河蚬(Corbicula fluminea)属软体动物门、瓣鳃纲、真瓣鳃目、蚬科、蚬属，是我国常见的小型双壳经济贝类，在淡水、咸淡水的江河、湖泊、池塘中广泛分布，是底栖动物群落中的优势种群(杞桑等, 1987; 蔡炜等, 2010; 李德亮等, 2013)。河蚬在水生态系统的物质循环和能量流动中具有重要作用，也是构建生物浮床净化富营养化水体常用的底栖生物种类(Li et al, 2010)。同时，河蚬营养丰富、味道鲜美，是很多国家居民的美食，国际市场对河蚬需求量也在逐渐增加。近年来，河蚬养殖业悄然兴起，已成为淡水经济贝类的养殖热点之一。由于养殖所需苗种主要来自于采捕野生苗，导致对河蚬资源的捕捞强度逐渐加大，再加之水环境污染，使得其天然资源量呈现急剧下降。因此，保护和恢复河蚬野生种质资源成为亟待解决的问题。

洪泽湖是中国第四大淡水湖泊，位于江苏省西部淮河干流中下游，是具有防洪、灌溉、调水、水产、水运、水电等综合利用功能的平原型浅水湖(王兆群等, 2010)。历史上洪泽湖河蚬资源量较为丰富，分布遍及全湖，是洪泽湖重要的出口创汇水产品之一。在20世纪80年代初期，洪泽湖年产河蚬32万t，到90年代初减少到21.29万t。近年来，资源量下降到5万t，分布区域也大大缩小(袁永浒等, 1994; 严维辉等，2007; 毕婷婷等, 2014)，这较大地制约了河蚬产业的可持续发展。目前，有关洪泽湖河蚬的研究主要集中在资源量调查及其分布、种群年龄结构、营养价值等方面(袁永浒等, 1994; 严维辉等, 2007; 毕婷婷等, 2014; 张超文等, 2012; 刘晶晶等, 2014)，而对于其种质资源遗传多样性的研究较少(丁怀宇等, 2011; 李大命等, 2015)。在本研究中，以洪泽湖河蚬2种表型群体(黑色和黄色)为研究对象，采用形态学分析和分子标记技术(COⅠ基因)研究河蚬2种群体的形态及遗传多样性，以期为洪泽湖河蚬种质资源保护提供科学依据。

本研究于2015年3月在洪泽湖临淮水域采集河蚬样品，采用工具为划耙，耙齿间距为8 mm，耙宽为70 cm。根据河蚬外壳颜色差异，将洪泽湖河蚬分为黑色群体和黄色群体(图 1)。随机选择部分河蚬样品，其中，黑色河蚬28个，黄色河蚬30个。用电子天平称量河蚬湿重(Wet weight, WW)，精确到0.01 g。称量前，用滤纸将河蚬体表的水分吸干。用电子游标卡尺测量河蚬壳长(Shell length, SL)、壳宽(Shell width, SW)和壳高(Shell height, SH)，精确到0.01 mm。

图 1(Fig. 1)

图 1 河蚬外壳差异 Figure 1 Distinct difference of external shell color of C. fluminea

取河蚬的肌肉组织，用无水乙醇固定，-20℃保存备用。基因组DNA的提取方法为酚-氯仿抽提法(Sambrook et al, 1995)。DNA经75% (体积分数)乙醇洗涤并在室温干燥，最后用100 μl TE溶解，置于-20℃保存备用。

COⅠ基因扩增引物分别为F(5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3')、R(5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3') (Folmer et al, 1994)。PCR反应体积为50 μl，其中，包括25 μl PCR mix，上、下游引物各2 μl (10 μmol/L)，模板2 μl，其余部分用超纯水补足。PCR反应条件：94℃预变性4 min；94℃变性40 s，50℃退火40 s，72℃延伸50 s，30个循环；72℃延伸10 min；最后保持在4℃。

取PCR扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，采用DNA凝胶回收试剂盒对目的片段进行回收纯化，然后送上海生工生物技术有限公司进行双向测序。

采用SPSS 16.0软件对2种河蚬群体的形态学参数进行t检验，当P < 0.05时为显著性差异。采用Bioedit 7.5软件对COⅠ基因序列进行编辑、排序和比对，并辅以人工校对。利用MEGA 4.0软件计算序列的碱基组成、多态性位点及转换/颠换比值(Tamura et al, 2007)。利用邻接法(Neighbor joining)构建COⅠ单倍型分子系统进化树，经1000次重复抽样检测其置信度。运用DnaSP 5.0软件计算群体的遗传多样性参数，包括单倍型数、单倍型多样性指数、核苷酸多样性指数和平均核苷酸差异数(Librado et al, 2007)。使用Arlequin 3.1软件中的分子方差分析(AMOVA)方法估算遗传变异在群体间和群体内的分布，并计算群体间遗传分化指数F_st值(F-statistics, F_st)及其P值(Excoffier et al, 2005)。

