美洲黑石斑鱼(Centropristis striata)属鮨科(Serranidae)、石斑鱼亚科(Serraninae)，又名条纹锯鮨、黑锯鮨，通称黑石斑，有翡翠斑、珍珠斑、天星斑、宝石斑等多种美名，是美国东部沿海重要的商业捕捞对象、游钓鱼种和观赏鱼类，曾是我国北方工厂化和南方网箱重要的养殖品种之一(王波等, 2003)。随着我国石斑鱼产业逐渐进入规模化养殖阶段，石斑鱼的各种病害也随着养殖规模的扩大呈现迅速上升的势头，经常造成大面积死亡，给养殖业主带来巨大经济损失，严重制约了石斑鱼养殖业的发展。我国已报道的养殖石斑鱼致病性细菌有创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、溶藻弧菌(V. alginolyticus)、河流弧菌(V. fluvialis)、哈维氏弧菌(V. harveyi)、产气单胞杆菌(Aeromonas sp.)、鲨鱼弧菌(V. cardhariae)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)、不动杆菌(Acinetobacter spp.)等(刘秀珍等, 1994; 朱传华等, 2000; 鄢庆枇等, 2001; 覃映雪等, 2004; 吴定虎等, 1989)。

2015年6月，烟台天源水产有限公司养殖的一批2龄美洲黑石斑鱼，患有“突眼病”症。本研究对其“突眼症”的病灶部位、肝脏、脾脏、肾脏等组织器官取样，通过生理生化及分子生物学技术手段鉴定，揭示了诱发美洲黑石斑鱼“突眼症”的病原体，为其健康养殖及综合防治提供理论支撑。

2015年8月10日，选取5尾患病的体重为(250±10) g、体长为(22±2) cm的2龄美洲黑石斑鱼个体，暂养于烟台天源水产养殖有限公司。

感染实验选用体重为(8.65±1.15) cm、体长为(11.365±4.415) g的健康美洲黑石斑鱼幼鱼，共计420尾。

取患“突眼症”的濒死美洲黑石斑鱼，在无菌条件下，用75%酒精棉对鱼体消毒后，取出眼球、肝脏、脾脏、肾脏等器官组织，用1.5%的无菌生理盐水冲洗后剪碎。取剪碎的组织，在无菌TSA培养基和TCBS培养基上分别划线分离，在28℃条件下，培养24 h。从眼球、肝脏、脾脏、肾脏等器官组织中，分别分离得到形态特征一致的4株优势菌。经鉴定，它们属同一种(定名为CJG01)，连续纯化培养3代。挑取纯化后的单菌落于TSB液体培养基扩增，在28℃条件下，培养10 h。按照菌液:80%甘油=8:2的比例，将扩增后的菌液保存于灭菌后的80%甘油中，置于–80℃超低温冰箱保种备用。

先用PBS冲洗菌株，再用3%戊二醛固定10 min，碳网沾取后晾干5 min，1%磷钨酸染色3 min，自然状态晾15 min，用日本JEOL电子公司JEM-1200EX透射电镜观察(范文辉等, 2005)。对患有“突眼症”美洲黑石斑鱼个体的眼球、脾脏、肝脏、肾脏等器官组织样品，采用透射电镜和扫描电镜结合检查病毒颗粒(陈超等, 2010)。

将致病菌株用1.5%无菌生理盐水制成3.0× 10⁸ CFU/ml菌悬液(采用酶标仪和平板稀释计数法结合计算)，10倍浓度系列稀释后备用。设6个浓度组(A1、A2、A3、A4、A5和A6)，每个浓度下，设3个平行组(A1.1、A1.2、A1.3; A2.1、A2.2、A2.3; A3.1、A3.2、A3.3; A4.1、A4.2、A4.3; A5.1、A5.2、A5.3; A6.1、A6.2、A6.3)，每平行组20尾幼鱼，共计360尾。空白对照设3个平行组(B1、B2和B3)，每组20尾幼鱼，共计60尾。有效水体19 L的泡沫箱，每天换水1/2，充气暂养7 d后开始实验。养殖环境：水温26–33℃，盐度26–32，溶氧6.1–6.7 mg/L，pH值7.4–8.1。实验组采用肌肉注射攻毒，注射0.1 ml相应浓度的菌液；对照组肌肉注射0.1 ml的1.5%无菌生理盐水，观察并记录幼鱼发病症状及每日死亡尾数，统计3个平行组幼鱼的平均死亡数。取濒死美洲黑石斑鱼幼鱼的眼球、肝脏、脾脏、肌肉等器官组织，再次分离纯化，方法同上。将再次分离纯化的优势菌株制成高浓度(3.0×10⁸CFU/ml)，采用肌肉注射法注射对照组，最后将第2次分离的优势菌株与原菌株一起进行细菌鉴定(范文辉等, 2005)。采用寇氏法计算菌株的半致死浓度LD₅₀(邹玉霞等, 2004)：

