珍珠龙胆石斑鱼[Epinephelus fuscoguttatus (♀) × Epinephelus lanceolatus (♂)]是褐点石斑鱼(♀)和龙胆石斑鱼(♂)的杂交后代，是高价值的海水养殖鱼类新品种。近两年其幼苗因“皮肤溃疡病”而大规模死亡，经济损失巨大。经鉴定，该病的病原为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)，命名为哈维氏弧菌ML01株(Shen et al, 2017)。哈维氏弧菌是一种海洋发光革兰氏阴性杆菌，是海水养殖动物的主要病原菌之一。在亚洲、欧洲、北美洲等地陆续有哈维氏弧菌导致虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)、豹纹鳃棘鲈(Plectropomus leopardus)、斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)等多种水产养殖动物发病死亡的报道，造成了巨大的经济损失(Zhang et al, 2000、2001; Won et al, 2006; 陈政强等, 2012; 王雪惠等, 2012; 徐晓丽等, 2014)。

哈维氏弧菌的致病因子是近年来的研究热点之一。研究表明，哈维氏弧菌主要的致病因子包括胞外产物(Extracellular products，ECPs)、外膜蛋白(Outer membrane proteins，Omps)、鞭毛丝蛋白等几大类(李洋等, 2014)。其中，ECPs的成分较为复杂，已报道的有多种胞外蛋白酶(Teo et al, 2003a、b; 陈雅芳等, 2006)和溶血素(Zhang et al, 2001)。胞外蛋白酶是最早确定的哈维氏弧菌致病因子之一，Liu等(1997)率先自病原性的哈维氏弧菌中鉴定出半胱氨酸蛋白酶，此后，Lee等(1999)、沈锦玉等(2011)也分离纯化出哈维氏弧菌半胱氨酸蛋白酶，并发现该酶具有较强的抗凝血性和毒性。在哈维氏弧菌的外膜蛋白研究方面，目前已在多个菌株中鉴定出OmpU、OmpK、OmpW等几种外膜蛋白，这些外膜蛋白具有良好的免疫原性，可用于哈维氏弧菌亚单位疫苗的研发(黄辉等, 2010; 何超军等, 2011; 张崇文等, 2006; 黄浦江等, 2013)。

鉴于哈维氏弧菌对海水养殖生物的巨大危害，本研究以珍珠龙胆石斑鱼幼鱼“皮肤溃疡病”病原——哈维氏弧菌ML01株为研究对象，对其胞外产物和分泌性蛋白进行了分离和特性分析，为该菌的致病性研究和防控提供参考依据。

健康斑马鱼(Danio rerio)购自山东省青岛市某观赏鱼市场，平均全长为3.65 cm，平均体重为0.38 g。在中国水产科学研究院黄海水产研究所养殖生物疾病控制与分子病理学研究室循环水养殖系统中暂养7 d，确认健康后用于毒性实验。

珍珠龙胆石斑鱼“皮肤溃疡病”病原菌——哈维氏弧菌ML01株，于2014年夏季分离自山东某养殖场患病石斑鱼幼鱼。感染该菌株的石斑鱼幼鱼(体长为1–6 cm)表现出皮肤溃疡、体表出血等症状。如不及时治疗，死亡率高达90%。毒力实验表明，ML01株对珍珠龙胆石斑鱼幼鱼的LD₅₀为2.65 × 10⁴ CFU/g鱼体重。该菌株已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(保藏号：CGMCC No. 11720)。

ECPs的提取参照Inamura等(1984)的方法，采用平板玻璃纸覆盖技术进行。具体操作为挑取ML01单菌落，接种于含1.5% NaCl的胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TNB)中，摇菌24 h后取0.2 ml均匀涂布于表面覆盖灭菌玻璃纸的含1.5% NaCl的胰蛋白胨大豆琼脂(TNA)平板上，置于28℃培养24 h。用1 ml无菌PBS (0.01 mol/L，pH 7.4) 悬浮玻璃纸上的细菌及其分泌物，并将其收集到1.5 ml离心管中，在4℃下14000 × g离心20 min，取上清液，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，收集滤出液，即为ECPs粗提液。