洪泽湖黑色和黄色河蚬群体的形态学参数见表 1。由表 1可以看出，黑色河蚬群体的重量、壳长、壳宽、壳高、壳长/壳宽、壳高/壳宽均大于黄色河蚬群体，而壳长/壳高则小于黄色群体。统计分析结果显示，除壳长/壳高之外，2个群体的形态学指标均存在极显著性差异(P < 0.01)。

表 1(Tab. 1)

表 1 河蚬2个表型群体形态学参数 Table 1 Morphological parameters of two different phenotypical population of C. fluminea 表型 Phenotype 重量 WW 长度 SL 宽度 SW 高度 SH 长/宽比 SL/SW 长/高比 SL/SH 高/宽比 SH/SW 黑色群体 Black population 6.815±0.382 26.038±0.531 16.616±0.252 24.718±0.486 1.566±0.018 1.054±0.009 1.486±0.014 黄色群体 Yellow population 2.820±0.345 18.529±0.604 12.642±0.364 17.258±0.645 1.464±0.012 1.079±0.010 1.358±0.012

表 1 河蚬2个表型群体形态学参数 Table 1 Morphological parameters of two different phenotypical population of C. fluminea

黑色和黄色河蚬群体的COⅠ基因序列碱基组成基本一致，COⅠ基因为614 bp，碱基序列中A、T、G和C的平均含量分别为22.5%、42.3%、21.2%和14.0%，均表现出碱基A+T含量(64.8%)大于G+C含量(35.2%)。2个群体的COⅠ基因序列中均检出53个多态性位点，转换/颠换比分别为2.71和2.74，没有插入、缺失位点。

黑色河蚬群体检出7个单倍型(Hb1–Hb7)，黄色种群检出5个单倍型(Hy1–Hy5)。单倍型Hb1、Hy5及Hb5、Hy2是2个群体的共享单倍型。黑色群体中单倍型Hb1的数量最多(10个)，占比35.7%；黄色群体中单倍型Hy2的数量最多(16个)，占比53.3%。2个河蚬群体的遗传多样性见表 2。从表 2可以看出，共检出洪泽湖河蚬单倍型10个，单倍型多样性指数为0.726，核苷酸多样性指数为0.04021，平均核苷酸差异数为24.687。由表 2可以得出，洪泽湖河蚬群体的遗传多样性较高，其中，黑色群体的遗传多样性高于黄色群体。

表 2(Tab. 2)

表 2 河蚬群体的遗传多样性参数 Table 2 Genetic diversity parameters of two populations of C. fluminea 遗传多样性参数 Genetic diversity parameters 黑色群体 Black population 黄色群体 Yellow population 总计 Total 个体数Individual number 28 30 58 变异位点Variable sites 53 53 55 单倍型数Number of haplotype 7 5 10 单倍型多样性Haplotype diversity 0.794 0.607 0.726 核苷酸多样性Nucleotide diversity 0.04274 0.02825 0.04021 平均核苷酸差异数Average number of nucleotide differences 26.243 17.343 24.687

表 2 河蚬群体的遗传多样性参数 Table 2 Genetic diversity parameters of two populations of C. fluminea

洪泽湖河蚬2个群体的方差分析(AMOVA)结果显示(表 3)，遗传变异固定指数F_st=0.2174，且统计结果为极显著(P < 0.01)，表明2个群体之间存在显著的遗传分化。在整个遗传变异中，2个群体之间的遗传变异占21.74%，而大部分变异(78.26%)发生在群体内部。

表 3(Tab. 3)

表 3 洪泽湖河蚬群体COⅠ基因的AMOVA分析 Table 3 AMOVA analysis of all mtDNA COⅠ gene sequences from two C. fluminea populations 变异来源 Sources of variation 自由度 df 平方和 Sum of square 方差组分 Variance component 方差比例 Variance proportion (%) 群体间Among populations 1 97.834 3.00415 Va 21.74 群体内Within populations 56 605.752 10.81701 Vb 78.26 总体Total 57 703.586 13.82116 100.00 固定指数Fixation index Fst=0.2174 (P < 0.01)

表 3 洪泽湖河蚬群体COⅠ基因的AMOVA分析 Table 3 AMOVA analysis of all mtDNA COⅠ gene sequences from two C. fluminea populations