式中，X_k为最大对数值，d为相邻两组对数值差，P_i为死亡率，i为分组号。

采用API-20NE和API-20NE自动鉴定系统进行鉴定。并结合生理生化测试盒及相关生理生化鉴定管(青岛海博生物技术有限公司)补充鉴定(吕俊超等, 2009)。

用灭菌牙签挑取单菌落悬浮于50 μl无菌去离子水中，100℃水浴5 min，12000 r/min离心20 min，取1 μl上清液作为PCR反应所用模板DNA(范文辉等, 2005)。

采用扩增16S rDNA序列通用引物，正向引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGG­ CCTGGCTCAG-3'，反向引物1492R：5'-TACGGCTA­ CCTTGTTACGACTT-3'。PCR反应条件：94℃预变性10 min；94℃变性40 s，55℃复性30 s，72℃延伸90 s，35个循环；最后72℃温育7–10 min。PCR产物由上海桑尼生物科技有限公司纯化、测序。根据测序结果，在GenBank中使用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行同源性比较，在网站(http://www.bacterio.net/vibrio.html)选取与哈维氏弧菌同源性较高的10株代表菌株的16S rDNA序列，采用MEGA5.05软件构建系统发育树(Tamura et al, 2011)。

将培养24 h的细菌制成浓度为1.0×10⁸ CFU/ml菌悬液(陈超等, 2010)，取50 μl涂布于TSA培养基平板中(平板直径为90 mm，培养基厚度为4 mm)。用无菌镊子将抗菌素纸片(杭州微生物试剂有限公司)贴于平板中央，每个平板1片，28℃恒温培养24 h。

结果判读：记录纸片周围抑菌圈直径，根据美国临床实验室标准化协会CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)标准，报告细菌对该抗生素是敏感(Susceptible, S)、耐药(Resistant, R)、中介(Intermediate, Ⅰ) (陈佳玉等, 2010)。

患病的美洲黑石斑鱼表现为眼球充血、肿大等症状。病鱼游动、摄食能力下降，最终眼球脱落，患病鱼死亡。经统计分析，美洲黑石斑鱼的“突眼症”死亡率高达90%。用电镜扫描眼球、肝脏、脾脏、肾脏、等器官组织部位，未发现病毒颗粒。在光学显微镜下观察未发现寄生虫。pH、光照、盐度、温度、氨氮、亚硝酸盐等环境因子指标均符合美洲黑石斑鱼的生理生态条件。

CJG01菌落在TCBS平板上呈黄色，边缘光滑，有黏性。革兰氏阴性菌。菌株经电镜负染后观察，菌株呈短杆状，端生单鞭毛。菌株CJG01大小约(2.3–3.4)×(1.52–1.58) μm，鞭毛长约6.0–7.8 μm(图 1)。

图 1(Fig. 1)

图 1 CJG01的菌落和菌体形态 Figure 1 Colonies and cell morphology of the strain CJG01 A.菌株CJG01在TCBS培养基上形成边缘光滑整齐的黄色菌落；B.菌株CJG01的电镜照片(bar=1 μm) A. CJG01 in TCBS medium, bright yellow colonies; B. Electron microscope photograph of CJG01 (bar=1 μm)

菌株CJG01感染美洲黑石斑鱼幼鱼1–2 d，高浓度感染组的幼鱼大量死亡，低浓度感染组下的幼鱼游泳能力、摄食能力下降，肌肉注射部位红肿、鳞片脱落。感染3–5 d，幼鱼肌肉注射部位溃烂，眼球增生；感染6–7 d，肌肉腐烂，眼球脱落，幼鱼死亡(图 2)。

图 1(Fig. 1)

