金乌贼(Sepia esculenta)属于头足纲(Cephalopoda)、乌贼目(Sepioidea)、乌贼科(Sepiidea)(陈新军等, 2009)，广泛分布于中国沿海、日本列岛以及菲律宾群岛海域(董正之, 1991)。金乌贼具有生命周期短、生长速度快、营养价值高等特点，为我国北方沿海经济价值较大的头足类，曾是我国重要的海洋渔业捕捞对象之一(董正之, 1991)。但自20世纪80年代以来，由于过度捕捞和海洋环境的破坏等多种原因，其资源量明显衰退，产量急剧下降，目前，金乌贼在许多海域已经绝迹(郝振林等, 2007; 唐启升等, 1990)。因此，进一步探索金乌贼生物学特征，对更好地保护金乌贼野生资源和提高增养殖效果尤为重要。金乌贼的内壳又称海螵蛸，既是身体唯一的支撑结构，也是乌贼垂直运动时所依赖的浮力结构(Bandel et al, 1979)。海螵蛸因其具有较高的药用价值，得到了广泛研究，但报道多集中于药学方面(刘永刚等, 2005; 张健英等, 1993; 赵中杰等, 1990)，而头足类内壳发生和生长发育过程及其机理探讨方面的研究几乎空白。

为了更好地了解海螵蛸的形态与功能，推测海螵蛸的形成过程以及形成机理，本研究以早期不同发育阶段的金乌贼为研究对象，采集相关生长性状指标数据，并采用主成分分析法，以揭示金乌贼早期发育阶段内壳生长发育规律和形态学特征，为金乌贼幼苗的选育及养殖提供参考依据。

将受精卵在面积为25 m²、池深为1 m的培育池中孵化。池中均匀设置12个气石，保证孵化过程中进行不间断地微量充气，使水中溶氧量≥6 mg/L。光照维持在400–600 lx。孵化用经过二级砂滤的自然海水，培育水温为20–25℃，盐度为29–30，pH 7.8–8.0，并定期更换海水。出膜后幼体的培育条件与孵化条件相同。每天09:00和18:00投饵2次，投喂的饵料和金乌贼幼体的数量比例为20:1–30:1。0–5日龄幼体投喂卤虫无节幼体和活体糠虾，5–10日龄投喂活体糠虾。实验期间，从培育池中分6个时期随机取样，分别获得样品红珠与黑珠期30尾、心跳期29尾、出膜期30尾、初孵化幼体26尾、5日龄30尾、10日龄30尾，共175尾。

用游标卡尺测定金乌贼的胴腹长(DML)、胴宽(MB)后，用精密电子天平(Sartorius)测定体重(BW)，将其解剖，取出内壳，测定骨板壳长(CL)、壳宽(CB)，在解剖镜下测定生长纹数(LN)，最后称其壳重(CW) (表 1、图 1)。

图 1(Fig. 1)

图 1 金乌贼壳测量参数 Figure 1 Scheme of morphometric measurements of the cuttlebone

表 1(Tab. 1)

表 1 金乌贼早期发育阶段部分测量参数 Table 1 Morphometric measurements of S. esculenta at the early developmental stages 参数Parameters 测量范围Measuring range 壳长Cuttlebone length(CL) 内壳中线最前端至最后端的长度Length from the front end to the end of cuttlebone 壳宽Cuttlebone breadth(CB) 内壳的最大宽度Maximum width of cuttlebone 生长纹数Lamella number(LN) 生长纹的数目Number of growth layers 胴腹长 Dorsol mantle length(DML) 自胴部腹面中线最前端至最后端，骨针不包括在内 Length from the bottom of the ventral midline to the front of the final end, spicule is not included 胴宽Mantle breadth(MB) 胴部腹面的最大宽度Maximum width of the dorsol mantle

表 1 金乌贼早期发育阶段部分测量参数 Table 1 Morphometric measurements of S. esculenta at the early developmental stages

