2. 青岛海洋科学与技术国家实验室 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室 青岛 266071;
3. 南京农业大学无锡渔业学院 无锡 214081
2. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071;
3. Wuxi Fisheries College, Nanjing Agricultural University, Wuxi 214081
凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)俗称南美白对虾，自然分布于墨西哥南部至秘鲁北部的太平洋沿岸水域，具有生长速度快、抗逆性强等特点(王兴强等, 2004)。目前，凡纳滨对虾的养殖产量已达到我国养殖对虾总产量的80%以上(渔业统计年鉴, 2011)，成为我国最重要的海水经济类养殖品种之一。
凡纳滨对虾自然生长温度为25-35℃，低于18℃时则停止摄食(Ponce-Palafox et al, 1997)。但是，近年来由于气候异常，频发低温现象，导致凡纳滨对虾大量死亡，同时，温度因素也影响着凡纳滨对虾的养殖产量和效益(Qiu et al, 2011)。因此，选育耐低温性状优良的凡纳滨对虾良种已经成为其育种领域的重要目标之一。
在水产动物育种过程中，利用不同遗传背景的群体进行相互杂交能获得杂种优势(姚雪梅等, 2007)，而探究不同群体间自交与杂交子代性状的差异性，能够为在生产中如何充分利用杂种优势提供理论和实践的经验。在凡纳滨对虾育种领域，目前已报道的有“中兴1号”(陈锚等, 2008)、“中科1号”(黄永春等, 2010)、“科海1号”(安迪, 2011)1)和“壬海1号”(梁华芳等, 2011)，其优良性状包括生长速度、存活率、抗病等，均是利用杂种优势选育出来的(阮晓红等, 2013)，但目前未见与耐低温性状相关的选育良种。
1) An D. Study on the effect of selective breeding and genetic parameters for Litopenaeus vannamei. Master's Thesis of North West Agriculture and Forestry University, 2011, 10-12 [安迪.凡纳滨对虾体重和体尺性状的遗传参数和选择育种效果研究.西北农林科技大学硕士研究生学位论文, 2011, 10-12]
微卫星分子标记目前已被广泛应用在水产动物育种领域中(张博等, 2012)。利用微卫星分子标记对群体间进行遗传多样性和遗传结构差异性的研究，既有助于对选育群体进行遗传多样性监测，也对亲本群体的选择也有着指导作用(Cruz et al, 2004)。目前，在许多水产动物中都有相关的研究报道，如大菱鲆(Scophthamus maximus) (候仕营等, 2011)、斑节对虾(Penaeus monodon) (Dixon et al, 2008)、中国对虾(Fenneropenaeus chinensis) (张天时等, 2005)、太平洋鳕(Gadus macrocephalus) (Liu et al, 2010)、海湾扇贝(Argopecten irradians) (Wang et al, 2007)、长牡蛎(Crassostrea gigas) (张荣良等, 2016)等。
本研究利用中国水产科学研究院黄海水产研究所种质资源与工程育种研究室连续3年选育的凡纳滨对虾群体，与国外引进的群体进行杂交，比较自交与杂交F1群体在低温条件下生长性能的差异，同时利用13个微卫星位点，对2个子代群体进行遗传多样性及遗传分化的研究，以期为凡纳滨对虾耐低温遗传改良与杂交选育提供遗传背景数据和生产实践经验。
1 材料与方法 1.1 实验材料实验所选凡纳滨对虾来源于中国水产科学研究院黄海水产研究所农业部海水遗传育种中心，主要包括2个群体。
1.1.1 选育群体(SP)由美国和新加坡引进的7个不同来源的凡纳滨对虾群体作为基础群体，通过采用控制近交的交配方案，进行以生长性状为主的多性状复合选育，经连续3年选育后形成的育种群体，共45个家系。
1.1.2 杂交群体(HP)由凡纳滨对虾选育群体的种虾作为父本或母本，当年从韩国和新加坡的良种公司引进的凡纳滨对虾种虾作为母本或父本，杂交产生的F1代群体，共30个家系。
1.2 实验方法 1.2.1 低温生长测试将建立的凡纳滨对虾家系培育至体长约3 cm时，对每个家系的个体进行VIE荧光标记，以便在混养时区分不同的家系。标记后，逐尾测量初始生长性状指标，并将所有家系转移至100 m2养殖池内混养。暂养期间，每天降温1℃至(19.0±0.5)℃时正式开始实验，实验共持续50 d。实验期间，每天投喂3次配合饲料，投喂量为池中虾总体重的3%-8%，每天定时排污1次，期间不换水，每3 d补水1次至正常水位。