图 2 感染菌株CJG01后的幼鱼发病症状 Figure 2 Symptoms of the C. sriata juvenile infected with CJG01 A.脱鳞；B.皮肤溃烂；C.眼球突出；D.眼球脱落，幼鱼死亡 A. Desquamation; B. Skin eruptions; C. Exophthalmos; D. Eyeball fell off, the fry died

取濒死幼鱼病灶部位显微镜镜检，发现有大量运动细菌(表 1)。解剖观察发现，患病幼鱼的肝脏、肾脏红肿，脾脏肿大，肠道内有淡黄色液体。从患病美洲黑石斑鱼幼鱼的病灶部位处，再次分离得到的优势菌株，其形态和生理生化反应与菌株CJG01一致，将其制成浓度为3.0×10⁸ CFU/ml的菌悬液，感染对照组的美洲黑石斑鱼幼鱼，结果幼鱼全部死亡。优势菌株CJG01诱发了美洲黑石斑鱼“突眼症”，肌肉注射的菌株CJG01的半致死浓度LD₅₀为2.67×10⁵ CFU/ml。

表 1(Tab. 1)

表 1 CJG01对美洲黑石斑鱼幼鱼人工感染实验结果 Table 1 Results of healthy C. sriata juvenile infected with CJG01 分组 Group 注射浓度 Injection concentration(CFU/ml) 尾数 Amount 剂量 Dosage(ml) 日死亡数 Death for each day(ind.) 死亡统计 Death statistics (ind.) 死亡率 Death rate(%) 半致死率 LD50 (CFU/ml) 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d 实验组 Treatment A1 3 × 108 20 0.1 20 0 0 0 0 0 0 20 100 A2 3×107 20 0.1 18 0 1 0 0 0 0 19 95 A3 3×106 20 0.1 16 0 0 1 0 0 0 17 85 2.67×105 A4 3×105 20 0.1 8 1 0 0 1 0 0 10 50 A5 3×104 20 0.1 4 0 0 1 0 0 0 5 25 A6 3×103 20 0.1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 对照组 Control B 1.5%NaCl 20 0.1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

表 1 CJG01对美洲黑石斑鱼幼鱼人工感染实验结果 Table 1 Results of healthy C. sriata juvenile infected with CJG01

菌株CJG01生理生化特性为革兰氏阴性，对弧菌抑制剂O/129敏感。生长温度为28–37℃，最适温度为28℃，在含盐量为0–5%的TSB培养基可生长，氧化酶反应阳性，鸟氨酸脱羧酶反应阳性，V-P反应阴性，可同化甘露醇、麦芽糖、苹果酸，不能同化葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、癸酸、已二酸、柠檬酸、苯乙酸等，其他理化性质见表 2。参考《伯杰氏细菌鉴定手册》(第九版)、《一般细菌常用鉴定方法》以及相关文献(Cano-Gomez et al, 2009; 毛芝娟等, 2002)等资料，证实菌株CJG01与哈维氏弧菌的各项生理生化特性一致。

表 2(Tab. 2)

表 2 菌株CJG01生理生化特征 Table 2 Physiological and biochemical characteristics of CJG01 项目Items 菌株CJG01 Strain CJG01 革兰氏阴性Gram negative - 运动性Motility + O/129 (10 μg/piece) S O/129 (150 μg/piece) S 4℃生长Growth at 4℃ - 15℃生长Growth at 15℃ - 28℃生长Growth at 28℃ + 37℃生长Growth at 37℃ + 42℃生长Growth at 42℃ - 0 NaCl生长Grow at 0 NaCl + 4% NaCl生长Grow at 4% NaCl + 5% NaCl生长Grow at 5% NaCl + 6% NaCl生长Grow at 6% NaCl - KNO3 + 色氨酸Tryptophan + 葡萄糖酸化Glucose oxidation + 精氨酸Arginine - 脲素Urea + 七叶灵Esculin - 明胶Gelatin - 对硝基-β-D甲基半乳糖 p-nitrophenyl-β-D- galactopyranoside + 葡萄糖同化Glucose assimilation - 阿拉伯糖Arabinose - 甘露糖Mannose - 甘露醇Mannitol + N-乙酰-葡萄糖胺N-Acetylglucosamine - 麦芽糖Maltose + 葡萄糖酸盐Gluconate + 癸酸Capric acid - 已二酸Adipate - 苹果酸Malic acid + 柠檬酸Citric acid - 苯乙酸Phenyl acetic acid - 氧化酶Oxidase + 鸟氨酸脱羧酶Ornithine decarboxylase + V-P反应Voges-Proskauer reaction - 赖氨酸脱羧酶Lysine decarboxylase + 丙二酸Malonate - 蔗糖Sucrose + 海藻糖Trehalose + 纤维二糖D-cellobiose + L-天门冬素芳胺酶 L-Aspartic acid arylamidase - -：阴性；+：阳性；S：敏感 -: Negative; +: Positive; S: Susceptible