用SPSS 19.0、Sigma plot 12.5、Excel等软件进行数据处理。

由于原始数据单位度量不同，不能在同一水平上进行比较，因此，在分析之前，通常需要通过z-score(标准差)标准化处理数据来消除量纲和数量级的影响。标准化函数为：

式中，x^*为标准化后的数据，x为原始数据，μ为样本数据的均值，σ为样本数据的标准差。

标准化后共得到6组标准化指标，用SPSS 19.0对标准化指标进行主成分分析，具体操作步骤和所得结果的分析方法参照王国梁等(2005)。为了有效保留原始数据所含的信息量，提取主成分时，通常使累计贡献率大于85%，这样保证结果基本涵盖金乌贼早期发育阶段原始形态生长性状的全部遗传信息。

本研究共测量金乌贼早期发育阶段红珠与黑珠期、心跳期、出膜期、初孵化幼体、5日龄、10日龄等6个时期的壳长(CL)、壳宽(CB)、壳重(CW)、生长纹数(LN)、胴腹长(DML)、胴宽(MB)、体重(BW)等7个生长性状的数据，详见表 2。从表 2可以看出，红珠与黑珠期、心跳期、出膜期、初孵化幼体期各性状的变化范围较大，5日龄期、10日龄期的变化范围较小。在本培育条件下，从红珠与黑珠期到初孵化幼体耗时16 d，据此可以推断，出膜前的1个生长纹形成需要2.43 d，而出膜后的生长纹数日增长为4.95 d，生长纹数的增长速率呈现先快后慢的特点。

表 2(Tab. 2)

表 2 表 2金乌贼早期发育阶段各生物学性状的描述性统计 Table 2 Descriptive statistics of biological traits of S. esculenta at early developmental stages

表 2 表 2金乌贼早期发育阶段各生物学性状的描述性统计 Table 2 Descriptive statistics of biological traits of S. esculenta at early developmental stages

根据所测形态特征数据，利用相关系数法获得的相关系数矩阵如表 3。从表 3可以看出，红珠与黑珠期、出膜期和10日龄期各生物性状间均呈极显著性正相关(P < 0.01)；心跳期，除胴腹长与部分性状、胴宽与壳重间相关性不显著(P > 0.05) 外，其他性状间呈显著性正相关(P < 0.05)；初孵化幼体期，除胴宽与部分性状相关性不显著外(P > 0.05)，其他性状间呈极显著性正相关(P < 0.01)；5日龄时期，除胴腹长与部分性状、胴宽与部分性状间相关性不显著(P > 0.05) 外，其他性状间呈显著性正相关(P < 0.05)

表 3(Tab. 3)

