2. 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 深圳 518045;
3. 深圳市检验检疫科学研究院 深圳 518001
2. Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center, Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen 518045;
3. Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine Sciences, Shenzhen 518001
鲤疱疹病毒2型也称为金鱼造血器官坏死病病毒(Goldfish haematopoietic necrosis virus, GFHNV)，因该病原是第2个自鲤科鱼类分离的疱疹病毒，按照国际病毒分类委员会(ICTV)的系统命名规则，正式命名为鲤疱疹病毒 2 型(Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)。该病毒属于疱疹病毒目(Herpesvirales)、疱疹病毒科(Alloherpesviridae)、鲤疱疹病毒属(Cyprinivirus)，该属还包括鲤疱疹病毒1型(CyHV-1)、鲤疱疹病毒3型(CyHV-3)和鳗鲡疱疹病毒1型(Anguillid herpesvirus 1，AngHV-1)。CyHV-2对金鱼(Carassius arratus)和鲫鱼(Carassius aumtus)养殖业危害巨大，主要发生在春、秋季节，发病率受水温影响较大，15-25℃时易发病，水温高于25℃时，发病率降低(Groff et al, 1998)。1992年，日本首次报道金鱼暴发该病，死亡率接近100% (Jung et al, 1995)。随后，在美国(Groff et al, 1998; Goodwin et al, 2006a)、澳大利亚 (Stephens et al, 2004)、英国(Jeffery et al, 2007)、匈牙利(Doszpoly et al, 2011)和我国台湾(Chang et al, 1999)均有相关报道。最近，在法国也有该病的相关报道(Boitard et al, 2015)。随着观赏鱼国际贸易全球化，该病毒在全球范围内流行的风险增高。
实时荧光定量PCR方法(Quantitative real-time PCR, qPCR)因其操作简便、灵敏性高、特异性强和快速高效等优点已得到广泛应用。但qPCR在定量时需依赖于标准曲线，而标准曲线的质量易受到引物和探针浓度、DNA纯度以及标准品等因素的影响，导致其精确性达不到绝对定量的要求(Cankar et al, 2006)。另外，qPCR易受反应抑制因子的影响而导致假阴性，从而干扰结果判断。
微滴式数字PCR方法(Droplet digital PCR，ddPCR)是近年发展起来的快速、准确、可实现绝对定量的新技术。与传统qPCR方法不同，它不依赖于标准曲线，因而定量结果更精确(Hayden et al, 2013)。ddPCR方法基于将样品系列稀释到一定浓度后，使其分布在一定数目的微滴中，从而使大部分微滴中的模板数为1或0，然后，以每个微滴为一个独立单位进行PCR扩增。在扩增结束后，对每个微滴中的荧光信号进行读取。根据泊松概率分布函数(Poisson distribution)计算出样品中的DNA拷贝数(Pinheiro et al, 2013)。该方法采用终点检测，不依赖Cq值，从而使ddPCR反应受扩增效率的影响大大降低，同时也提高了对反应抑制因子的耐受能力，提高了方法的准确性和重复性(Zimmermann et al, 2013; Pinheiro et al, 2013)。本研究旨在建立特异、准确、灵敏的CyHV-2 ddPCR定量检测方法，并与传统qPCR进行比较，以期为CyHV-2定量检测提供新方法和借鉴。
1 材料与方法 1.1 病毒临床样品共30份，包括23份患病鲫鱼样品和7份健康鲫鱼样品均采自江苏省各地区；CyHV-3(Koi herpesvirus)DNA由中山大学提供；斑点叉尾鮰病毒(Channel catfish virus, CCV)购自ATCC公司；流行性造血器官坏死病毒(Epizootic hematopoietic necrosis virus, EHNV)由悉尼大学OIE蛙病毒参考实验室提供；中华鳖虹彩病毒(Soft-shelled turtle iridovirus, STIV)由本实验室保存。