取少量粗提液用Pierce^®BCA Protein Assay Kit(Thermo)测定其蛋白含量，其余粗提液分装，保存于–80℃冰箱中备用。

对收集的ECPs粗提液，参照沈锦玉等(2011)的方法进行ECPs酶活性实验。具体方法是：分别配制含1%明胶、1%酪蛋白、1%淀粉、1%吐温20、2%脲素(加0.0015%酚红)的琼脂平板，用打孔器在平板上无菌打孔，每孔加入30 μl ECPs粗提液，28℃温育12 h，然后在明胶平板中加入酸性氯化汞，在酪蛋白平板中加入10%的三氯乙酸(TCA)，在淀粉平板中加入卢戈氏碘液，观察孔周围透明圈情况，有透明圈即判断为酶活性阳性。

采用脱纤维绵羊血平板，用打孔器在平板上无菌打孔，每孔加入30 μl ECPs粗提液，28℃温育12 h，观察孔周围透明圈情况，有透明圈即判断为溶血性阳性。

取健康的斑马鱼96尾，随机分为12组，每组8尾鱼。设置3个实验组和1个对照组，每组3个平行。将ECPs粗提液用0.01 mol/L的PBS(pH 7.4) 稀释。对3个实验组的斑马鱼分别腹腔注射20 μl总蛋白浓度分别为1027.84 μg/ml、513.92 μg/ml和342.61 μg/ml的ECPs粗提液，对照组的斑马鱼注射20 μl的PBS。

实验期间，各组斑马鱼饲养于含4 L自来水的水族箱中，水温为25℃，每天换水50%，投喂3次，每次0.04 g/尾。每天观察斑马鱼状态，记录死亡情况，持续7 d。采用Reed-Muench法计算半数致死剂量(LD₅₀)。

挑取ML01单菌落接种至适量的TNB液体培养基中，28℃摇菌24 h后，在4℃下2500×g离心15 min，取上清液，经0.22 μm的微孔滤膜过滤，收集滤出液。取50 ml滤出液，在缓慢搅动下加入(NH₄)₂SO₄固体，使之达到80%的饱和度，并连续搅拌1 h，然后在4℃下9900 × g离心15 min，弃去上清液。沉淀部分加0.01 mol/L PBS(pH 7.0) 溶解，并透析36 h。最后用聚乙二醇(PEG 2000) 浓缩，即为分泌性蛋白粗提液。

参照魏玉西等(2002)的方法对上述分泌蛋白粗提液进行Sephadex G-100凝胶柱层析，去除溶液中的无机盐和小分子杂蛋白，收集4–150 kDa范围内的纯化蛋白。

取1.6中纯化出的分泌性蛋白进行SDS-PAGE分析。具体参数是：5%的浓缩胶，15%的分离胶，每孔上样10 μl；起始电压为70 V，待样品进入分离胶后恒压120 V，电泳完毕后经考马斯亮蓝R-250染色。从凝胶上切下相对含量高的蛋白条带P42、P36、P31，送上海博苑科技有限公司进行MALDI-TOF/TOF质谱分析。通过MATRIX SCIENCE在线比对鉴定，得到与P42、P36、P31最匹配的蛋白GenBank检索号。

通过1.7中得到的蛋白检索号，在GenBank上获得相应的蛋白序列，然后在NCBI网页上(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)用Tblastn在线程序搜寻编码这些蛋白的基因序列，并在哈维氏弧菌ATCC 33843株基因组(GenBank检索号CP009467和CP009468) 上定位。然后用Primer premier 5.0设计PCR引物，从哈维氏弧菌ML01株的基因组中扩增相应的基因，引物由上海生工生物工程公司有限公司合成(表 1)。

表 1(Tab. 1)

表 1 本研究所用的引物 Table 1 Primers used in this study 引物 名称 Names 引物序列 Sequence (5'-3') 产物大小 Product size(bp) p42-F AATACCACGCCATCAATCG 1596 p42-R TGGTGGGGATAAGCAAAAG p36-F CGACAAGGCAAGAACCACAG 1185 p36-R CGCACATTGGTGGAGAAGAT p31-F TCCTTACGAAACTCGCATCT 1089 p31-R GACATTCAAATAACGGCTCG