表 2 菌株CJG01生理生化特征 Table 2 Physiological and biochemical characteristics of CJG01

菌株CJG01的16S rDNA序列长度为1424 bp (图 3)，BLAST同源比对结果显示，其与哈维氏弧菌的同源性高达99%。从NCBI核酸数据库中，选取10株水产动物致病菌株的16S rDNA基因序列进行系统发育树分析，并采用MEGA5.05软件构建发育树(图 4)。可以看出，该菌株于哈维氏弧菌的亲缘关系最为接近。可认定菌株CJG01为哈维氏弧菌。

图 1(Fig. 1)

图 3 菌株CJG01的16S rDNA PCR产物琼脂糖电泳 Figure 3 Agarose electrophoresis of 16S rDNA amplified products of CJG01 1. DNA marker；2.阴性对照；3.鳗弧菌阳性对照；4. 16S rDNA产物 1. DNA marker; 2. Negative control; 3. Vibrio anguillarum positive control; 4. 16S rDNA product

图 1(Fig. 1)

图 4 基于菌株CJG01的16S rDNA序列构建的系统发育树 Figure 4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of CJG01

菌株CJG01对28种药物的敏感性结果显示(表 3)，该菌株对氨苄西林、头孢氨苄、头孢拉定、诺氟沙星、青霉素、多粘菌素B、阿奇霉素等药物不敏感，对头孢唑林、恩诺沙星、链霉素、红霉素、克拉霉素等药物中度敏感，对头孢哌酮、头孢曲松、头孢他啶、氧氟沙星、洛美沙星、氟罗沙星、环丙沙星、氯霉素、新生霉素、新霉素、庆大霉素、卡那霉素、呋喃唑酮、利福平、四环素、米诺环素等药物敏感。

表 3(Tab. 3)

表 3 菌株CJG01对抗菌药物的敏感性 Table 3 The sensitivity of CJG01 to antimicrobial agents 药物 Drugs 药片浓度 Concentration of drug(μg/g) 抑菌圈直径 Diameters of microbiostatic circle (mm) 敏感性 Sensitivity 氨苄西林Ampicillin 10 0 R 头孢氨苄Cephalexin 30 9 R 头孢唑林Cefamezin 30 17 I 头孢拉定Cefradine 30 10 R 头孢哌酮Cefoperazone 75 22.5 S 头孢曲松Ceftriaxone 30 27 S 头孢他啶Cefoperazone 30 23.5 S 氧氟沙星 Ofloxacin 5 17 S 洛美沙星 Ciprofloxacin 10 23 S 恩诺沙星 Enrofloxacin 5 19 I 氟罗沙星 Fleroxacin 5 29 S 诺氟沙星Norfloxacin 10 7 R 环丙沙星Ciprofloxacin 5 23.5 S 氯霉素Chloroamphenicol 30 24 S 新生霉素Novobiocin 30 23 S 新霉素Neomycin 30 25 S 链霉素Streptomycin 10 12 I 青霉素Penicillin 10 0 R 红霉素Erythromycin 15 17 I 庆大霉素Gentamicin 10 15 S 卡那霉素Kanamycin 30 18 S 克拉霉素 Clarithromycin 15 14 I 阿奇霉素 Azithromycin 15 12 R 多粘菌素B Polymyxin B 300 0 R 呋喃唑酮 Furazolidone 300 18 S 利福平Rifampicin 5 24 S 四环素Tetracycline 30 24 S 米诺环素Minocycline 30 33 S S：敏感；R：耐药；I：中介 S: Susceptible; R: Resistant; I: Intermediate