1.2 DNA的提取使用Dneasy Blood Tissue Kit(Qiagen，美国)抽提CyHV-2阳性样品、临床样品、CCV、EHNV、STIV的DNA，具体步骤详见试剂盒说明书。再用ddH2O对所抽提的CyHV-2阳性样品DNA进行20倍系列稀释，共7个稀释度，用于本实验方法灵敏性和重复性评价。
1.3 标准质粒的制备与稀释采用Goodwin等(2006b)设计的上下游引物进行普通PCR反应，扩增出170 bp产物，使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit对此PCR产物进行纯化，再连接到pMDTM18-T载体中，构建标准质粒。标准质粒的浓度使用分光光度计测定。标准质粒浓度计算公式如下：
质粒拷贝数(copies/μl)=6.02×1023(copies/mol)×质粒浓度(g/μl)/质粒分子量(g/mol)
本研究标准质粒浓度为2.3×1011 copies/μl。用ddH2O将标准质粒进行10倍系列稀释，共8个稀释度(2.3×108-2.3×101 copies/μl)，以此构建qPCR标准曲线。
1.4 引物和探针 1.4.1 qPCR反应体系和条件本研究中，qPCR方法所引用为Goodwin等(2006b)中的引物。Goodwin等(2006b)在设计该引物时选取CyHV-2 DNA聚合酶基因的保守区域，该基因是病毒保守基因(李莉娟等，2013)。其中，上游引物序列为5'-TCGGTTGGACTCGGTTTGTG-3'，Taqman探针序列为5'-FAM-CCGCTTCCAGTCTGGGCCACTACC-BHQ1-3'，下游引物序列为5'-CTCGGTCTTGATGCGTTTCTTG-3' (Goodwin et al, 2006b)。qPCR总反应体系为20 μl，其中，10 μl 2× QuantiNovaTM (QN) Probe PCR Master Mix，上下游引物(900 nmol/L)各0.9 μl，探针(250 nmol/L) 0.5 μl。qPCR反应条件为95℃，2 min；95℃ 10 s，58℃ 45 s，共40个循环，是基于Goodwin等(2006b)方法和试剂盒推荐的温度，并且经过实验室优化确认的反应条件。每个样品设定3个重复。扩增结束后，使用7500 System Software软件分析实验数据。
1.4.2 ddPCR反应体系和条件优化使用QX100TM型微滴式数字PCR系统(Bio-Rad，美国) (包括微滴发生板、微滴发生器、PCR仪、微滴分析仪)进行实验。ddPCR实验步骤包括配制体系、生成微滴、扩增循环和信号读取(Hindson et al, 2013)。ddPCR使用的引物和探针与qPCR相同。ddPCR总反应体系为20 μl，其中，10 μl 2×ddPCR SupermixTM for Probes (Bio-Rad，美国)，上下游引物(900 nmol/L)各0.9 μl、探针(250 nmol/L) 0.5 μl，DNA模板2.5 μl。微滴生成使用配套的微滴生成卡(Bio-Rad，美国)和微滴生成仪(Bio-Rad，美国)，将20 μl PCR体系和70 μl微滴生成油(Droplet generation oil)分别加入微滴生成卡，覆盖专用胶垫后置入微滴生成仪，将生成的微滴转移至96孔板中，并置于PCR仪(Bio-Rad，美国)进行扩增，扩增程序如下：95℃ 10 min；95℃ 10 s，58℃ 60 s，共40个循环；扩增结束后，98℃热失活10 min。每个模板设置3个重复。扩增结束后，将96孔板放入微滴读取仪中读取信号，并使用QuantaSoft软件(Bio-Rad，美国)分析数据。
为了优化ddPCR反应条件，使用温度梯度PCR仪(Bio-Rad，美国)，设置反应温度梯度为65.0℃、63.8℃、62.0℃、59.1℃、55.7℃、52.9℃、51.0℃、50.0℃，对退火温度进行优化。其他步骤同ddPCR反应过程，最后使用QuantaSoft软件分析实验数据，选取最佳退火温度。
2 结果 2.1 qPCR方法标准曲线的建立将标准质粒的8个稀释度作为模板进行qPCR反应，以此构建了标准曲线(图 1)。构建的标准曲线为: y = 0.741x + 1.0454，线性相关系数为R2=0.994，qPCR扩增效率E=134%。根据该标准曲线，根据未知样品的Ct值即可计算样品中的CyHV-2起始拷贝数。