表 1 本研究所用的引物 Table 1 Primers used in this study

挑取哈维氏弧菌ML01株的单菌落，接种于5 ml新鲜的2216E液体培养基中，28℃摇菌12 h，然后用TIANamp Bacteria DNA Kit (TIANGEN, 中国)提取细菌基因组DNA，具体操作按厂家说明书进行。25 μl的PCR反应体系包含：Ex Taq DNA (TaKaRa)聚合酶预混物12.5 μl，正反向引物(10 μm/L)各1 μl，模板DNA 1 μl，ddH₂O 9.5 μl。扩增条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，适当温度退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；最后72℃温育7 min。其中，p42基因退火温度为56℃，p36基因退火温度为57℃，p31基因退火温度为55℃。PCR产物送至上海生工生物工程有限公司测序。

对上述测得的哈维氏弧菌ML01株P42、P36、P31蛋白的基因序列，取其开放阅读框(Open reading frame，ORF)序列及推测的氨基酸序列，与哈维氏弧菌ATCC 33843株的相应序列分析比对。

采用平板玻璃纸覆盖技术收集24 h的ECPs，参照Pierce^®BCA Protein Assay Kit(Thermo)的方法测定出其蛋白含量为1027.84 μg/ml。酶活性测定结果表明，哈维氏弧菌ML01株的ECPs具有酯酶、明胶酶、淀粉酶以及酪蛋白酶活性，不具有脲酶活性，对绵羊红细胞无溶血性。

用哈维氏弧菌ML01株的ECPs粗提液腹腔注射健康的斑马鱼，注射6 h后实验鱼开始出现死亡。注射后7 d内，1027.84 μg/ml浓度的ECPs注射组累积死亡率为95.83%，513.92 μg/ml浓度的ECPs注射组累积死亡率为66.67%，342.61 μg/ml浓度的ECPs注射组累积死亡率为45.83%，而PBS对照组无死亡情况出现(图 1)。但除了注射部位略微变红外，实验鱼并无其他明显症状。按照Reed-Muench法计算出ML01株ECPs粗提液对斑马鱼的LD₅₀为19.55 μg/g鱼体重。

图 1(Fig. 1)

图 1 哈维氏弧菌ML01株的ECPs粗提液对斑马鱼的毒性 Figure 1 The toxicity of crude ECPs of isolate ML01 to zebra fish

哈维氏弧菌ML01株的分泌性蛋白粗提液经Sephadex G-100凝胶柱层析后，得到单一的洗脱峰。收集对应洗脱峰的蛋白溶液，取1 ml进行SDS-PAGE染色，可以观察到6条清晰的蛋白条带。其中，3个主要蛋白条带的分子量约为42、36、31 kDa，分别记为P42、P36、P31蛋白(图 2)。

图 1(Fig. 1)

图 2 菌株ML01分泌性蛋白的SDS-PAGE Figure 2 SDS-PAGE profiles of purified secretory proteins of isolate ML01 泳道M：Marker；泳道P：Sephadex G-100纯化的ML01株分泌蛋白 Lane M: Protein marker; Lane P: Purified secretory proteins of isolate ML01 by Sephadex G-100

从SDS-PAGE凝胶上切下P42、P36、P31蛋白条带，进行MALDI-TOF/TOF质谱分析。经过MATRIX SCIENCE在线比对显示，P42蛋白的肽指纹图谱与哈维氏弧菌外膜蛋白U(OmpU)的匹配度最高，有16条序列相匹配，序列覆盖率约为15%，即P42可以鉴定为ML01株的外膜蛋白U。P36蛋白的肽指纹图谱与哈维氏弧菌外膜蛋白N(OmpN)的匹配度最高，有15条序列相匹配，序列覆盖率约为15%，即P36可以鉴定为ML01株的外膜蛋白N。P31蛋白的肽指纹图谱与哈维氏弧菌一种功能未知蛋白的匹配度最高，有14条序列相匹配，序列覆盖率约为14%，即P31为ML01株的一种功能未知的蛋白(图 3–图 5)。

图 1(Fig. 1)

图 3 哈维氏弧菌外膜蛋白U的序列(gi|829488389) Figure 3 The OmpU sequence of V. harveyi (gi|829488389) 质谱鉴定得到的ML01株P42蛋白的肽段用下划线表示 The underlined sequences were peptides from protein P42 of strain ML01 identified by mass spectrometry analysis

