Notch途径是一条进化上十分保守的信号通路，通过受体Notch与配体DSL蛋白的相互作用转导信号，从而调控细胞增殖、分化、凋亡并决定细胞的命运(Lai, 2004; 梁洁等, 2008)。作为Notch信号途径的重要起始蛋白，Notch基因最初在研究果蝇(Drosophila melanogaster)胚胎发育过程中被识别，它的突变导致果蝇翅膀边缘出现缺口，因此被命名为Notch (Mohr, 1919、1922)。随后，果蝇的Notch基因被克隆出来(Allman et al, 2002)。目前，已有Notch的同源蛋白从线虫(Caenorhabditis elegans)、爪蟾(Xenopus laevis)、斑马鱼(Barchydanio rerio var)、鸡(Gallus gallus)、小鼠(Mus musculus)和人(Homo sapiens)等生物中被分离出来(齐润姿等, 2002; Anant et al, 1998)。研究表明，从低等动物到高等动物，Notch基因家族在结构上都具有高度的保守性，均是单链跨膜蛋白，由胞外区、跨膜区和胞内区组成，胞外区均具有多个EGF-like重复结构域、3个NL结构域及1个NOD结构域和1个NODP结构域，而胞内区都具有6个ANK结构域和2个核定位信号(NSL)(李宝园等, 2009; Kortschak et al, 2001; Maine et al, 1995)。在功能上，Notch家族成员也具有高度的相似性，Notch不但参与了骨骼、神经和体节形成等多个发育过程(Zanotti et al, 2010; de Oliveira-Carlos et al, 2013; Artavanis-Tsakonas et al, 1999)，而且还调控个体胚胎发育过程中胚层细胞的增殖、分化和凋亡(Coffman et al, 1993; Conboy et al, 1995; Fortini et al, 1993)，影响器官形成和形态发生等(郭政等, 2008; 鲁茁壮等, 2004)。

Notch信号途径在高等动物中已经被广泛研究，但在刺胞动物(Cnidaria)中的研究很少，仅在水螅和海葵(Nematostella vectensis)中有相关报道(Bottger et al, 2002; Kasbauer et al, 2007; Marlow et al, 2012)。刺胞动物作为最原始的真后生动物，只有外胚层和内胚层的分化，是其他高等多细胞动物的起点(周春娅等, 2013)。因此，研究刺胞动物Notch信号途径，解析Notch基因的分子结构和不同发育过程的表达特点，将为了解Notch信号途径的起源和功能演化等研究提供重要参考。

海蜇(Rhopilema esculentum)隶属于刺胞动物门、钵水母纲、根口水母目、海蜇属，其人工繁育和增养殖技术成熟，是研究刺胞动物无性繁殖调控途径的理想模式生物。本研究基于转录组454 GS FLX测序结果，利用RACE和RT-PCR技术，克隆了海蜇Notch基因的cDNA全长，并分析了其mRNA在海蜇无性繁殖不同发育阶段的表达差异，这些研究结果将为进一步研究Notch信号通路在海蜇无性繁殖中的调控作用奠定了基础。

野生性成熟海蜇于2015年9月采于浙江杭州湾，运回山东荣成海蜇养殖场进行人工繁育，以获取海蜇螅状体(Scyphistoma)、横裂体(Strobila)、碟状体(Ephyra)和幼蛰样品。