分析比较了10个单倍型之间的Kimura-2-parameter遗传距离，其值在0.002-0.091之间，平均遗传距离为0.048 (表 4)。根据遗传距离大小，可以将10个单倍型分为2个类群，其中，单倍型Hb1/Hy5、Hb2、Hb3和Hb4为一个类群，而单倍型Hy1、Hy2/Hb5、Hy3、Hy4、Hb6和Hb7为另一个类群。

表 4(Tab. 4)

表 4 河蚬10个COⅠ单倍型之间的遗传距离 Table 4 Genetic distances among 10 COⅠ gene haplotypes of C. fluminea 单倍型Haplotype Hb1/Hy5 Hb2 Hb3 Hb4 Hb5/Hy2 Hb6 Hb7 Hy1 Hy3 Hy4 Hb1/Hy5 0 Hb2 0.002 0 Hb3 0.005 0.003 0 Hb4 0.007 0.005 0.002 0 Hb5/Hy2 0.089 0.087 0.085 0.087 0 Hb6 0.091 0.089 0.087 0.089 0.002 0 Hb7 0.087 0.085 0.083 0.085 0.002 0.003 0 Hy1 0.091 0.089 0.087 0.089 0.003 0.003 0.003 0 Hy3 0.089 0.087 0.085 0.087 0.003 0.005 0.005 0.005 0 Hy4 0.085 0.083 0.081 0.083 0.003 0.005 0.005 0.005 0.003 0

表 4 河蚬10个COⅠ单倍型之间的遗传距离 Table 4 Genetic distances among 10 COⅠ gene haplotypes of C. fluminea

以中国圆蛤(Mercenaria mercenaria)为外群，采用邻接法(NJ)和最大简约法(MP)构建COⅠ基因单倍型系统发生树(图 2和图 3)。结果显示，10个单倍型聚为2个明显的分支，其中，单倍型Hy1、Hy2/Hb5、Hy3、Hy4、Hb6和Hb7聚为一支，单倍型Hb1/Hy5、Hb2、Hb3和Hb4聚为另一支。2个分支系统树的置信度统计值较高，说明COⅠ单倍型系统进化树具有较高的可信度。

图 1(Fig. 1)

图 2 河蚬COⅠ基因10个单倍型NJ系统发生树 Figure 2 Phylogenetic tree of 10 COⅠ haplotypes of C. fluminea

图 1(Fig. 1)

图 3 河蚬COⅠ基因10个单倍型MP系统发生树 Figure 3 Maximum parsimony tree of 10 COⅠ haplotypes of C. fluminea

本研究中洪泽湖黑色河蚬和黄色河蚬群体的mtDNA COⅠ基因序列中的4种碱基组成平均值为T(42.3%)、A(22.5%)、C(14.0%)和G(21.2%)，其中，A+T的平均含量为64.8%，远高于G+C的含量(35.2%)，显示出明显的碱基组成偏倚性，与Park等(2003)研究的亚洲8个国家和地区的河蚬mtDNA COⅠ基因序列组成相似，其中，A+T的含量平均值为64.5%。在其他双壳贝类中mtDNA COⅠ基因序列组成也有类似规律，比如缢蛏(Sinonovacula constricta)的COⅠ基因序列中A+T的含量为66.2% (牛东红等, 2008)，褶纹冠蚌(Cristaria plicata)的A+T含量为60.1% (贾名静等, 2009)，三角帆蚌(Hyriopsis cumingii) 10个群体的COⅠ基因序列中A+T的含量都明显高于G+C的含量(李家乐等, 2008)，说明COⅠ基因序列中A+T含量较高在双壳贝类中普遍存在，也符合动物线粒体基因组成不均一的特征。