1.2.2 实验数据的采集低温生长测试结束后，对存活的凡纳滨对虾个体进行生长性状的测量。对每个样品测量其体长(BL)、体重(BW)、第1腹节宽(FASW)、第3腹节宽(TASW)、第1腹节长(FASL)、第1腹节高(FASH)、头胸甲长(CL)和腹节全长(ASL)，其中，FASW、TASW、FASL、FASH、CL、ASL用电子游标卡尺进行测量，精度为0.01 mm；体长的测量采用普通直尺，精度为0.1 cm；体重采用电子天平进行测量，精度为0.01 g。表型性状测量完毕后，每个家系随机选取10-20尾个体，提取腹部肌肉组织，并保存在-80℃冰箱中备用。
1.2.3 凡纳滨对虾基因组DNA的提取与检测参照王伟继(2008)2)的方法提取凡纳滨对虾基因组DNA。用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。用超微量紫外分光光度计对DNA进行定量检测(五洲东方牌)，检测浓度和吸光值(A260 nm/A280 nm，最佳范围为1.8-2.0)，定量后将DNA溶液稀释至50 ng/μl，-20℃冷冻保存备用。
2) Wang WJ. Genetic mapping of the Chinese shrimp (Fenneropenaeus chinensis) using AFLP markers and commercial traits QTL mapping. Doctoral Dissertation of Ocean University of China, 2008, 19-20 [王伟继.中国对虾(Fenneropenaeus chinensis) AFLP分子标记遗传连锁图谱的构建以及相关性状的QTL定位分析.中国海洋大学博士研究生学位论文, 2008, 19-20]
1.2.4 PCR扩增及产物基因分型采用本实验室建立的3组凡纳滨对虾微卫星多重PCR体系进行样品的检测。微卫星位点信息及修饰荧光类型见表 1，并利用ABI 3130xl测序仪对PCR产物进行基因分型。荧光引物合成由上海生物工程技术有限公司完成。
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表 1 凡纳滨对虾微卫星多重PCR位点信息及其修饰荧光类型 Table 1 The information and the fluorescence labeling of microsatellite multiplex PCR for L. vannamei |
应用Excel统计所测量表型性状的最大值(Max)、最小值(Min)、平均值(AVG)、标准差(SD)和变异系数(CV)。应用SPSS 19.0数据分析软件计算特定增长率(SGR)和绝对增重率(AGR)，并通过单因素方差分析(One-way ANOVA)检验生长性状的差异显著性。特定增长率(SGR)和绝对增重率(AGR)分别通过以下公式计算：
特定增长率(Specific growth rate, SGR, %/d)=100× (lnWe-lnWb)/t
绝对增重率(Absolute weight gain, AGR, g/d)= (We-Wb)/t
式中，Wb和We分别指生长初期的体重和生长末期的体重，t为养殖的天数。
1.3.2 分子数据分析利用GeneMapper 4.0软件进行基因分型数据分析。利用Cervus 3.0软件对基因型数据进行分析，主要分析内容包括平均等位基因数(Na)、平均观测杂合度(Ho)、平均期望杂合度(He)、平均多态信息含量(PIC)以及哈迪-温伯格(Hardy-Weinberg)平衡。利用Popgene 3.2软件计算群体遗传分化指数(Fst)以及进行群体中各个微卫星位点的F-statistics分析。
2 结果 2.1 低温条件下2个群体生长性状统计凡纳滨对虾SP群体和HP群体在低温条件下体重及其他可测量性状的统计见表 2。从表 2可以看出，SP群体平均体重为(12.20±3.14) g，HP群体平均体重为(13.18±3.65) g，HP群体的平均体重要高于SP群体；SP群体和HP群体体重的变异系数(CV)分别为25.74%和27.69%。HP群体BL、FASW、TASW、FASL、FASH、CL和ASL的平均值均高于SP群体。生长性状单因素分析表明，2个群体BW和TASW存在极显著差异(P < 0.01)，但BL性状差异不显著(P > 0.05)，其他性状由于不符合方差齐性检验，因此，方差分析无意义(表 3)。
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表 2 凡纳滨对虾低温条件下生长性状及特定增长率和绝对增重率的统计 Table 2 The statistical description of growth traits, SGR and AGR of L. vannamei under low temperature conditions |