海蜇转录组文库构建、454 GS FLX测序见周春娅等(2013)方法。利用生物信息学方法检索海蜇转录组文库，寻找与已知Notch基因同源的EST序列。

Blast分析表明，海蜇EST_{(isotig11938)}与海葵Notch基因具有高度的相似性，进一步分析发现，这段序列具有Notch基因特有的3个NL结构域、1个NOD结构域和1个NODP结构域。根据EST_{(isotig11938)}序列，设计特异性引物扩增海蜇Notch基因cDNA全长(表 1)。Notch基因的3´末端利用pBluescript SK(+/-)载体上的通用引物T7与特异性引物Notch-F2扩增；Notch基因的5´末端用载体通用引物T3与特异性引物Notch-R2扩增。25 ml的PCR反应体系：2.5 ml 10×PCR Buffer，2 ml dNTP (25 mmol/L)，1.5 ml MgCl₂ (25 mmol/L)，1 ml引物(10 mmol/L)，0.2 ml (1U)Taq酶，1 ml cDNA模板，15.8 ml PCR水。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离检测，切胶回收后连接到pMD18-T (TaKaRa)载体，然后转化至大肠杆菌感受态细胞Top10中，通过蓝白斑筛选阳性克隆并送到上海英潍捷基测序。

表 1(Tab. 1)

表 1 本研究所用引物序列 Table 1 Primer sequences used in the study 引物名称Primername 序列Sequence(5´–3´) 作用Application Notch-F1 ACCAGAGTCACAGAAAAGCCC Real-timePCR Notch-R1 CACATCCCTGGGTGTTTGCT Real-timePCR Actin-F AACTGGGACGATATGGAGAAGA Real-timePCR Actin-R CGACCAGAGGCGTACAATGAG Real-timePCR Notch-F2 TGGATACAGTTGGACAAGATGATAAT 3´Race-PCR Notch-R2 ATTTTGAGTATGGACCCTGTAGAGA 5´Race-PCR T7 GTAATACGACTCACTATAGGGC 3´Race-PCR T3 AATTAACCCTCACTAAAGGG 5´Race-PCR

表 1 本研究所用引物序列 Table 1 Primer sequences used in the study

用Bioedit软件对所获得的测序结果序列进行全长拼接；用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)和蛋白分析系统(http://www.expasy.org/)分析海蜇Notch的cDNA和氨基酸序列。用SMART(http://smart.emblheidelberg.de/)及SingalP 4.1信号肽预测软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对海蜇Notch进行蛋白结构域分析及信号肽预测。利用ClustalX1.83将海蜇Notch与其他物种Notch氨基酸序列进行多序列比对。根据多序列比对结果，用MEGA5.0软件采用邻接法(Neighbor-joining)构建Notch的系统进化树。

利用Trizol法分别提取海蜇4个不同发育阶段：螅状体、横裂体、碟状体、水母体(Medusa)的总RNA，每个发育时期15个个体为1组，每组设3个重复。然后分别反转录合成cDNA，反应体系及反应条件按说明书要求操作(Invitrogen)。

PCR反应在ABI 7500 Real-time PCR system (Applied Biosystems)上进行，20 μl反应体系：10 μl SYBR^® Premix Ex Taq™Ⅱ，0.4 μl ROX Reference DyeⅡ，0.4 μl特异性引物(Notch-F1和Notch-R1见表 1)，2 μl cDNA模板。PCR反应程序如下：95℃预变性30 s，95℃ 5 s、60℃ 34 s，共40个循环。样品和内参分别设3个重复。采用β-actin基因作为实时定量PCR的内参基因。反应结束后的分解步骤(95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s)用于绘制熔解曲线，确认Notch基因引物的特异性，采用2^-DDCt法进行数据分析。获得的数据采用SPSS 18.0统计软件进行处理，各组间平均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著。

将3´-RACE和5´-RACE获得的序列与EST_{(isotig11938)}序列进行拼接，获得海蜇Notch基因的cDNA全长序列。海蜇Notch基因的cDNA全长为6768 bp，包括5´非翻译区(5´-UTR) 90 bp，包含1个多腺苷酸Poly(A)尾和AATAAA加尾信号，3´非翻译区(3´-UTR) 612 bp，开放阅读框(Open reading frame, ORF) 6066 bp编码了2021个氨基酸。预测其蛋白分子量和理论等电点分别为218.92 kDa和6.24。

