拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是广泛分布在我国沿海地区的青蟹属优势种(林琪等, 2007)，因其适应力强、肉质鲜美、营养丰富，成为高经济价值的理想养殖种类。近些年，随着人工养殖规模的扩大，弧菌病、黑斑病、黄水病等细菌性疾病的暴发屡见不鲜，严重威胁到青蟹的健康养殖和发展(黄诗婷等, 2012)。复方磺胺嘧啶粉是我国国标渔用抗菌药物之一(中华人民共和国兽药典, 2011)，适用于海水虾蟹细菌病防治，科学合理地使用抗菌药已经成为防治水产细菌病的重要手段。国内外有关复方磺胺嘧啶(磺胺嘧啶SD:甲氧苄啶TMP=5:1) 在畜禽动物体内药动学的研究报道较多(Gustafsson et al, 1999; Baert et al, 2001; Abu-Basha et al, 2009; 钱建中等, 2013; Nouws et al, 1993; 肖贺等, 2014; 王伟利等, 2016)，在水产动物中相对较少且主要集中在鱼类，如复方磺胺嘧啶静脉注射给药下在鲤鱼(Cyprinus carpio L.)体内(Nouws et al, 1993)、单剂量(肖贺等, 2014)和多剂量(王伟利等, 2016)药饵给药下在罗非鱼(Oreochromis niloticus)体内和鳜鱼(Siniperca chuatsi)体内等药动学和组织消除规律(Wang et al, 2016)，在水生甲壳动物中仅见SD在中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)体内药动学的报道(李金宝等, 2014、2015)。我国水产养殖种类繁多，而国标渔药中规定的用药方案和休药期十分笼统，并未考虑鱼虾蟹等不同水产动物之间的差异，亟需更多实验来指导药物的合理有效使用。本文研究了单剂量口灌复方磺胺嘧啶在拟穴青蟹体内药动学，了解SD和TMP在拟穴青蟹体内的吸收、代谢过程以及在鳃、肌肉和肝胰腺中的分布和消除规律，为药物的安全有效使用提供基础数据。

拟穴青蟹采购于上海崇明某养殖场，未使用过SD和TMP。暂养于盐度为10、水温为(27±1)℃的人工低盐度海水中，水体pH为8.2-8.5，保持24 h充气，期间投喂新鲜螺蛳肉，7 d后挑选健康、体重为(140±20) g的青蟹用于实验。

SD和TMP标准品(纯度≥99.5%)购于德国Dr. Ehrenstorfer公司，SD和TMP原粉(纯度≥98.0%)购于潍坊三江医药集团。甲醇、乙腈和正己烷均为HPLC级，德国Merck公司产品；乙酸为优级纯，乙酸铵为分析纯，均购自国药集团上海化学试剂公司。

高效液相色谱仪(Waters 2695, 美国)；紫外检测器(Waters 2487, 美国)；色谱柱为Aglient Zorbax SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)(Aglient, 美国)；超纯水仪(Millipore Milli-Q Advantage, 美国)；电子分析天平(Mettler Toledo AL204, 瑞士)；高速冷冻离心机(HITACHI CF16RXⅡ, 日本)；微量移液器(Eppendorf, 德国)；0.22 μm针式过滤器(Rephile, 中国)。

准确称取8.33 g SD原粉和1.67 g TMP原粉，与适量精细研磨鱼粉混合均匀，加水至200 ml，搅拌成50 mg/ml(SD+TMP)糊状药饵。复方磺胺嘧啶(SD:TMP=5:1) 给药剂量为100 mg/kg蟹体重，每只蟹称重后计算口灌药饵量，用1 ml注射器(连接尖端磨钝12^#针头)从蟹口器插入约1.5 cm，灌入到胃中，口灌后不漏液、不反吐的蟹用于实验采样。

