硒是人体所需要的微量营养元素之一，具有提高机体免疫力、抗病、排毒解毒等生理功效(史丽英，2005)，而水产品中的硒是人类获取硒的重要渠道。仿刺参(Apostichopus japonicus)为我国海水重要养殖经济种类，除传统上普遍认知的营养价值之外(沈鸣, 2001)，已成为优良的补硒食品之一。然而，随着工厂化养殖及养殖规模不断增大，仿刺参病害频繁发生(王印庚等, 2004)，滥用抗生素类药物和大剂量用药致使细菌耐药性增强及环境污染等问题日趋严重。因此，开发有免疫增强效果的免疫增强剂，提高仿刺参免疫力是减少病害发生的有效途径(Lan et al, 2005)。罗辉等(2006)研究发现，添加适量外源硒可以增强水生动物的免疫功能，提高抗病能力，还可获得富硒水产品。近年来，主要采用无机硒(亚硒酸钠等)和有机硒(富硒酵母等)作为畜禽和水产饲料中的硒添加剂，其中，有机硒具有安全性高、易为机体吸收、生物活性高等优点，其利用效果远远好于无机硒(Bell et al, 1987)。而体内主要存在形式为硒代蛋氨酸(郝素娥等, 1999)，有机硒含量占总硒含量的80%以上，是一种较理想的硒补充剂。

添加硒对养殖仿刺参的影响已有研究，但主要集中在研究无机硒对仿刺参的生物学影响，发现不同物种对硒的需要量不同(谢帝芝等, 2010)；也有在饲料中添加有机硒，如酵母硒、蛋氨酸硒的相关研究(王吉桥等, 2011)，但对各组织中各种酶的活性的详细变化及仿刺参各组织中的硒含量却缺乏研究，如仿刺参养殖中硒的适宜剂量等。本研究在仿刺参中投喂添加外源硒的饲料，并测定其成活率、相关酶的活性及仿刺参硒含量，探索养殖环境中硒对仿刺参健康指标的影响，确定仿刺参饲料中硒的适宜浓度，以丰富仿刺参的营养学内容，以期在健康、高效、可持续养殖仿刺参的同时，获得富硒仿刺参，提高刺参的营养价值及养殖效益。

1 材料与方法 1.1 材料

实验于2014年7月28日—8月28日在山东蓬莱宗哲养殖有限公司刺参养殖车间进行，所用仿刺参取自室内养殖池，平均体重为(60.75±0.32) g，暂养7 d后，选择健康、规格整齐的仿刺参随机分到各水箱(150 cm × 120 cm × 60 cm)中，进行正式实验。养殖实验在常规避光养殖车间内进行，共进行28 d。富硒酵母(硒含量标准为1500 mg/kg)购于安琪酵母股份有限公司，经测定总硒实际含量为(1408.80±0.47) mg/kg，其中，有机硒含量为(1141.13±0.26) mg/kg，无机硒含量为(267.67±0.58) mg/kg。

1.2 方法 1.2.1 实验设计

暂养后的仿刺参随机放入水箱，每个水箱20头，共分为7组，每组设3个平行。采取逐级放大的方法在基础饲料中添加富硒酵母(饲料中添加0.20%明胶增稠剂，使饲料不易分散)，使各组饲料中硒浓度依次为0 (空白对照)、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20、6.40 mg/kg，以上各组依次编号为G0、G1、G2、G3、G4、G5、G6。

1.2.2 饲养管理

实验采用低温井水，水温为16–18℃，溶解氧为6–8 mg/L，24 h持续充气，pH为7.8–8.2，盐度为31.0–32.0。每天吸除粪便，换水1/3–1/2，每2 d全部换水1次。每天定时测定水温、pH和盐度，及时观察仿刺参的摄食、活力及健康情况，做好记录。每日07:00和16:00投喂2次，投喂量为体重的4%–5%，并依摄食情况而定。停止投喂添加富硒酵母的饲料7 d后取样。

1.2.3 测定项目与方法

实验结束时，统计各组仿刺参的个数，公式如下：

存活率(Survival rate, SR, %)=最终存活数/初始总头数×100

从每组随机取出的15头刺参，用生理盐水冲洗并用滤纸吸干水分。在冰盘上的培养皿里，用注射器抽取体液(1.5 ml)及剪取少量外壁、内壁、呼吸树、消化道、肌肉组织(1 g左右), 保存于2 ml冻存管中，迅速放入液氮罐中，运回实验室进行酶活性分析。体腔液离心后直接测定酶活性，而其他各组织需要用玻璃匀浆器冰浴研磨，离心后对蛋白酶、淀粉酶及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)活性进行测定(采用南京建成生物工程研究所的试剂盒)。仿刺参各组织粗酶液中的蛋白浓度采用南京建成生物工程研究所的考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒进行测定。每组其余35头仿刺参解剖取各组织，经冷冻干燥后，用10 ml浓硝酸(浓硝酸－高氯酸)消解，用氢化物发生-原子荧光法测定硒的含量。