通过SignalP、SMART、PredictProtein 2013和NetNGlyc 1.0 Server等软件分析海蜇Notch的氨基酸序列显示，Notch为分泌蛋白，信号肽由21个氨基酸组成(图 1)，酶切后成熟肽的分子量和理论等电点分别为216.55 kDa和6.25。在成熟肽中共有37个结构域(图 2)，包括26个表皮生长因子样(EGF-like)重复结构域、3个富含半胱氨酸的Notch/Lin-12(NL)结构域、1个跨膜结构域、1个NOD结构域、1个NODP结构域和6个锚蛋白ANK结构域，还含有25个潜在的N-糖基化位点，其中，NL、NOD和NODP结构域是Notch家族的特有结构域。

图 1(Fig. 1)

图 1 海蜇Notch全长cDNA序列及推导的氨基酸序列 Figure 1 Full-length Notch cDNA of R. esculentum and its deduced amino acid sequences 粗体为信号肽；箭头为酶切位点；灰色阴影为Notch结构域EGF-like；双下划线为结构域EGF-CA；下划波浪线为结构域NL；下划点状线为结构域Pfam:NOD；下划为结构域Pfam:NODP；粗体并双下划线为跨膜结构域；下划实线为结构域ANK；方框为多聚腺苷酸加尾信号；*为终止密码子 Black bold indicated signal peptied; Arrow indicated cleavage sites; EGF was printed with grey background; EGF-CA was lined with double underline; NL was underlined with wavy line; Pfam: NODP was underlined with long point line; Pfam: NOD was underlined with dotted line; Transmembrane domain was black bold and underlined with double underline; ANK was under lined with single underline; Poly (A) signals was surrounded by box; The pentagrams indicated stop codon

图 1(Fig. 1)

图 2 预测的海蜇Notch主要结构域 Figure 2 Predicted Notch domains of R.esculentum

多序列比对结果显示(表 2)，在全序列上，海蜇Notch与来自刺胞动物门的海葵(AEW42991) Notch氨基酸全序列相似性为39%，与佛罗里达弓背蚁(Camponotus floridanus)、意大利蜜蜂(Apis mellifera)、蝇蛹金小蜂(Nasonia vitripennis)、囊舌虫(Saccoglossus kowalevskii)等无脊椎动物的氨基酸相似度为35%–37%，而与哺乳动物、两栖动物、鱼类等脊椎动物的氨基酸相似性为34%–38%。NL、NOD和NODP结构域是Notch家族特有的结构，对这3个结构域多序列比对结果显示，海蜇Notch的NL、NOD和NODP结构域与刺胞动物、无脊椎动物、脊椎动物的氨基酸相似性分别为48%、40%–46%、42%–47%；25%、25%–28%、23%–30%；37%、22%–31%、27%–31%(图 3)。

表 2(Tab. 2)

表 2 海蜇Notch与其他物种的Notch的氨基酸序列一致性 Table 2 Comparison of Notch amino acid identity between R. esculentum Notch and vertebrates/invertebrates GenBank注册号 GenBank Accession 拉丁学名 No. Latin name 中文名 Chinese name 氨基酸序列的一致性 Identity of amino acid sequence (%) NP060087 H. sapiens 人 36 EHH23670 Macaca mulatta 猕猴 36 NP001099191 Rattus norvegicu 褐家鼠 34 EGW12778 Cricetulus griseus 中国仓鼠 34 NP032740 M. musculus 小鼠 34 XP004285023 Orcinus orca 虎鲸 38 XP00562549 Canis lupus familiaris 家犬 37 NP001099191 Erinaceus.europaeus 刺猬 36 NP001025466 G. Gallus 原鸡 38 XP005529261 Pseudopodoces humilis 地山雀 38 NP001090757 X. tropicalis 非洲爪蟾 38 BAC41349 Cynops pyrrhogaster 红腹蝾螈 35 XP008274642 Stegastes partitus 深裂眶锯雀鲷 35 XP008334545 Cynoglossus.semilaevis 半滑舌鳎 37 CDQ87512 O. mykiss 虹鳟鱼 38 XP007253900 Astyanax mexicanus 墨西哥脂鲤 38 XP006640602 Lepisosteus oculatus 眼斑雀鳝 38 XP011267598 C. floridanus 佛罗里达弓背蚁 37 XP006568052 A. mellifera 意大利蜜蜂 36 XP008204188 N. vitripennis 蝇蛹金小蜂 35 XP006818779 S. kowalevskii 囊舌虫 35 AEW42991 N. vectensis 海葵 39

