上的遗传多样性的相应指标(Na、Ne、Ho、He、PIC)的平均值见表 3，等位基因数(Na)平均值，有效等位基因数(Ne)平均值，平均多态信息含量PIC，平均杂合度(Ho，He)都有所降低，与野生群体和杂交家系相比有了明显的降低，这与王磊等(2011)所做的牙鲆(Paralichthys olivaceus)回交家系与野生亲本家系的对比、朱晓平等(2012)所做线纹尖塘鳢(Oxyeleotris lineolatus)和云斑尖塘鳢(Oxyeleotris marmoratus)回交家系与亲本家系的对比结果相同。回交家系的遗传多样性整体降低符合孟德尔遗传定律，证明随着回交的进行杂合度自然下降，回交家系的杂合子减少，纯合子增加，但也不排除由于脊尾白虾回交家系构建过程中人工选择单一的亲本个体，并由这些个体产生大量的后代，造成部分等位基因的缺失。但也有些位点一直维持较高的杂合度(ECL02、ECL16、ECL29等)。推测这些位点可能是脊尾白虾种质特有的，而这些位点也不会随回交代数的递进而降低。王日芳(2016)1)利用微卫星对脊尾白虾近交家系进行遗传多样性的相关分析，同样发现类似的位点，这些位点被认为是脊尾白虾近交系特异的“生命基因”(李凯等, 2009)，但这些位点有待进一步验证。
1) Wang RF. Genetic diversity in inbred lines of Exopalaemon carinicauda based on microsatellite loci. Master's Thesis of Shanghai Ocean University, 2016 [王日芳.脊尾白虾近交系遗传多样性的微卫星分析.上海海洋大学硕士研究生学位论文, 2016]
3.2 家系基因纯合率分析A家系的纯合位点3个，B、C的纯合位点都为5个，3个回交家系存在一个共同的纯合位点ECL10。有些位点(ECL04、ECL24在C家系中)虽然没有达到完全的纯合，但杂合度已经减小，这些位点可能随着回交代数的增加而表现为完全纯合(王日芳, 2016)1)。同时，在回交家系中发现了个别无效等位基因位点(如A家系中的ECL06位点)，这可能是由于微卫星两侧翼的序列保守性低发生了突变，引物不能与之结合，从而导致无扩增条带的结果，也可能因为回交家系是由少量脊尾白虾亲本产生大量的子代，导致其后代群体等位基因数量缺失，从而产生了遗传漂变和偏离平衡。
1) Wang RF. Genetic diversity in inbred lines of Exopalaemon carinicauda based on microsatellite loci. Master's Thesis of Shanghai Ocean University, 2016 [王日芳.脊尾白虾近交系遗传多样性的微卫星分析.上海海洋大学硕士研究生学位论文, 2016]
基因的纯合率是每个个体的纯合座位占总检测座位的比率。本研究中所有回交家系回交一代的纯合率都达到了50%以上，与野生群体的纯合率(16.91%)和杂交家系的纯合率(15.38%)相比显著增高，说明3个回交家系的基因纯合的速率都较快。与吴俊伟等(2015)在尼罗罗非鱼与萨罗罗非鱼的回交群体和刘于信等(2009)在耐盐罗非鱼的回交群体中所得到的回交家系的遗传多样性降低、基因纯合性升高的结论相似。同时，经比较回交家系回交一代的基因纯合率与王日芳(2016)1)所做的脊尾白虾3个近交系7世代结果相近，说明回交相较于近交可更快的获得基因纯合的个体。
3.3 家系间的遗传距离及遗传相似度分析由表 5和图 1可知，3个家系间的遗传距离相对较小，在0.0899-0.1649之间，与尼罗罗非鱼与萨罗罗非鱼各回交家系间的遗传距离(0.062-0.182) 相似(李腾云等, 2008)。说明回交家系亲缘关系较近，可能是由于3个家系的原始亲本都是来自相同的地理群体。其中，B、C家系的遗传距离最小为0.0899，遗传相似度为0.9140，并且B、C家系最后聚为一支，而吴俊伟等(2015)根据理论的基因频率和实验结果发现，在尼罗罗非鱼和萨罗罗非鱼回交一代和回交二代中，轮回亲本的遗传组成必定超过50%。故推测，此结果可能是由于B、C的轮回亲本都为日照野生个体。
综上所述，脊尾白虾回交家系的基因纯合率较高，更容易得到基因纯合的个体，利用回交育种适合于选育具有生长速度快、环境适应性广、抗逆性强的脊尾白虾优良品种，为脊尾白虾的遗传改良提供了理论依据和技术支持。
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