表 3 金乌贼早期发育阶段不同时期内壳与各生长性状的相关系数 Table 3 The phenotype correlation coefficient among the traits of S. esculenta at early different developmental stages 时期 Stages 项目 Items 胴腹长 Dorsol mantle length 胴宽 Mantle breadth 体重 Body weight 壳长 Cuttlebone length 壳宽 Cuttlebone breadth 壳重 Cuttlebone weight 纹数 Lamella number 红珠与黑珠期 Red-bead and black-beads stage 胴腹长Dorsol mantle length 1 胴宽Mantle breadth 0.486** 1 体重Body weight 0.738** 0.706** 1 壳长Cuttlebone length 0.725** 0.465** 0.786** 1 壳宽Cuttlebone breadth 0.586** 0.454* 0.750** 0.816** 1 壳重Cuttlebone weight 0.658** 0.591** 0.808** 0.817** 0.739** 1 纹数Lamella number 0.659** 0.530** 0.769** 0.748** 0.484** 0.574** 1 心跳期 Heart-beating stage 胴腹长Dorsol mantle length 1 胴宽Mantle breadth 0.112 1 体重Body weight 0.574** 0.657** 1 壳长Cuttlebone length 0.255 0.490** 0.553** 1 壳宽Cuttlebone breadth 0.143 0.558** 0.558** 0.856** 1 壳重Cuttlebone weight 0.339 0.252 0.438* 0.609** 0.550** 1 纹数Lamella number 0.469* 0.577** 0.690** 0.771** 0.698** 0.408* 1 出膜期 Hatching stage 胴腹长Dorsol mantle length 1 胴宽Mantle breadth 0.692** 1 . 体重Body weight 0.694** 0.702** 1 壳长Cuttlebone length 0.588** 0.766** 0.618** 1 壳宽Cuttlebone breadth 0.608** 0.757** 0.614** 0.826** 1 壳重Cuttlebone weight 0.515** 0.676** 0.561** 0.696** 0.616** 1 纹数Lamella number 0.559** 0.747** 0.568** 0.830** 0.739** 0.684** 1 初孵化幼体 Newly-hatched larvae 胴腹长Dorsol mantle length 1 胴宽Mantle breadth 0.462* 1 体重Body weight 0.682** 0.271 1 壳长Cuttlebone length 0.553** 0.336 0.658** 1 壳宽Cuttlebone breadth 0.507** 0.453* 0.570** 0.791** 1 壳重Cuttlebone weight 0.517** 0.152 0.640** 0.727** 0.641** 1 纹数Lamella number 0.613** 0.356 0.622** 0.650** 0.547** 0.657** 1 5日龄 5-day-old 胴腹长Dorsol mantle length 1 胴宽Mantle breadth 0.164 1 体重Body weight 0.367* 0.633** 1 . 壳长Cuttlebone length 0.312 0.555** 0.687** 1 壳宽Cuttlebone breadth 0.305 0.602** 0.465** 0.753** 1 壳重Cuttlebone weight 0.053 0.341 0.441* 0.578** 0.605** 1 纹数Lamella number 0.192 0.235 0.494** 0.566** 0.435* 0.412* 1 10日龄 10-day-old 胴腹长Dorsol mantle length 1 胴宽Mantle breadth 0.779** 1 体重Body weight 0.754** 0.660** 1 壳长Cuttlebone length 0.791** 0.734** 0.736** 1 壳宽Cuttlebone breadth 0.662** 0.505** 0.694** 0.687** 1 壳重Cuttlebone weight 0.702** 0.611** 0.634** 0.685** 0.755** 1 纹数Lamella number 0.675** 0.574** 0.375* 0.496** 0.406* 0.544** 1 *表示显著(P < 0.05)，**表示极显著(P < 0.01) * showed significant difference (P < 0.05), ** showed extremely significant difference (P < 0.01)

表 3 金乌贼早期发育阶段不同时期内壳与各生长性状的相关系数 Table 3 The phenotype correlation coefficient among the traits of S. esculenta at early different developmental stages

本研究在金乌贼早期发育阶段的6个时期选取的主成分特征值及贡献率见表 4，成分矩阵见表 5。初孵化幼体期和5日龄时期分别提取4个主成分，其他时期提取3个主成分，6个时期入选的主成分略有差别。

表 4(Tab. 4)

表 4 金乌贼早期发育阶段不同时期生长性状的特征值和累计贡献率 Table 4 Eigenvector and cumulative contribution rate of S. esculenta at early different developmental stages 时期 Stages 成份 Components 初始特征值Initial Eigenvalue 特征值Eigenvalue 贡献率Contribution 累计贡献率Cumulative contribution rate (%) 红珠与黑珠期 Red-bead and black-beads stage 1 5.004 71.489 71.489 2 0.668 9.547 81.036 3 0.556 7.946 88.983 心跳期 Heart-beating stage 1 4.122 58.886 58.886 2 1.061 15.159 74.045 3 0.853 12.183 86.228 出膜期 Hatching stage 1 5.032 71.879 71.879 2 0.655 9.361 81.240 3 0.412 5.889 87.129 初孵化幼体期 Newly-hatched larvae 1 4.335 61.927 61.927 2 0.937 13.390 75.317 3 0.630 8.998 84.315 4 0.408 5.830 90.145 5日龄 5-day-old 1 3.760 53.716 53.716 2 0.982 14.026 67.742 3 0.803 11.465 79.207 4 0.625 8.932 88.140 10日龄 10-day-old 1 4.877 69.668 69.668 2 0.745 10.638 80.305 3 0.525 7.506 87.811

表 4 金乌贼早期发育阶段不同时期生长性状的特征值和累计贡献率 Table 4 Eigenvector and cumulative contribution rate of S. esculenta at early different developmental stages

表 5(Tab. 5)