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表 3 HP群体和SP群体的生长性状、SGR及AGR的方差分析 Table 3 The ANOVA table of growth traits, SGR and AGR among HP and SP L. vannamei |
通过计算得到2个群体的SGR和AGR(表 2)。结果显示，在低温生长条件下，HP群体的SGR和AGR分别为(5.09±0.61) %/d和(0.26±0.60) g/d，SP群体的SGR和AGR分别为(4.94±0.57) %/d和(0.24± 0.63) g/d，HP群体的SGR和AGR均高于SP群体。对2个群体的SGR和AGR值进行ANOVA分析表明，2个群体的SGR和AGR值均存在极显著差异(P < 0.01)，HP群体相比SP群体有明显的生长优势。HP群体和SP群体的生长性状和SGR及AGR的方差分析见表 3。
2.3 2个群体遗传多样性的差异通过对3组多重PCR共13个微卫星位点进行遗传参数分析发现(表 4)，HP群体的Na略高于SP群体，二者分别为7.90和7.60。2个群体的Ho分别为0.492(HP)和0.483(SP)，He分别为0.675(HP)和0.663(SP)，HP群体的He和Ho均略高于SP群体。在2个群体中，13个微卫星位点只有位点TM6的略高于He，表现为杂合子过剩，其余位点Ho均低于He，表现为杂合子缺失。HP群体和SP群体的PIC分别为0.63和0.62，二者皆为高度多态(PIC≥0.5)，显示出13个微卫星位点拥有较丰富的多态性信息。对13个微卫星位点进行Hardy-Weinberg平衡检验，结果显示，13个位点在2个群体中只有2个位点偏离不显著(P > 0.05)，其余11个位点均极显著偏离(P < 0.01)。
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表 4 13个微卫星位点在2个凡纳滨对虾群体中的遗传参数信息 Table 4 The information of 13 loci of two populations of L. vannamei |
群体遗传分化指数(Fst)是衡量群体遗传分化程度的重要参数。Wright(1978)提出了衡量群体遗传分化的标准，即遗传分化指数Fst在0-0.05之间，表明种群遗传分化很弱；在0.05-0.15之间，表明种群遗传分化中等；介于0.15-0.25之间，则体现出很大的种群遗传分化；大于0.25，显示种群遗传分化极大。通过分析得到13个微卫星位点在2个凡纳滨对虾群体中的遗传分化情况(表 5)。各基因座的Fst平均值为0.1566，其中，有4个基因座的Fst处于群体间无遗传分化的范围内，有5个基因座处于中等遗传分化水平，其余4个基因座则显现出很高水平的遗传分化。
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表 5 13个微卫星位点在凡纳滨对虾2个群体中的F-分析 Table 5 F-test for two populations of L. vannamei at 13 microsatellite loci |
温度是影响水产动物生长性能的重要因素之一。凡纳滨对虾属于变温动物，其机体温度受环境温度影响比较大(张伟权, 1990)。然而，陈昌生等(2001)和唐啸尘(2003)的研究发现，凡纳滨对虾对小幅度的温度变化有一定的耐受性，这为凡纳滨对虾耐低温选育提供了可能性。
通过种群间或品系间杂交获得杂种优势，随后将优良性状通过近交或连续多代选择使其能够稳定地遗传，进而培育出新品系，这已经成为水产动物杂交育种的主要方式。杨章武等(2012)比较凡纳滨对虾自交群体与杂交群体的仔虾幼体在低温条件下的生长性能，发现杂交系子代的生长速度高于自交系15.5%，养成97 d时，杂交群体平均体重为(20.7±4.1) g，自交群体平均体重为(18.1±2.7) g，二者差异极显著。本研究选取体长为3 cm以上的凡纳滨对虾进行低温生长实验，以探究在凡纳滨对虾育成期HP与SP群体在低温条件下生长性能的差异，结果显示，HP群体平均体重为(13.18±3.65) g，极显著(P < 0.01) 高于SP群体的平均体重，HP群体的其他可测量性状如BL、FASW、TASW、FASL、FASH、CL和ASL的平均值也均高于SP群体。SGR和AGR表明在一定时间段内个体的生长情况(曹宝祥等，2015)。在本研究中，2个群体的SGR和AGR有极显著差异(P < 0.01)，HP群体的SGR和AGR分别为(5.09±0.61) %/d和(0.26±0.60) g/d，SP群体的SGR和AGR分别为(4.94±0.57) %/d和(0.24±0.63) g/d，显示HP群体相对于SP群体有着明显的生长优势。
张嘉晨等(2015)研究表明，杂种优势的产生主要是由于优良显性基因的互补作用和群体中杂合子频率的增大，从而抑制和减弱了不良基因的作用。如果通过杂交累积的是隐性有害基因，其杂交后代就有可能表现出杂交劣势。因此，对于杂交的亲本进行选择是十分重要的。本研究后续将会探究不同杂交组合产生的不同家系间在低温条件下的生长性能差异，从而可以更加深入地对凡纳滨对虾低温选育进行研究。