1.2.4 数据处理与分析

所测得的数据用平均值±标准差(Mean±SD)表示，用Excel 2007和SPSS 19.0软件进行处理、制作图表和进一步统计分析。所有数据进行单因子方差分析(One-way ANOVA)后，并进行Duncan组间多重比较。P＜0.05为显著性差异。

2 结果 2.1 不同硒水平对仿刺参成活率及消化酶活性的影响

从表 1可以看出，各实验组仿刺参的成活率在85%以上。随着硒浓度的增加，仿刺参的生长速度增加，成活率显著增加，但当硒浓度超过1.60 mg/kg时，成活率又呈降低趋势，仿刺参出现了化皮现象。硒水平为0.40–1.60 mg/kg饲料组无仿刺参死亡，成活率最高为100%；硒水平为6.40 mg/kg的G6组成活率最低。

仿刺参消化道内消化酶活力见图 1。从图 1可以看出，各实验组蛋白酶活力(图 1-A)、淀粉酶活力(图 1-B)均先升高后降低，而蛋白酶活力变化趋势较平缓，淀粉酶活力变化幅度较大。G3组蛋白酶、淀粉酶活性分别达到最高，为35.13 U/mg prot、0.51 U/mg prot，分别为对照组的2.45倍和2.07倍。各组蛋白酶活力均与对照组有显著差异(P＜0.05)。在硒添加浓度为6.40 mg/kg的高硒组仿刺参的蛋白酶和淀粉酶活力均显著低于对照组(P＜0.05)。

2.2 不同硒水平对仿刺参免疫相关酶活力的影响 2.2.1 硒对SOD活性的影响

图 2-A—图 2-F依次为外壁、内壁、呼吸树、消化道、肌肉及体液中的SOD活力。仿刺参各组织中SOD活性均随硒浓度增加呈先升高后降低的变化趋势。在投喂较低硒浓度(0.20 mg/kg)时，仿刺参各组中SOD活性变化很小，在适宜硒浓度(0.40–3.20 mg/kg)时均高于对照组，在投喂高硒浓度(6.40 mg/kg)饲料时，远远低于对照组(体液中的SOD活性除外) (P＜0.05)；外壁、内壁及体腔液中SOD的活性变化幅度较大，分别在硒浓度为1.60 mg/kg时达到最高，为67.75 U/mg prot、55.22 U/mg prot和158.04 U/100 ml，而其他3个组织中的SOD活性则相对平稳，分别在硒浓度为0.80 mg/kg时达到最高。除G3组与G4组外，其余各组间外壁组织中SOD活性均差异显著(P＜0.05)，且各组间内壁及体液组织中的SOD活性均差异显著(P＜0.05)。

2.2.2 硒对GSH-Px活性的影响

图 3-A—图 3-F依次为外壁、内壁、呼吸树、消化道、肌肉及体液中的GSH-Px活力。结果显示，添加不同水平硒后，7组仿刺参各组织中GSH-Px活性均明显提高。饲料硒水平为0–1.60 mg/kg时，仿刺参各组织中的GSH-Px活性随着硒添加浓度的增加而提高并趋于平缓，硒添加量为1.60 mg/kg时达到最高，而当硒添加量超过1.60 mg/kg时，GSH-Px活性明显下降。G0组与G5组仿刺参肌肉组织GSH-Px活力差异不显著(P＞0.05)，其余各组间均差异显著(P＜0.05)；其余各组织中的GSH-Px活力均差异显著(P＜0.05)。

2.2.3 硒对AKP和ACP活性的影响

图 4-A— 图 4-F及图 5-A—图 5-F依次为外壁、内壁、呼吸树、消化道、肌肉及体液中的AKP、ACP活力。投喂含不同浓度硒饲料的仿刺参各组的AKP和ACP活性均随硒浓度增加呈先升高后降低的趋势，但AKP的活性提高幅度更大。当硒浓度为0.80、1.60 mg/kg时，仿刺参各组织AKP、ACP活性均显著高于对照组(P＜0.05)。消化道中AKP活性最高达到47.83 U/g prot，是对照组的3.93倍，体液中AKP活性提高倍数最高，是对照组的10.78倍；在硒浓度为0.80 mg/kg时，消化道组织(25.73 U/g prot)及体液(124.41 U/100 ml)中的ACP活性最高，分别是对照组的1.69倍和2.81倍；当硒浓度为6.40 mg/kg时，各组仿刺参不同组织AKP、ACP活性最低。