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图 1 ddPCR和qPCR方法对系列稀释CyHV-2 DNA的定量 Figure 1 Quantification of serially diluted CyHV-2 DNA standard by ddPCR and qPCR |
ddPCR方法检测结果见图 2和表 1。从图 2和表 1可以看出，ddPCR反应中，微滴生成仪生成的油滴数大于10000，油滴数能够满足实验要求，保证了模板DNA分子的分布符合泊松概率分布函数。空白对照中没有检测到阳性微滴，表明该体系没有污染或非特异性扩增。
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图 2 ddPCR方法扩增CyHV-2 DNA的一维散点 Figure 2 One-dimensional scatter plot of selected wells/ CyHV-2 DNA fluorescent droplet amplified by ddPCR |
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表 1 ddPCR和qPCR的灵敏性实验 Table 1 Sensitivity test of the ddPCR and qPCR assays |
对ddPCR反应的退火温度进行了优化筛选。结果表明，在 50.0-59.1℃之间，随着温度的升高，荧光强度的信号逐渐增强，阳性微滴和阴性微滴界限逐渐明显，中间弥散的微滴数减少。当温度由59.1℃依次升高到65℃时，阳性微滴总数和阴性微滴总数趋于稳定，但二者中间弥散的微滴数逐渐变多(图 3)。因而，本研究最终将ddPCR定量检测CyHV-2 DNA的最佳退火温度确定为59.1℃。
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图 3 ddPCR反应温度优化 Figure 3 Optimization of reaction temperature in ddPCR |
以临床样品中抽提的CyHV-2 DNA (1.25×104- 0.2×10-3 copies/μl)为模板，评价ddPCR方法的灵敏性。ddPCR检测CyHV-2 DNA下限为1.6 copies/μl，而qPCR检测CyHV-2的DNA下限为0.08 copies/μl (表 1)。由此可见，ddPCR检测CyHV-2 DNA的灵敏性比qPCR低20倍。ddPCR和qPCR方法间的定量值呈正相关(R2=0.989) (图 4)，但在定量检测相同稀释度的CyHV-2 DNA时，qPCR方法的定量值始终比ddPCR方法高10倍(表 1)。ddPCR方法的线性相关系数为R=0.994，qPCR方法的线性相关系数为R2 = 0.994，表明2种方法的线性关系良好(图 1)。
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图 4 测定CyHV-2 DNA时ddPCR方法和qPCR方法之间的线性相关性 Figure 4 Correlation between measured CyHV-2 numbers of CyHV-2 DNA standard using ddPCR and qPCR |
通过组内重复实验和组间重复实验比较分析qPCR和ddPCR方法的重复性，结合定量结果的变异系数(Coefficients of variation, CV)对方法的准确性进行判定。组内重复实验中，同一次实验中的4个CyHV- 2 DNA稀释度作为模板进行ddPCR和qPCR实验，每个样品3个重复。结果显示，ddPCR定量检测中CV最小值为0.59%，最大值为11.26%；qPCR的CV最小值为16.57%，最大值为27.56% (表 1)。在组间重复实验时，用上述同样的模板，以相同的qPCR和ddPCR反应条件分不同时间进行3次组间重复实验，ddPCR定量检测的CV范围为6.55%-23.21%；qPCR检测的CV范围为22.31%-56.73% (表 2)。结果表明，ddPCR方法具有更好的重复性。
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表 2 ddPCR和qPCR组间重复实验 Table 2 Replicate of the intra-assay using ddPCR and qPCR |