3.2 HP群体和SP群体遗传多样性的差异及遗传分化丰富的遗传多样性是培育优良性状品种的基础，而比较不同群体间遗传多样性的差异可以明确群体间遗传距离和遗传分化水平，对杂交选育亲本群体的选择有指导意义(刘晓慧等, 2008)。另外，在选育过程中，选育群体更容易由于不合理的管理导致发生瓶颈效应和近交衰退而加速种质的同质化，造成等位基因丢失的现象(崔朝霞等, 2011)，所以要保持选育群体较高的遗传多样性则有必要对群体进行遗传多样性的监测。王霞等(2009)利用7个微卫星位点对凡纳滨对虾育种过程中G0代与G1代的遗传多样性进行比较，得到G0代群体He显著高于G1代，表明封闭群体在经过一代人工选择后其遗传多样性会下降。Cruz等(2004)在利用微卫星标记监测凡纳滨对虾育种进程时发现，从G1代到G2代有明显的等位基因缺失，表明在育种进程中，随着选择强度的加大，一些稀有等位基因会不可避免的缺失，而引进外源亲本可以显著提高群体遗传多样性。本研究利用13个多态性微卫星位点，分析凡纳滨对虾HP群体和SP群体间遗传多样性的差异，结果显示，HP群体的Na=7.9略高于SP群体(Na=7.6)，2个群体的Ho分别为0.492(HP群体)和0.483(SP群体)，He分别为0.675(HP群体)和0.663(SP群体)，HP群体的He和Ho均略高于SP群体，表现出HP群体相比SP群体有着更加丰富的遗传多样性，这恰好佐证了Cruz等(2004)的研究结果，并且在其他物种如栉孔扇贝(Chlamys farreri)与虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)群体的杂交子代群体中也出现遗传多样性升高的现象(于涛等, 2011)，表明杂交可以增加基因的杂合度，不仅获得杂种优势，还可以丰富群体遗传多样性，更加有利于良种选育。
在本研究中，除位点TM6以外，其余位点Ho均低于He，表现为杂合子的缺失。杂合子的缺失可能由于无效基因或者研究样本范围大小等方面因素导致稀有碱基的丢失所致，还可能是由于选择性交配、种群混合和瓶颈效应等引起(Wanna et al, 2004; Cannas et al, 2012)。本研究所建立的2个群体，共75个家系并不是随机交配产生的，而是按照一定配种方案选择性交配的；其次，每个家系只随机选取10-20个个体，故每个家系取样量较少，所以极有可能造成杂合子缺失的现象。另外，本研究中，13个微卫星位点中有11个极显著偏离Hardy-Weinberg平衡，这与Supungul等(2002)和张凯(2012)1)等的研究结果相似。Hardy-Weinberg平衡的偏离很可能是由于当研究对象为相对小的群体或者封闭群体时，长期人工选育后产生基因的遗传漂变或混杂现象所引起的(Zhang et al, 2012)。在本研究中，选育群体是经过连续3年人工选育的群体，所以极有可能在选育过程中一些与选育性状无关的等位基因被排除，造成基因频率变化，从而导致Hardy-Weinberg平衡的偏离。
1) Zhang K. Molecular pedigree reconstruction of pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) and effect assessment of release enhancement of Chinese shrimp (Fenneropenaeus chinensis) by using SSR markers. Master's Thesis of Ocean University of China, 2013, 32-34 [张凯.凡纳滨对虾引进群体分子系谱构建及中国对虾分子标志家系放流效果评估.中国海洋大学硕士研究生学位论文, 2013, 32-34]
遗传分化指数即指不同群体间或同一群体不同个体间的遗传变异占总遗传变异的大小(包秀凤, 2014)2)。在本研究中，各微卫星位点的遗传分化指数介于0.0025-0.6585之间，选育群体与杂交群体间遗传分化指数为0.1556，有着显著遗传分化水平，这恰好体现出杂交组合的遗传多样性和遗传分化特点，即不同来源的群体杂交使得等位基因重组，增加了遗传变异，构成了杂种优势的遗传学基础。
2) Bao XF. Analysis of genetic diversity of selected stocks of Litopenaeus vannamei. Master's Thesis of Guangdong Ocean University, 2014, 48-50 [包秀凤.凡纳滨对虾选育群体遗传多样性分析.广东海洋大学硕士研究生学位论文, 2014, 48-50]
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