表 5 金乌贼早期发育阶段不同时期入选成分的特征向量 Table 5 Principal eigenvector of S. esculenta at early different developmental stages 时期Stages 成分Components 特征向量Principal eigenvector 胴腹长 Dorsol mantle length 胴宽 Mantle breadth 体重 Body weight 壳长 Cuttlebone length 壳宽 Cuttlebone breadth 壳重 Cuttlebone weight 纹数 Lamella number 红珠与黑珠期 Red-bead and black-beads stage 成分1 Component 1 0.368 0.314 0.421 0.409 0.368 0.395 0.360 成分2 Component 2 –0.047 0.765 0.141 –0.343 –0.455 –0.138 0.222 成分3 Component 3 –0.393 0.405 0.038 –0.108 0.409 0.314 –0.634 心跳期 Heart-beating stage 成分1 Component 1 0.243 0.344 0.410 0.432 0.418 0.326 0.433 成分2 Component 2 0.817 –0.249 0.272 –0.243 –0.366 0.043 0.045 成分3 Component 3 0.039 –0.597 –0.321 0.255 0.148 0.658 –0.136 出膜期 Hatching stage 成分1 Component 1 0.347 0.403 0.355 0.413 0.390 0.356 0.387 成分2 Component 2 0.612 0.067 0.537 –0.304 –0.169 –0.284 –0.362 成分3 Component 3 –0.077 –0.041 0.180 –0.220 –0.460 0.828 –0.122 初孵化幼体期 Newly-hatched larvae 成分1 Component 1 0.377 0.241 0.396 0.421 0.397 0.391 0.393 成分2 Component 2 0.215 0.858 –0.153 –0.150 0.050 –0.407 –0.061 成分3 Component 3 0.566 0.141 –0.380 0.356 –0.568 0.116 –0.231 成分4 Component 4 –0.251 0.124 –0.453 –0.090 –0.247 0.184 0.783 5日龄 5-day-old 成分1 Component 1 0.208 0.369 0.419 0.464 0.433 0.359 0.338 成分2 Component 2 0.858 –0.005 0.182 –0.034 –0.099 –0.460 –0.087 成分3 Component 3 0.168 –0.683 –0.116 0.055 –0.108 0.169 0.670 成分4 Component 4 0.340 –0.237 –0.480 0.031 0.462 0.429 –0.446 10日龄 10-day-old 成分1 Component 1 0.418 0.379 0.380 0.401 0.367 0.383 0.309 成分2 Component 2 0.156 0.240 –0.353 –0.121 –0.438 –0.121 0.756 成分3 Component 3 –0.142 –0.496 –0.321 –0.238 0.460 0.494 0.345

表 5 金乌贼早期发育阶段不同时期入选成分的特征向量 Table 5 Principal eigenvector of S. esculenta at early different developmental stages

红珠与黑珠期第1主成分贡献率为71.489%，贡献率较大的为体重、壳长和壳重特征向量，且体重与壳长、壳重间呈显著正相关，可将其称为质量因子；第2主成分的贡献率为9.547%，贡献率较大的为胴宽和壳宽特征向量，可以称为宽度因子，其中，壳宽特征向量为负值，说明这段时期胴宽越宽，则壳宽越窄；第3主成分的贡献率为7.946%，贡献率较大的为生长纹数生长向量，可以称为层数因子，且其特征值为负，说明此时期金乌贼幼体增长速度越快，骨板形成速度越慢。前3个主成分的累计贡献率为88.983%。

心跳期，第1主成分的贡献率为58.886%，贡献较大的为胴宽、体重、壳长、壳宽和生长纹数5个特征向量，可以称之为质量–层数因子，其中，生长纹数特征向量最大，说明这个时期金乌贼幼体内壳骨板快速形成，伴随着骨板的形成，壳长和壳宽也开始快速增长；第2主成分的贡献率为15.159%，贡献率较大的为胴腹长特征向量(长度因子)；第3主成分的贡献率为12.183%，贡献率较大的为胴宽特征向量(宽度因子)，且其特征值为负，这个时期胴宽的增长速度缓慢。前3个主成分的累计贡献率为86.228%。