采样时间为口灌给药后0.5、1、2、4、8、12、24、48、96、192、240、360、480、600 h，每个时间点采样6只。用1 ml注射器从关节膜抽取血淋巴0.5–0.8 ml以上，转移到装有0.001 g草酸铵的2 ml离心管，振荡混匀，5000 r/min离心5 min，取上清液保存；取出鳃、肌肉和肝胰腺装入塑料密封袋。样品贮存于-40℃低温冰箱中，留待药物分析。

血淋巴样品置室温解冻后，10000 r/min离心5 min，取0.4 ml上清液于2 ml离心管中，加入3倍体积乙腈，涡旋振荡2 min后，12000 r/min离心5 min，取上清液转移至5 ml离心管中，40℃水浴氮吹，吹干后加入0.4 ml流动相复溶，经0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液用于HPLC分析。

肌肉、肝胰腺和鳃样品室温解冻后，取适量样品于均质器中均质；准确称取均质后样品1.00 g于10 ml离心管中，加入5 ml乙腈，振荡5 min，于10000 r/min转速离心5 min，收集上清液；残渣再重复提取2次，合并3次上清液于100 ml具塞茄形蒸发瓶中，于40℃旋蒸至干；加入1 ml流动相和1 ml正己烷，盖上塞子置超声波清洗仪超声15 min，瓶底残留物完全溶解，将混合液体转移至2 ml离心管中，12000 r/min离心5 min，吸取下层液体，经0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液用于HPLC分析。

流动相：乙腈和0.01 mol/L乙酸铵(乙酸调节pH为3.8)；柱温为35℃；进样量为10 μl，流速为1.0 ml/min；紫外检测器波长为245 nm。为使药峰和杂峰更好分开，不同组织样品的流动相比例有所不同，血浆和肌肉的流动相比例为乙腈:0.01 mol/L乙酸铵(pH为3.8)=12:88(V/V)，肝胰腺和鳃的流动相比例为13:87(V/V)。

拟穴青蟹血药浓度-时间关系曲线方程采用房室模型进行拟合分析，血淋巴、肌肉、鳃和肝胰腺的药动学参数采用统计矩原理推算。模型拟合和药动学参数推算采用药物与统计软件(DAS 3.1) 进行分析，休药期(WDT)采用WT1.4软件进行计算(栗柱等, 2003)。

复方磺胺嘧啶口灌给药后，拟穴青蟹血淋巴中SD、TMP浓度与时间关系曲线见图 1。从图 1可以看出，给药后血淋巴中SD浓度快速升高，4 h达到最高，峰浓度(C_max)为49.56 mg/L；随后开始快速下降，24 h已经低于峰浓度的1/2，48 h后进入缓慢消除阶段，240 h低于0.1 mg/L。口灌给药后TMP浓度变化趋势与SD相似，但C_max远低于SD，为2.79 mg/L，达峰时间(T_max)为2 h；给药后240 h，血淋巴TMP浓度低于0.05 mg/L。

图 1(Fig. 1)

图 1 方磺胺嘧啶药饵给药后拟穴青蟹血淋巴药物浓度-时间关系曲线(n=6) Figure 1 SD and TMP concentration-time curve in hemolymph of S. paramamosain following oral administration (n=6)

采用房室模型对血淋巴SD、TMP浓度与时间关系曲线进行拟合，血药浓度-时间关系曲线均适合采用一级吸收二室模型来描述，拟合的药动学方程为：

用统计矩原理对血淋巴药物浓度与时间关系进行药动学分析，所得参数见表 1。

表 1(Tab. 1)