2.3 富硒酵母对仿刺参硒含量分布规律及硒含量的影响

7组仿刺参各组织(干样)中的总硒及有机硒含量均呈先升高后降低的变化趋势，无机硒则呈先升高后降低又升高的变化趋势(表 2)。G3组仿刺参肌肉及体壁中的总硒(图 6-A)及有机硒(图 6-B)含量最高，均显著高于其他组(P＜0.05)；而G6组的总硒含量最低，显著低于对照组(P＜0.05)；仿刺参消化道中总硒及有机硒含量的变化趋势基本与体壁及肌肉中的硒含量变化相似，但不同的是，消化道中硒含量变化幅度较大；呼吸树组织内的总硒及有机硒含量变化相对平缓，各组间值较接近。

不同硒水平条件下仿刺参各组的总硒及有机硒含量存在较大差异，各组总硒与有机硒含量呈显著增长，无机硒却呈先降低后增高的变化趋势(图 6-C)，有机硒含量远远高于无机硒的含量。消化道为硒含量变化幅度最大的组织；肌肉为硒含量最高的组织，G0组(对照组)肌肉总硒、有机硒及无机硒含量分别为10.64、9.33、1.31 mg/kg，有机硒为无机硒的7.13倍，经过富硒养殖后G3组中总硒及有机硒含量增加至26.44、25.17 mg/kg，无机硒降低至1.26 mg/kg，有机硒为无机硒的19.93倍，富硒倍率提高至2.49、2.70、0.97倍，有机硒富硒倍率为无机硒富硒倍率的2.80倍；呼吸树中总硒及有机硒含量最低。外壁与内壁组织中总硒、有机硒含量较接近，低于肌肉组织，可食用部分体壁和肌肉组织含量高于呼吸树和消化道。总之，28 d后，各实验组仿刺参各组织中的总硒及有机硒含量变化规律为肌肉＞外壁＞内壁＞消化道＞呼吸树。

3 讨论 3.1 不同硒水平对仿刺参成活率及消化酶的影响

本研究结果表明，中间硒浓度组的仿刺参成活率最高(100%)，低硒浓度G1组的成活率高于对照组，而高硒浓度G6组的成活率低于对照组。按Weinberg原理，动物对硒的营养需要有适宜剂量范围，超过这个范围，动物会患硒缺乏症缓慢、急性中毒，成活率降低。Bell等(1987)研究表明，饲喂补硒饲料的大西洋鲑(Salmon salar)增重率和成活率均高于缺硒组。王吉桥等(2011)研究发现，摄食添加硒饲料仿刺参的成活率高于摄食对照饲料的刺参，以上研究结果均与本研究结果一致。

在低硒浓度范围内，随着硒浓度的增加，消化酶活力逐渐升高；相反，在高硒浓度条件下，消化酶的活力随着硒浓度的增加而逐渐降低，但仍然高于对照组。硒浓度为6.4 mg/kg时，消化酶活性最低，说明添加适宜浓度硒可提高刺参的消化能力，高浓度硒反而有毒性，影响刺参的生长。有关硒对水产动物消化酶活性影响的研究甚少。金明昌等(2008)、苏传福等(2007)研究表明，硒可提高其他水产动物的消化酶活性，促进生长。外源硒之所以能改善水产动物体内消化酶的活性，可能是因为硒可以提高机体内代谢活性，相应的消化能力也增强。冯丹等(2014)发现，饲料中添加蛋白有利于提高仿刺参的蛋白酶活性；刘曼西等(1985)研究表明，硒酵母中有机硒主要为硒蛋白，所以仿刺参体内蛋白酶变化很明显。而淀粉酶活力变化幅度则较大，这可能是由于淀粉酶对富硒酵母的适应性不如蛋白酶好。由仿刺参的存活率和消化酶活力综合判断，硒添加量在0.80 mg/kg时，最适合仿刺参生长。

3.2 硒对免疫相关酶的影响

本研究中，仿刺参摄食不同添加量的富硒酵母饲料时，各组织中的SOD活力显著不同，尤其是体腔液中SOD活力显著提高，均呈现先升高后下降的趋势，说明仿刺参体腔液中的SOD在免疫过程中发挥重要作用。王吉桥等(2011)研究表明，饲料中添加硒可显著提高仿刺参体腔液中的SOD活性，有效地抵抗氧化损害。此外，王宏伟等(2005)发现，中华米虾(Caridina denticulata sinensis)体内SOD的活性随着饲料中硒添加量的增加先上升后下降。硒能提高仿刺参体内SOD活力、增强机体抗氧化能力，推测可能与硒的抗免疫、抗氧化作用有一定相关性。