出膜期，第1主成分的贡献率为71.879%，贡献率较大的为胴宽、壳长、壳宽和生长纹数，可以称之为长度因子，与心跳期相比，第1主成分仍有壳长、壳宽和生长纹数，但其特征值所占比重已有所下降，说明出膜期内壳形成速度较心跳期有所减慢；第2主成分的贡献率为9.361%，贡献率较大的为胴腹长和体重特征向量，可以称之为长度因子，这个时期胴腹长仍在缓慢增长，而体重也在缓慢增长，但增长速度较心跳期有所下降；第3主成分的贡献率为5.889%，贡献率较大为壳重特征向量，可以称之为质量因子。前3个主成分的累计贡献率为87.129%。

初孵化幼体期，第1主成分的贡献率为61.927%，贡献率较大的为体重、壳长特征向量，可以称之为长度因子，孵化后的金乌贼幼体的胴腹长和壳长都快速增长，而且伴随着胴腹长和壳长的快速增长，体重和壳重也快速增长；第2主成分的贡献率为13.390%，贡献率较大的为胴宽和壳重特征向量，可以称之为宽度因子，说明这个时期胴宽仍处于明显的增长趋势；第3主成分的贡献率为8.988%，贡献率较大的为胴腹长和壳宽特征向量，可以称之为宽度因子，这个时期壳宽还在增长，但增长速度减慢；第4主成分的贡献率为5.830%，贡献率较大的为生长纹数特征向量，可以称之为层数因子。前4个主成分的累计贡献率为90.145%。

5日龄时期，第1主成分的贡献率为53.716%，贡献率较大的为体重、壳长和壳宽特征向量，可以称之为长度因子，这个时期体重和壳长仍然快速增长；第2主成分的贡献率为14.026%，贡献率较大的为胴腹长特征向量，可以称之为长度因子，这个时期胴腹长仍处于明显的增长趋势，但较初孵化幼体时期已有所减慢；第3主成分的贡献率为11.465%，贡献率较大的为胴宽和纹数特征向量，可以称之为宽度因子，其中，胴宽特征向量值为负，而生长纹数特征向量为正，说明生长纹数越大，胴宽越小；第4主成分的贡献率为8.932%，贡献率较大的为壳宽和壳重特征向量，可以称之为宽度因子。前4个主成分的累计贡献率为88.140%。

10日龄时期，第1主成分的贡献率为69.668%，贡献率较大的为胴腹长和壳长特征向量，可以称之为长度因子，其中，体重和胴宽的特征值也较大，说明随着胴腹长和胴宽的增长，体重也快速增长；第2主成分的贡献率为10.638%，贡献率较大的为纹数特征向量，可以称之为层数因子；第3主成分的贡献率为7.506%，贡献率较大的为胴宽、壳宽和壳重特征向量，可以称之为宽度因子，其中，胴宽的特征值为负，而壳宽的特征值为正，说明胴宽越大的金乌贼幼体，其个体壳宽越小。前3个主成分的累计贡献率为87.811%。

人工养殖是补充金乌贼资源的有效方法，但金乌贼幼体生长生物学知识的缺乏使得目前人工培育幼体的成活率较低，而研究金乌贼内壳的形态学发育对提高幼体成活率具有重要参考价值。本研究发现，在金乌贼发育早期的6个不同时期，内壳形态学各性状的生长速率存在一定差异，出膜前(红珠与黑珠期和心跳期)质量因子的增长优于长度因子的增长，而出膜后(出膜期至10日龄时期)长度因子的增长优于质量因子的增长，但其中代表内壳发育的壳长都是最重要的参数。对于其他指标，本研究采用了主成分分析法，该方法是将原来众多具有一定相关性的指标，重新组合成一组新的互相无关的综合指标来代替原来指标的一种多元分析方法(余锦华等, 2005)。它可以反映多个实测指标的主要信息，在进行分析与评价指标变量时，能够切断相关的干扰，找出主导因素，从而做出更为准确的估计与评价(蔺宏凯等, 2010)。目前，在水产动物中，主成分分析法主要用于研究群体系统分类(刘晓慧等, 2015; 孙诗萌等, 2015; 郑汉丰等, 2005)，而对头足类生长性状的主成分分析鲜见报道，国内仅见凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) (何铜等, 2009)、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus) (王燕飞等, 2014)、翘嘴鲌(Siniperca chuatsi) (窦亚琪等, 2014)、高体革鯻(Scortum barcoo) (于飞等, 2009)等的相关研究。本研究是首次尝试用主成分分析法分析金乌贼的内壳形态学特征。