采用CyHV-3、CCV、EHNV和STIV共4种水生DNA病毒，和CyHV-2比较验证ddPCR和qPCR的特异性。结果表明，这2种方法均能检出CyHV-2。其他4种病毒和空白对照的检测结果均为阴性(表 3)，表明所建立的ddPCR方法与qPCR方法检测结果一致，具有相同的特异性。
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表 3 ddPCR和qPCR的特异性实验 Table 3 Specificity of the ddPCR and qPCR assays |
运用ddPCR和qPCR对江苏省各地区采集的23份患病鲫鱼样品和7份无症状的鲫鱼样品进行定量检测，每份样品3个重复。检测结果用阳性检出率(Positive percentage，即检测呈阳性的样品在总样品中所占的比例)分析2种方法检测结果的差异性。结果显示，23份患病鲫鱼样品经ddPCR检测均为阳性。而qPCR检出22份阳性，1份阴性。2种方法均未从7份健康鲫鱼样品中检测到CyHV-2核酸。因此，ddPCR方法的阳性检出率为76.67%，qPCR方法的阳性检出率为73.33%，表明ddPCR方法在CyHV-2定量检测中具有一定实际应用优势。
3 讨论定量检测是病毒致病机理研究、病毒载量测定及免疫基因表达等的重要手段。qPCR作为一种定量检测技术已经被应用于上述领域(安伟等, 2015; 王瑞等, 2015; 陈雪峰等, 2015)。ddPCR作为一种新兴的定量技术，将模板随机分布于20000个微滴中，每个含有模板的微滴均是一个独立的PCR反应体系，实现了不依赖标准曲线而对目标样本的绝对定量，同时也使体系受反应抑制因子的影响大大降低(Hindson et al, 2013)。目前，已经有一些研究报道了定量检测CyHV-2的qPCR方法(Goodwin et al, 2006b; 周勇等, 2013; 徐晔等, 2014; 于力等, 2015)，但qPCR方法因其定量结果依赖于标准曲线，以及PCR反应体系中引物与模板、探针与模板之间错配对结果精确性的影响(Strain et al, 2013)，方法的应用受到一定限制(Purcell et al, 2013)。
本研究建立了一种定量检测CyHV-2 的ddPCR方法，同时，利用ddPCR和qPCR这2种检测方法对CyHV-2 DNA进行测定，就灵敏性、重复性、特异性和临床样品检测4个方面做了比较。在定量检测相同稀释度CyHV-2 DNA时，ddPCR与qPCR的定量值呈线性正相关，但qPCR方法的定量值始终比ddPCR方法高10倍，推断可能是由于用于qPCR方法的标准质粒起始浓度被高估。因为标准质粒溶液中存在的其他DNA、RAN或蛋白会影响分光光度计测定值的准确性，导致标准质粒浓度测定值偏大或偏小(Jones et al, 2014)。在定量不同稀释度CyHV-2 DNA时，ddPCR方法的灵敏性比qPCR方法低20倍。然而，在实际应用过程中，ddPCR方法的检出率却高于qPCR方法。分析其原因可能与qPCR Cq值的有效性判定有关。qPCR能够检测到更低稀释度的CyHV-2 DNA (0.8×10-1copies/μl)，但Cq值＞35。根据qPCR方法的定量原理，Cq值与起始模板浓度的对数呈线性关系，在分析qPCR方法定量结果时通常认为，Cq值在15-35为可信，太大或太小都会导致定量结果不准确(Schmittgen et al, 2008)。因此，根据2种方法在定量检测CyHV-2 DNA的灵敏性和临床样品的检出率结果，ddPCR和qPCR方法的灵敏性相当。
本研究在进行方法特异性分析时，由于资源限制，使用病毒种类有限，没有使用CyHV-1进行验证。但这对ddPCR方法应用于临床样品CyHV-2的定量检测影响不大。原因是ddPCR使用的引物和探针与qPCR相同(Goodwin et al, 2006b)，Goodwin等(2006b)在进行qPCR特异性分析时，已经确认了其对CyHV-1没有非特异性扩增。另外，CyHV-2主要感染金鱼和鲫鱼，而CyHV-1主要感染鲤鱼，在分析结果时应注意结合样品种属，有助于避免CyHV-1非特异性检出的分析。因此，在检测金鱼和鲫鱼的临床样品时，ddPCR受到CyHV-1干扰有限。本研究建立了一种快速、准确、灵敏的定量检测CyHV-2的ddPCR方法，能够很好地应用于CyHV-2定量分析，对CyHV-2致病机理和组织定量检测等具有参考价值。
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