表 1 磺胺嘧啶和甲氧苄啶在拟穴青蟹血淋巴中药动学参数 Table 1 Pharmacokinetic parameters of SD and TMP in hemolymph of S. paramamosain 药动学参数 Pharmacokinetic parameters 磺胺嘧啶 SD 甲氧苄啶 TMP Cmax(mg/L) 49.56 2.79 Tmax(h) 4 2 AUC0-t(mg /L·h) 1417.60 82.70 AUC0-∞(mg /L·h) 1420.90 85.00 MRT0-t(h) 34.75 38.22 MRT0-∞(h) 35.32 43.79 t1/2z(h) 29.77 39.51 Vz(L/kg) 2.52 11.18 CLz(L/h·kg) 0.059 0.196  注：Cmax为药峰浓度，Tmax为达峰时间，AUC0-t、AUC0-∞分别为0-t时间、0-∞时间的曲线下面积；MRT0-t、MRT0-∞分别为0-t时间、0-∞时间的平均滞留时间；t1/2z为消除半衰期；Vz为表观分布容积；CLz为总体清除率，下表同  Notes: Cmax-peak concentration; Tmax-time to reach peak concentration; AUC0-tand AUC0-∞-area under the concentration-time curve from zero to t hours and from zero to infinity, respectively; MRT0-t and MRT0-∞-mean residue time from zero to t hours and from zero to infinity, Tespectively; t1/2z-elimination half-life; Vz-volume of distribution; CLz-total body clearance, the same as below

表 1 磺胺嘧啶和甲氧苄啶在拟穴青蟹血淋巴中药动学参数 Table 1 Pharmacokinetic parameters of SD and TMP in hemolymph of S. paramamosain

拟穴青蟹肝胰腺、鳃和肌肉中SD浓度与时间关系曲线见图 2。从图 2可以看出，拟穴青蟹肌肉、鳃和肝胰腺中SD浓度变化趋势与血淋巴相似，都呈现出给药后迅速升高至峰浓度，随后开始下降。肝胰腺、鳃和肌肉中SD峰浓度分别为44.95、51.89和59.36 mg/kg，T_max均为4 h；给药后240 h肌肉和鳃中SD残留低于0.10 mg/kg，给药后360 h肝胰腺中SD残留低于0.10 mg/kg。

图 1(Fig. 1)

图 2 药饵给药后拟穴青蟹组织中磺胺嘧啶浓度-时间关系曲线(n=6) Figure 2 SD concentration-time curve in tissues of S. paramamosain following oral administration (n=6)

口灌给药后，拟穴青蟹肝胰腺、鳃和肌肉中TMP浓度与时间关系曲线见图 3。从图 3可以看出，TMP在不同组织中的浓度变化均呈先上升后下降趋势，但浓度差异明显。肝胰腺中TMP峰浓度最高，为74.82 mg/kg，在鳃和肌肉中的峰浓度分别为42.58 mg/kg和10.09 mg/kg，3种组织中TMP达峰时间分别为2 h、2 h和1 h；360 h后3种组织中TMP残留量均低于0.05 mg/kg。

图 1(Fig. 1)

图 3 药饵给药后拟穴青蟹组织中甲氧苄啶浓度-时间关系曲线(n=6) Figure 3 TMP concentration-time curve in tissues of S. paramamosain following oral administration (n=6)

采用统计矩原理对拟穴青蟹组织中SD和TMP浓度与时间关系曲线进行分析，药动学参数见表 2。

表 2(Tab. 2)

表 2 拟穴青蟹不同组织中磺胺嘧啶和甲氧苄啶的药动学参数 Table 2 Pharmacokinetic parameters of SD and TMP in the tissues of S. paramamosain 统计矩参数 Statistical moment parameters 磺胺嘧啶SD 甲氧苄啶TMP 肌肉Muscle 鳃Gill 肝胰腺Hepatopancreas 肌肉Muscle 鳃Gill 肝胰腺Hepatopancreas Cmax(mg/kg) 44.95 51.89 59.36 10.09 42.58 74.82 Tmax(h) 4 4 4 1 2 2 AUC0-t(mg/kg·h) 1606.8 1594.9 1450.3 279.7 794.7 2839.8 AUC0-∞(mg/kg·h) 1611.2 1596.5 1455.4 282.8 794.8 2841.1 MRT0-t(h) 45.47 40.86 38.97 46.26 36.89 41.83 MRT0-∞(h) 46.09 41.10 39.85 48.92 36.94 42.00 t1/2z(h) 25.09 23.28 32.39 35.08 25.29 34.93 CLz(kg/h·kg) 0.052 0.052 0.057 0.059 0.021 0.006