按照主成分分析中关于累计贡献率和特征向量的生物学含义，累计贡献率为各复合性状相对于所有复合性状对于遗传方差的贡献的百分率；特征向量表示对复合性状贡献的大小，其绝对值反映了各性状对该主成分作用的大小和性质(耿社民等, 1997)。体尺性状与体重性状均属于数量性状，是环境和遗传因素共同作用的结果，是动物遗传选育重要的表型性状与体型外貌的量化指标(蔺宏凯等, 2010)。本研究由不同时期生长性状的相关分析可知，红珠与黑珠期、出膜期和10日龄期各生物性状间均呈显著性正相关，心跳期、初孵化幼体期和5日龄时期部分性状间相关性不显著。相关分析虽然可以了解各生长阶段不同性状参数的相互关系，但无法消除性状间彼此相关而造成的信息重叠，为此，进行主成分分析，将复杂的数据综合成几个简单的综合性状(侯建君等, 2006)。本研究不同时期主成分分析结果见表 6，从表 6可以看出，金乌贼早期发育阶段不同时期主成分有所不同，同一主成分在不同时期所占的比重也不同。第1主成分在前2个时期为质量因子，后4个时期为长度因子；第2主成分主要为长度因子和宽度因子；第3主成分大部分为宽度因子；第4主成分只有2个时期存在，分别为层数因子和宽度因子。同时主成分分析结果表明，大部分时期只要抓住前3个主成分，就能抓住7个生长指标85%以上的信息，红珠与黑珠期和心跳期质量的增长优于形态特征的增长，而从出膜期至10日龄时期形态特征的增长优于质量的增长。分析原因可能是，幼体出膜后为了躲避天敌和主动摄食，将能量主要用于运动器官和摄食器官的形成，这种现象被称为异速生长，并且在其他物种中已经得到证实(单秀娟等, 2009; 马境等, 2007)。在所有时期中，第1主成分所占的贡献率均在总的贡献率的50%以上，说明它是金乌贼早期个体形态性状变异的主要来源，由于生物体各性状间存在遗传相关，一个性状的改变会导致另一个性状的选择反应，因此，在选育工作中可根据第1主成分为主进行选择，也就是在出膜前(红珠与黑珠期、心跳期)以体重为重要的形态性状选择指标，出膜后(出膜期、初孵化幼体期、5日龄期和10日龄期)则以内壳壳长和胴腹长为重要的选择指标，依此可提高金乌贼的选育效率。

表 6(Tab. 6)

表 6 金乌贼早期发育阶段不同时期的主成分 Table 6 Principal components of traits of S. esculenta at early different developmental stages 时期 Stages 第1主成分 First principal component 第2主成分 Second principal component 第3主成分 Third principal component 第4主成分 Fourth principal component 红珠与黑珠期Red-bead and black-beads stage 质量因子 Quality factor 宽度因子 Width factor 层数因子 Layer factor - 心跳期 Heart-beating stage 质量–层数因子 Quality-layer factor 长度因子 Length factor 宽度因子 Width factor - 出膜期Hatching stage 长度因子Length factor 长度因子Length factor 质量因子Quality factor - 初孵化幼体 Newly-hatched larvae 长度因子 Length factor 宽度因子 Width factor 宽度因子 Width factor 层数因子 Layer factor 5日龄5-day-old 长度因子Length factor 长度因子Length factor 宽度因子Width factor 宽度因子Width factor 10日龄10-day-old 长度因子Length factor 层数因子Layer factor 宽度因子Width factor -

表 6 金乌贼早期发育阶段不同时期的主成分 Table 6 Principal components of traits of S. esculenta at early different developmental stages