徐辉碧等(1991)、Avanzo等(2001)、Sarada等(2002)研究发现，GSH-Px是机体内的一种抗氧化酶和硒代谢库，其活力可以在一定程度上反映机体硒水平。本研究表明，添加外源硒能提高GSH-Px的活性，且在不同组织中各异。另有研究表明，GSH-Px活性在不同鱼类、不同组织中不同(Trenzado et al，2006)。梁萌青等(2006)、谈枫等(2015)研究表明，鲈鱼(Lateolabrax japonicus)体内GSH-Px的活性随饲料中硒添加量的增加呈先上升后下降的趋势，这与本研究结果相似。侯江文等(1996)发现，畜禽体内GSH-Px活力随饲料中硒含量的增加而升高，严重缺硒时，组织中GSH-Px活性下降到很低的水平。总之，硒的添加水平会影响仿刺参的GSH-Px活性和抗氧化能力、生长及存活。

本研究结果显示，仿刺参体壁中AKP和ACP活性变化趋势类似，随着硒浓度的升高，呈现先增高后降低的趋势，与磷酸酶可以被外源刺激物激活的研究结果相一致(詹付凤等，2007；谢帝芝等，2010)。磷酸酶不但可以被硒激活，还具有剂量依赖性，高硒浓度条件下仿刺参的酶活力降低，推测硒产生了一定的毒性。在最适硒浓度范围内，磷酸酶活性差别不大，甚至出现持平现象，推测仿刺参体内的磷酸酶活性随着时间的延长不断变化，或者可能与“免疫疲劳”有关(白楠，2010)¹⁾。总之，在适宜浓度范围内，增加硒的含量对提高仿刺参磷酸酶的活力有一定的协同作用，但高剂量的硒会抑制磷酸酶的活力。

1) Bai N. The research on frequency of administration of immunostimulants and immunity fatigue for white shrimp Litopenaeus vannamei and sea cucumber Apostichopus japonicus. Master´ s Thesis of Ocean University of China, 2010 [白楠.凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei、仿刺参Apostichopus japonicus免疫增强剂使用频率和免疫疲劳的研究.中国海洋大学硕士研究生学位论文, 2010]

3.3 硒水平对硒含量分布规律及硒含量的影响

本研究中，饲料中硒含量在一定的范围内，仿刺参各组织(干样)中硒的含量都随饲料中硒含量的增加而增加，说明仿刺参可将外源硒转化为体内硒，与饲料中添加硒可提高动物体中硒含量的研究结果相符(沈梅等，2001)。仿刺参各组织中的总硒及有机硒含量在一定范围内随富硒酵母添加量的增加而逐渐增加，当硒含量为0.8 mg/kg时达到最高点，但超过该范围后，硒含量变化与对照组相比增加缓慢，且与最高值相比反而降低了，这说明动物对硒元素的代谢吸收存在适宜的剂量范围，即硒的剂量-效应关系曲线超过这个范围，硒的利用程度会降低，具体表现为消化道中无机硒比例显著上升，其他各组织中有机硒比例明显降低。而仿刺参体内无机硒呈先升高后降低又升高的变化趋势，可能是酵母硒中存在少量无机硒，在缺硒条件下加强了仿刺参对硒的吸收利用，在适宜浓度范围内，仿刺参可以充分将无机硒转化为体内的有机硒，但当毒性效应产生后，仿刺参对硒的代谢吸收能力迅速降低，无机硒的积累程度增大。

仿刺参各组织均具有较强的富集硒能力，不同形态硒的富硒倍率明显不同，与李秀梅等(2015)的研究结果一致。仿刺参消化道中硒含量变化幅度较大，可能是因为随着硒的不断添加，有机硒在消化道中持续吸收，在其他组织中硒代谢较缓慢。仿刺参体壁及肌肉中硒的含量均高于消化道，说明消化道吸收的硒已通过新陈代谢在体壁及肌肉中积累。Zhou等(2009)发现，肌肉是动物体内的硒库之一，硒在动物体内最终以硒代氨基酸的形式稳定储存在肌肉中。本研究中，仿刺参肌肉中总硒及有机硒含量最高，与此结论一致。韩华(2011)发现，仿刺参体壁的胶原蛋白中蛋氨酸和半胱氨酸的比例较低，所以仿刺参体壁中硒蓄积量低于肌肉中。本研究中，摄食添加酵母硒的仿刺参肌肉及体壁中硒含量明显高于对照组，说明饲料中的硒是仿刺参肌肉及体壁中硒的重要来源，提高了可食用部分的有机硒含量，满足人类对硒的需求。有关仿刺参中硒营养的研究可从两方面着手：进一步深入探究硒的代谢机理；深入到分子水平研究硒蛋白及其他与硒生物学作用相关功能蛋白和基因表达的内在调控机制。