表 2 拟穴青蟹不同组织中磺胺嘧啶和甲氧苄啶的药动学参数 Table 2 Pharmacokinetic parameters of SD and TMP in the tissues of S. paramamosain

根据中华人民共和国农业部(2002)标准[无公害食品水产品中渔药残留限量(NY5070-2002)]的规定，将SD、TMP在水产品中的最高残留限(MRL)分别设定为0.1 mg/kg和0.05 mg/kg，采用休药期计算软件WT1.4处理拟穴青蟹肌肉和肝胰腺中SD、TMP消除阶段的浓度与时间关系，设置信区间为95%，拟穴青蟹肌肉中SD和TMP的休药期分别为290.6 h和302.8 h，肝胰腺中SD和TMP的休药期分别为340.4 h和377.0 h。

本研究中，采用了房室模型对血药浓度-时间关系曲线进行拟合分析，血淋巴中SD和TMP浓度-时间关系曲线均能很好地采用一级吸收二室开放模型来描述。有关复方磺胺嘧啶在水产动物体内药动学的报道较少。欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)口灌SD(林丽聪等, 2010)和中国对虾口服SD药饵(李金宝等, 2015)，其血药浓度-时间关系均为一级吸收二室开放模型，同时还报道了磺胺二甲嘧啶(SM₂)、磺胺对甲氧嘧啶(SMD)在中国对虾血淋巴中也适用二室模型描述。Fu等(2016)研究了复方新诺明在三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)体内的药动学，口灌给药后，血淋巴中磺胺甲唑(SMZ)的浓度-时间曲线符合二室模型。可见通过房室模型拟合分析，二室模型更适合于描述磺胺类药物在甲壳动物中的药动学过程。

达峰时间(T_max)、峰浓度(C_max)和曲线下面积(AUC)是有效反映药物在体内吸收快慢和程度的重要参数(王广基等, 2005)。本研究中，复方磺胺嘧啶口灌给药拟穴青蟹后，SD和TMP达峰快，与中国对虾(李金宝等, 2015)和三疣梭子蟹相似，其达峰明显快于罗非鱼(T_max=11 h)(肖贺等, 2014)和欧洲鳗鲡(T_max=21.5 h)，这可能是与虾蟹等甲壳动物的开放式循环系统有关(Bliss, 1983)。拟穴青蟹血淋巴SD峰浓度明显高于罗非鱼和中国对虾的C_max(分别为22.48μg/ml和1.17μg/ml)，AUC大于罗非鱼和中国对虾，由此可见，拟穴青蟹对SD吸收较好。拟穴青蟹对TMP的吸收明显优于同剂量同给药途径下的三疣梭子蟹，与罗非鱼(肖贺等, 2014)较为接近，但与SD相比，TMP进入拟穴青蟹血液循环系统的量明显偏少(C_{max_SD}/C_{max_TMP}=17.8:1，AUC_{0-t_SD}/AUC_{0-t_TMP}=17.1:1)，这可从TMP的表观分布容积(V_d)得到解释，V_d是反应药物在体内的分布情况，V_d值越大，药物穿透进入组织越多，分布越广，血药浓度越低(陈杖榴, 2001)。

消除半衰期和平均驻留时间是评价药物消除快慢的重要参数。拟穴青蟹血淋巴中药物消除快于中国对虾血淋巴中的SD(t_1/2β= 46.45 h)、连续给药的鳜鱼(Siniperca chuatsi)血浆SD和TMP的t_1/2β=68.8–139.8 h、MRT=93.3–201.7 h和t_1/2β= 34.0–56.1 h、MRT= 49.1–81.0 h(Wang et al, 2016)；慢于罗非鱼血液中SD的t_1/2β=16.9 h，TMP的t_1/2β=5.99 h(肖贺等, 2014)；而与中国对虾血淋巴中SM₂(t_1/2β= 25.81 h) (李金宝等, 2015)、三疣梭子蟹血淋巴中SMZ和TMP的消除速率(t_1/2z分别为25.12 h和44.63 h)(Fu et al, 2016)差别不大。由此可见，磺胺药物在不同动物体内的消除速率存在着种属差异，对拟穴青蟹而言，SD和TMP在其体内消除较快。