表 2 海蜇Notch与其他物种的Notch的氨基酸序列一致性 Table 2 Comparison of Notch amino acid identity between R. esculentum Notch and vertebrates/invertebrates

图 1(Fig. 1)

图 3 海蜇与其他物种Notch NOD结构域的氨基酸多序列比对 Figure 3 Multiple sequence alignment NOD domain of Notch of R. esculentum and other species

对海蜇Notch基因的3个NL结构域进行多序列比对表明，不同物种之间其氨基酸序列保守性很强，且每个NL结构域含有6个半胱氨酸(图 4)。而NOD和NODP 2个结构域的多序列比对表明，海蜇NOD结构域在甘氨酸(Gly)、苯丙氨酸(Phe)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、苏氨酸(Thr) 5个氨基酸位点保持一致(图 3)，NODP结构域在天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、2个半胱氨酸(Cys)、苯丙氨酸(Phe)、丙氨酸(Ala)、丙氨酸(Ala) 7个氨基酸位点也保持一致(图 5)。

图 1(Fig. 1)

图 4 海蜇与其他物种Notch NL结构域的氨基酸多序列比对 Figure 4 Multiple sequence alignment NL domain of Notch of R. esculentum and other species

图 1(Fig. 1)

图 5 海蜇与其他物种Notch NODP结构域的氨基酸多序列比对 Figure 5 Multiple sequence alignment NODP domain of Notch of R. esculentum and other species 黑色为相同氨基酸；灰色为相似氨基酸；黑色圆点为NL结构域完全一致的半胱氨酸；*为NOD和NODP结构域完全一致氨基酸 Black background indicated the same amino acid; Gray background indicated similar amino acids, the black dots showed the identical cysteine; The pentagrams showed the same amino acid of NOD and NODP

采用邻接法构建Notch的系统进化树(图 6)显示，海蜇与来自刺胞动物门海葵的Notch亲缘关系最近，聚为一支，而佛罗里达弓背蚁、意大利蜜蜂、蝇蛹金小蜂、囊舌虫等非脊椎动物聚为一支，人、原鸡、虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)等众多脊椎动物又聚为一支。

图 1(Fig. 1)

图 6 基于邻接法的Notch氨基酸序列的系统进化树 Figure 6 Phylogenetic tree of Notch based on neighbor-joining method

利用RT-PCR技术分析了Notch基因在海蜇螅状体、横裂体、蝶状体、水母体4个不同发育时期的表达差异。结果显示，该基因在海蜇无性繁殖4个发育时期均有表达，螅状体阶段Notch的表达量最高，然后是水母体和碟状体(图 7)，这3个发育阶段的表达量分别是是横裂体阶段表达量的1.85、1.60、1.33倍，而横裂体阶段Notch的表达量最低。

图 1(Fig. 1)

图 7 Notch基因在海蜇不同发育阶段的表达 Figure 7 Expression of Notch mRNA at different developmental stages of R. esculentum

本研究基于转录组454 GS FLX测序和EST序列分析，利用RACE和RT-PCR技术，解析了海蜇Notch基因结构，发现海蜇Notch基因与其他物种的Notch基因一样都为分泌蛋白，并具有Notch家族特有的NOD、NODP结构域和3个NL结构域，此外，还包括EGF-like结构域、ANK重复结构域和跨膜结