图 1(Fig. 1)

图 4 哈维氏弧菌外膜蛋白N的序列(gi|49594841) Figure 4 The OmpN sequence of V. harveyi (gi|49594841) 质谱鉴定得到的ML01株P36蛋白的肽段用下划线表示 The underlined sequences were peptides from protein P36 of strain ML01 identified by mass spectrometry analysis

图 1(Fig. 1)

图 5 哈维氏弧菌一种未知功能蛋白的序列(gi|915938619) Figure 5 The hypothetical protein sequence of V. harveyi (gi|915938619) 质谱鉴定得到的ML01株P31蛋白的肽段用下划线表示 The underlined sequences were peptides from protein P31 of strain ML01 identified by mass spectrometry analysis

应用本研究设计的引物，通过同源克隆的方法，从哈维氏弧菌ML01株的基因组中成功地扩增出了P42、P36和P31蛋白的基因，即OmpU、OmpN和p31。其中，OmpU的ORF长度为1026 bp，编码341个氨基酸；OmpN的ORF长度为1029 bp，编码342个氨基酸；p31的ORF长度为900 bp，编码299个氨基酸(图 6–图 8)。取ML01株各基因的ORF序列及推测的氨基酸序列，与哈维氏弧菌ATCC 33843株的相应序列进行比对分析，结果显示，2株菌OmpU基因的ORF序列相似度为97.08%，氨基酸序列相似度为99.71%；OmpN基因的ORF序列相似度为100%，氨基酸序列相似度也为100%；p31基因的ORF序列相似度为99.67%，氨基酸序列相似度为99.93%。

图 1(Fig. 1)

图 6 ML01株OmpU基因的核酸序列及推测的氨基酸序列 Figure 6 The nucleotide sequence and predicted amino acids sequence of OmpU from strain ML01

图 1(Fig. 1)

图 7 ML01株OmpN基因的核酸序列及推测的氨基酸序列 Figure 7 The nucleotide sequence and predicted amino acids sequence of OmpN from strain ML01

图 1(Fig. 1)

图 8 ML01株p31基因的核酸序列及推测的氨基酸序列 Figure 8 The nucleotide sequence and predicted amino acids sequence of p31 from strain ML01

2014年夏季，本实验室首次从患病的珍珠龙胆石斑鱼体内分离到哈维氏弧菌ML01株，人工感染实验证明，该菌株是珍珠龙胆石斑鱼幼鱼“皮肤溃疡病”的病原，其对珍珠龙胆石斑鱼幼鱼的LD₅₀为2.65 × 10⁴ CFU/g鱼体重，属于毒力较强的菌株。为了进一步分析ML01株的致病因子，研发特异性疫苗，本研究开展了哈维氏弧菌ML01株胞外产物和分泌性蛋白的分离与特性研究。

作为哈维氏弧菌重要的致病因子，ECPs的酶活性及溶血性与细菌的致病力关系密切。已有的研究表明，不同的哈维氏弧菌分离株，其ECPs的酶活性及溶血性特征存在差异。如陈雅芳等(2006)从患溃疡病青石斑鱼(E. awoara)和斜带石斑鱼中分离的哈维氏弧菌TS-628株，其ECPs具有酪蛋白酶、明胶蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、卵磷脂酶活性，无脲酶活性，对羊血细胞有一定的溶血活性。石存斌等(2007)从斜带石斑鱼和红鳍笛鲷(Lutjanus erythopterus)中分离到的哈维氏弧菌EcGY020401株和SpGY020601株，其ECPs具有淀粉酶、酪蛋白酶、脂肪酶活性，无脲酶和明胶酶活性，对非鱼类动物的溶血性很弱。沈锦玉等(2011)从大黄鱼(Larimichthys crocea)中分离到的哈维氏弧菌GYC1108-1株，其ECPs具有明胶酶、酪蛋白酶、淀粉酶、卵磷脂酶及脂酶活性，无脲酶活性。本研究分离自患“皮肤溃疡病”珍珠龙胆石斑鱼的哈维氏弧菌ML01株，其ECPs具有酯酶、明胶酶、淀粉酶以及酪蛋白酶活性，无脲酶活性，对绵羊红细胞无溶血性。显然，在ECPs酶活性特征方面，ML01株与TS-628株和GYC1108-1株较为一致，而与EcGY020401株和SpGY020601株相差较大。在ECPs的溶血性方面，各菌株则不尽相同。这说明哈维氏弧菌的ECPs酶活性及溶血性特征具有菌株特异性，而与被其感染的宿主种类关系不大。这也与哈维氏弧菌能对多种水产动物致病的现象相一致。