相对于人类和畜禽，水产动物可以对组织进行采样并测定其药物浓度，利于全面了解药物在动物组织中的分布和消除规律，为制定合理给药方案和休药期提供理论依据。本研究中，拟穴青蟹口灌给药后，肝胰腺是SD和TMP峰浓度和AUC最高的组织，且肝胰腺中SD消除半衰期最大，这与罗非鱼(肖贺等, 2014)的研究结果相一致，其肝脏中SD峰浓度高于血液和肌肉，但消除速率慢于后者。同为磺胺类的SD、SM₂和SMD在药饵给药中国对虾后，也是肝胰腺组织中的峰浓度和AUC为最高(李金宝等, 2014)；磺胺甲基异恶唑和TMP口灌给药三疣梭子蟹，同样是肝胰腺中峰浓度和AUC最大。由此可见，药饵或口灌给药途径下，大量药物在肝脏(肝胰腺)蓄积，肝脏(肝胰腺)是主要的代谢和解毒器官。值得关注的是，本研究中，TMP给药剂量仅为SD的1/5，但肝胰腺中TMP峰浓度却高于SD；此现象同样出现在三疣梭子蟹口灌SMZ和TMP、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)投喂磺胺二甲嘧啶和奥美普林(OMP)的药物代谢研究中(Park et al, 1995)。大量TMP在肝胰腺中蓄积，导致进入血液循环的TMP或OMP显著减少。与磺胺嘧啶相比，TMP和OMP不仅具有亲水的氨基基团(-NH₂)，而且还有亲脂的甲氧基基团(-OCH₃)，可见TMP和OMP具有亲水亲脂双重结构，有着很好的生物膜通透性；脂溶性越高的药物越容易透过生物膜，可以透过血脑屏障和胎盘屏障(李晓天等, 2006)；再者，本研究中，TMP的表观分布容积远大于1.0 L/kg，由此可以解释肝胰腺、鳃和肌肉等组织中TMP浓度均明显高于血药浓度。

在药物组织分布中，拟穴青蟹鳃组织SD和TMP峰浓度和AUC仅次于肝胰腺，而T_max与肝胰腺的相同，这与三疣梭子蟹中SMZ和TMP相一致(Fu et al, 2016)，且鳃组织中SD和TMP消除较快；从解剖结构来看，蟹鳃由8对叶状鳃组成，每个叶状鳃上有许多鳃叶，显著增大了鳃与水接触的表面积(Bliss, 1983)，由此看来，鳃很可能是药物从体内外排的重要组织。

不同国家和地区对水产品中SD和TMP最高残留限量的规定是不同的。FDA、欧盟及我国农业行业标准(中华人民共和国农业部，2002)(NY5070-2002) 规定动物源食品中磺胺药的最大残留限量(MRL)为0.10 mg/kg，TMP的MRL为0.05 mg/kg。肌肉和肝胰腺是蟹可食组织，因此，本研究按SD和TMP分别为0.10 mg/kg和0.05 mg/kg的最高残留限量来计算休药期。中国兽药典——兽药使用指南中建议水产用复方磺胺嘧啶休药期500度日，但磺胺药和TMP在不同水产动物中的休药期存在着明显的种属差异，SD在鳜鱼、中国对虾(李金宝等，2014)和欧洲鳗鲡可食肌肉组织中的休药期分别为36 d、22 d和21 d，复方磺胺嘧啶在吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)肌肉组织中的休药期为12 d (王伟利等, 2016)；本研究计算得到SD和TMP在拟穴青蟹肌肉组织中休药期分别为290.6 h和302.8 h，在肝胰腺中休药期分别为340.4 h和377.0 h，考虑到药物在水产养殖体内消除受养殖环境、健康状况、水温等因素的影响，建议复方磺胺嘧啶在拟穴青蟹体内的休药期为480 d。