构域(周庆军等, 2004)。Blast分析表明(表 2)，不管是全序列还是Notch基因特有结构域相似性分析，海蜇Notch基因与刺胞动物、无脊椎动物和脊椎动物都具有较高的同源性。系统进化树分析也显示，海蜇与来自刺胞动物门海葵的Notch聚为一支，而来自无脊椎动物和脊椎动物的Notch基因分别聚为2个分支，说明Notch基因符合生物进化规律，按照从低等动物到高等动物分别聚类。

Notch广泛存在于各种生物中，是一种单次跨膜蛋白，均由胞外区(NEC)、跨膜区(TM)和胞内区(NICD)3大部分组成(付亚娟等, 2007)。典型的Notch结构域胞外区包括36个的EGF-like结构域、3个NL结构域、NOD和NODP结构域，胞内区主要包括6个ANK结构域以及ANK两侧的2个核定位信号(NSL)(Hori et al, 1997)。研究表明，不同物种之间EGF-like结构域数量为10-36不等，差别明显。在脊椎动物和双翅目动物的Notch基因中EGF-like结构域一般为36个，而在无脊椎动物中，EGF-like结构域数量普遍少于36个，比如蝇蛹金小蜂中有31个(Kortschak et al, 2001)，而在本研究中，海蜇Notch的EGF-like结构域数量更少，只有26个，其原因可能是低等动物Notch基因在进化过程中为了适应环境对EGF-like结构域进行了必要的删除，类似的现象也出现在海鞘(Pyrosomella verticilliata) Notch基因的研究中(Hori et al, 1997)。富含Cys的NL(Notch/Lin-12) 结构域是所有Notch基因特有结构域之一。海蜇

Notch基因与其他物种的Notch一样也含有3个NL结构域，每个结构域都由40个左右的氨基酸组成，并含有6个可以形成3对高度保守的二硫键的Cys。多序列比对也发现，从刺胞动物到哺乳动物，NL结构域的氨基酸序列相似性高达48%–83%。这种高度的序列相似性和结构的保守性表明，从低等动物到高等动物，NL结构域的功能相似，都是通过与配体特异性结合、启动Notch蛋白发挥作用(Kortschak et al, 2001; 李文等, 2014)。

无性繁殖是刺胞动物重要的繁殖方式，其调控途径和分子机制的研究已经逐步开展(Trevino et al, 2011)。出芽生殖是水螅的无性繁殖方式之一，Philipp等(2009)研究表明，Wnt信号途径可以启动并调控出芽生殖过程。在水螅的出芽生殖中，Wnt5、Wnt8、Frizzled 2和Dsh基因的表达被局限于水螅出芽部位和触手上，并随着芽体的增长，这些基因的表达量逐步升高。而横裂生殖是海蜇无性繁殖的主要方式，即螅状体经过分节和变态2个紧密联系的发育阶段产生稚水母的过程(周春娅等, 2013)。本实验室的前期研究也表明，Wnt信号途径的几个关键节点基因家族，包括Wnt基因家族、Frizzled基因家族等都参与调控了海蜇的无性繁殖过程。这些基因被局限表达海蜇触手和横裂生殖的分节部位，并且无性繁殖过程中，横裂体阶段的表达量显著高于螅状体、碟状体及其水母体阶段(周春娅等, 2013)。而在本研究中，Notch基因在海蜇无性繁殖过程的表达模式与Wnt等基因正好相反。虽然，Notch基因在海蜇无性繁殖4个发育阶段均有表达，但横裂体表达量最低，而螅状体表达量最高，并随着横裂结束表达量逐步升高，这一结果可能与Notch信号途径在刺胞动物无性繁殖过程中的特殊调控作用相关。Münder等(2010)研究表明，Notch基因的表达是水螅芽体与母体之间形成界限的必需条件，在芽体与母体分离时，Notch通路的主要靶基因-hairy/Enhancer of Split基因在分离区开始表达，进而导致芽体与母体分离。由此可以推断，Wnt信号途径和Notch信号途径在刺胞动物无性繁殖过程中，均发挥重要的调控作用，但其调控机制和模式是不同的，进一步的调控机理值得更深入探讨。