ECPs是哈维氏弧菌重要的致病因子，在评价其毒性时，常常使用ECPs腹腔注射实验鱼并测定LD₅₀的方法。石存斌等(2007)研究了EcGY020401株和SpGY020601株的ECPs对鲫鱼(Carassius auratus)幼鱼的LD₅₀均为7.1 μg/g鱼体重，沈锦玉等(2011)研究了GYC1108-1株的ECPs对大黄鱼的LD₅₀为3.5 μg/g鱼体重。本研究发现，ML01株的ECPs对斑马鱼的LD₅₀为19.55 μg/g鱼体重。显然，哈维氏弧菌ECPs对实验鱼的LD₅₀值差异较大。本研究中，由于选用的实验鱼种类和大小都不同，不能通过直接比较LD₅₀值来评价哈维氏弧菌各分离株ECPs的毒性大小。为了使不同研究得到的LD₅₀值具有可比性，建议今后在测定哈维氏弧菌ECPs的毒性时，统一使用标准实验动物——成年斑马鱼作为实验鱼。

弧菌的分泌性蛋白参与众多的生理过程，包括细菌外壁的生物发育及能量的产生、有害物质的清理和脱毒、信号转导等过程(刘笋等, 2011)。本研究分离、纯化出了哈维氏弧菌ML01株的3个主要的分泌性蛋白，经质谱鉴定分别为OmpU、OmpN和一种功能未知的蛋白P31。OmpU和OmpN都是弧菌重要的外膜蛋白之一，它们均具有强免疫原性，可作为亚单位疫苗的开发对象(黄辉等, 2010; Pang et al, 2013)；OmpU还参与细菌结合宿主细胞的过程(黄辉等, 2010; 李岩等, 2010; 王晴, 2011¹⁾; Pang et al, 2013)。本研究的结果表明，应用硫酸铵沉淀和Sephadex G-100凝胶柱层析相结合的方法，可以有效地从哈维氏弧菌培养物中纯化出OmpU、OmpN蛋白，用于开展蛋白特性和致病机制的研究。此外，本研究分离纯化出的P31蛋白，其功能还需要进一步的研究。

1) Wang Q. Identification and evaluation of an outer membrane protein OmpU from a Vibrio harveyi isolate as vaccine candidate in turbot (Scophthalmus maximus). Master's Thesis of Ocean University of China, 2011, 1-60 [王晴.哈维氏弧菌外膜蛋白基因OmpU的克隆表达、DNA疫苗的构建及对大菱鲆免疫效果的探究.中国海洋大学硕士研究生学位论文, 2011, 1-60]

结合质谱分析和生物信息学方法，本研究测定了哈维氏弧菌ML01株OmpU、OmpN和P31蛋白的基因序列。其中，ML01株的OmpU ORF长度为1026 bp，编码341个氨基酸，略长于哈维氏弧菌ATCC 33843株的相应序列(ORF长度为1011 bp，编码336个氨基酸)，但比王晴(2011)¹⁾报道的哈维氏弧菌SF-1株的相应序列长很多(ORF长度为969 bp，编码322个氨基酸)。ML01株的OmpN ORF长度为1029 bp，编码342个氨基酸，与哈维氏弧菌ATCC 33843株的相应序列完全相同，与哈维氏弧菌ATCC 43516株(GenBank检索号：CP14039) 也仅有2个碱基的差异，但与其他哈维氏弧菌相应序列的相似度均小于83%。这些结果表明，哈维氏弧菌各分离株的OmpU和OmpN基因存在一定的差异，这可能与其分离环境和致病性有关，在研发哈维氏弧菌的亚单位疫苗时要充分考虑。