表 3 菌株CJG01对抗菌药物的敏感性 Table 3 The sensitivity of CJG01 to antimicrobial agents

弧菌是海洋环境中最常见的细菌群之一，广泛分布于河口近岸、海区、淡水和生物体中(何苹萍等, 2013)，其致病性受宿主的生理状态及水质环境条件等综合因素的影响较大，是一类条件致病菌(郑天伦等, 2002)。在养殖过程中，因过量投饵和养殖鱼类的排泄物引起底质极端恶化，使水体中的氨氮、硫化氢含量显著升高，养殖水体溶氧显著下降，在恶劣的气候条件下，如夏季闷热无风或突降暴雨的天气，盐度和pH值急剧变化；宿主受到病毒、真菌、寄生虫等的感染和侵害，宿主机能下降，病原弧菌大量侵入宿主，弧菌疾病的暴发(胡超群等, 2010; 金珊等, 2005; 杨少丽等, 2005)。海水鱼类弧菌疾病流行温度为25–32℃(赵桂林等, 2014)范围。本研究证实，环境温度低于15℃时，哈维氏弧菌的增殖得到抑制，当温度达到28–37℃时，菌落迅速扩增，在含有0–5% NaCl的TSB培养基能够生长。

本研究的菌株CJG01经过电镜负染，观察到菌株CJG01呈短杆状，端生单鞭毛；革兰氏染色为阴性，在TCBS培养基上为黄色，边缘透明，中间隆起，有黏性；对弧菌抑制剂O/129敏感，氧化酶反应阳性。采用API-20NE鉴定系统以及相关生理生化鉴定管对分离的菌株CJG01进行生理生化特征比较分析，得出其生理生化特性与哈维氏弧菌一致(陈献稿等, 2004; 林克冰等, 1999)。为进一步确认菌株CJG01的分类学地位，采用BLAST比对其16S rDNA序列，证实菌株与哈维氏弧菌的同源性高达99%，确认菌株CJG01为哈维氏弧菌。最新16S rDNA系统发育学分析比较细菌核糖体DNA基因片段的同源性，实现对细菌的分类学鉴定，理论上具有很好的可靠性，但截止到1996年，只测定了3500余种细菌的完整16S rDNA序列，给鉴定结果的准确性带来很大的影响，如果没有生理生化鉴定结果作为佐证，可能无法得出准确的结论。因此，在进行生物物种鉴定时采用多种方法，取长补短，相互补充，保证鉴定结果的客观性和科学性(陈晓燕等, 2003; 范文辉等, 2005)。本次致病菌的感染实验证实了哈维氏弧菌是引发美洲黑石斑鱼突眼病的条件致病菌之一。

养殖过程中弧菌病害时有发生，且流行于多个国家和地区，是许多养殖鱼类的病原菌(Harikrishnan et al, 2010; 黄志坚等, 2002; 金珊等, 2005; 林克冰等, 2014; 罗鸣等, 2013)。研究表明，哈维氏弧菌通过分泌溶血素、蛋白酶及脂多糖来破坏宿主组织(王海阳等, 2014)。本研究证实，哈维氏弧菌侵染肌肉组织后，染病部位出现脱鳞、肌肉溃烂，严重的可见骨骼外露；伴随烂尾、突眼等症状。解剖鱼的内脏，可在肝脏、肾脏、脾脏等组织中分离出致病菌。解剖发现，肝脏、脾脏、肾脏充血严重，小肠内有黄色液体流出。有研究证实，哈维氏弧菌可导致鱼的病变组织，如头肾、脾、胸腺、肝、粘膜淋巴组织和肠的上皮细胞出现不同程度的变性及坏死，细胞超微病变观察发现，这些组织的线粒体出现空泡化(任红梅等, 2011)。肾小管上皮细胞变性、坏死；颗粒细胞的细胞核核膜部分溶解；脾窦和脾索分界不明显；脾颗粒细胞核核膜溶解，胸腺中有较多空泡；肝细胞胞浆内脂滴积累多；肠绒毛萎缩，肠上皮细胞胞质多数线粒体、内质网等相互聚集固缩，粘膜上皮细胞坏死、脱落(徐晓津等, 2009)等现象。本人工感染实验中，采用肌肉注射攻毒美洲黑石斑鱼幼鱼，出现了较高的死亡率，半致死浓度LD₅₀=2.67×10⁵ CFU/ml。证实了哈维氏弧菌是毒性很强的致病菌，具有很强的致病性。哈维氏弧菌引起石斑鱼突眼病的病原体的研究报道较少，国内外主要是对其生理生化特性以及病理做了研究，对于其致病因子，致病机理等需要今后做进一步的研究。