遗传多样性即基因多样性是生物多样性的核心。生物的遗传多样性高低与其适应能力、生存能力和进化潜力密切相关。单倍型多样性(H_d)和核苷酸多样性(P_i)是衡量生物遗传多样性的2个重要指标。本研究中，基于线粒体COⅠ基因序列研究了洪泽湖河蚬黑色和黄色群体的遗传多样性。结果显示，黑色和黄色群体的单倍型多样性和核苷酸多样性指数分别为0.794和0.04274、0.607和0.02825 (表 2)。根据线粒体DNA序列的遗传变异分析，可以将不同核苷酸多样性和单倍型多样性间的组合分成4种类型[低P_i( < 0.005) 与低H_d( < 0.5)；低P_i( < 0.005) 与高H_d( > 0.5)；高P_i( > 0.005) 与低H_d( < 0.5)；高P_i( > 0.005) 与高H_d( > 0.5)] (Grant et al, 1998)。本研究表明，2个河蚬群体的P_i和H_d均较高，属于第4种类型，表明洪泽湖河蚬群体的遗传多样性较高。丁怀宇等(2011)采用微卫星分子标记对洪泽湖4个河蚬群体遗传特征进行了研究，结果显示，4个群体的平均期望杂合度均大于0.752，显示出较高的遗传多样性水平。李大命等(2015)研究表明，洪泽湖河蚬的单倍型多样性指数和核苷酸多样性指数分别为0.870和0.045，均与本研究结果一致。整体来看，一方面，洪泽湖河蚬种质资源具有较高的遗传多样性，意味着河蚬群体有较强的环境适应能力及进化潜力，为河蚬良种选育及资源可持续发展和利用提供了保证；另一方面，洪泽湖河蚬天然资源量急剧下降，目前已无法形成捕捞群体。因此，必须加强洪泽湖河蚬种质资源的保护，通过建立种质资源保护区、增殖放流、控制捕捞强度及延长禁渔期等措施避免河蚬资源进一步衰减，以保护其种质资源的多样性及完整性。

根据Balloux等(2002)提出的标准，F_st值在0-0.05、0.05-0.15、0.15-0.25分别表明群体间的低、中、高遗传分化水平。在本研究中，方差分析结果显示，2个群体的遗传变异主要发生群体内，占78.26%，而种群间遗传变异占21.74%。群体间遗传分化系数F_st = 0.2174，且统计结果为极显著(P < 0.01)，表明洪泽湖河蚬黑色和黄色河蚬群体之间存在较高的遗传分化。因此，应将洪泽湖河蚬黑色和黄色群体作为独立单元分别进行管理和保护。

在本研究中，共检测出10个单倍型，NJ系统进化树显示，COⅠ单倍型分为2个明显分支，且2个分支内单倍型之间的遗传距离较小(0.002-0.005)，而2个分支间单倍型之间的遗传距离较大(0.081-0.091) (表 4)。根据Hebert等(2003)提出的物种鉴定最小种间距离为2%，且种间遗传距离大于种内的遗传距离大约10倍的标准，可以初步认定，洪泽湖河蚬存在2个种类的COⅠ单倍型，二者之间有明显的遗传差异。同样，基于COⅠ基因序列，对德国、法国、荷兰及中国多个水体河蚬群体的遗传多样性进行研究，也发现了河蚬群体COⅠ单倍型呈现出明显遗传分化(Renard et al, 2000; Pfenninger et al, 2002; Wang et al, 2014)。由此可以推测，河蚬群体内部COⅠ单倍型出现遗传分化是一个普遍存在的现象，可能是由于河蚬种源不同或环境差异所致(Baker et al, 2003; Sousar et al, 2007)。

一般来说，双壳贝类具有较强的表型可塑性以适应不同的环境和生态条件(Baker et al, 2003)。根据河蚬壳表面颜色差异，可将河蚬分为不同的群体类型。在太湖和洪泽湖中均发现河蚬有黑色和黄色2个群体。通过调查发现，太湖河蚬黑色和黄色群体的分布区域不同，且黑蚬高产区的底泥硫化物含量较高(曹文明等, 2000)。而洪泽湖河蚬黑色和黄色群体的分布区域一致，导致其颜色差异的环境因子还有待进一步研究。另外，统计分析结果显示，洪泽湖河蚬黑色和黄色群体的形态学特征有显著差异，而湖南大通湖河蚬白色和紫色群体的形态学参数无显著性差异(Wang et al, 2014)。研究还发现，根据颜色划分河蚬类群与其遗传特征不具有对应性。本研究中黑色和黄色河蚬群体拥有2个共享单倍型(Hb1、Hy5及Hb5、Hy2)，却分布在2个不同的分支上(图 2)，且群体内单倍型之间的遗传距离大于群体间的遗传距离(表 4)。在大通湖河蚬2个群体(白色和紫色)中，基于mtDNA COⅠ基因序列分析得到4种单倍型(DT-1、DT-7、DT-19和DT-31)，单倍型DT-7与另外3种单倍型有明显遗传差异，其中，单倍型DT-31仅在白色群体中出现，其他3种单倍型在2个群体中都有出现(Wang et al, 2014)。基于形态学和COⅠ基因序列对葡萄牙2个地理分布河蚬群体进行比较分析，结果显示，2个河蚬群体的形态学参数具有显著性差异，而COⅠ基因序列却高度相似，Sousar等(2007)认为，应将2个地理分布群体归为同一河蚬种类。因此，只有将形态学和遗传学特征结合起来，才能准确认识不同表型河蚬群体之间的相互关系。