大西洋鲑(Salmo salar)是一种营养价值较高的世界性养殖鱼类，其肉质鲜美、富含必需脂肪酸和类胡萝卜素，被公认为天然的绿色食品。由于野生资源有限，目前市场上销售的大多数大西洋鲑来自人工养殖。而养殖过程中的人工管理操作和长期饱食投喂配合饲料对鱼体的生理功能造成不利影响，导致其免疫力和生长速度降低。微生态制剂通过改善宿主肠道微生态平衡、提供营养物质、刺激免疫功能等作用，可以提高养殖动物的生产性能(张艳等, 2005)，是近年来促进养殖鱼类生长和健康类物质的研究热点之一。

不同种类的益生菌对机体的作用机制不同，复合添加通常能够达到作用互补或增强的效果(Oelschlaeger, 2010; 赵剑闯等, 2010)。目前，市场上已存在的微生态制剂多为两种或两种以上益生菌的复合制剂，饲料行业应用最为广泛的益生菌种类主要包括芽孢杆菌(Bacillus)、乳酸菌以及酵母菌(徐鹏等, 2012)，其中，芽孢杆菌或乳酸菌的单一或复合添加剂是近年来国内外的研究热点，而关于芽孢杆菌和酵母菌复合添加对鱼体影响的研究则较为少见。本文通过研究饲料中添加不同剂量芽孢杆菌和酵母菌复合发酵菌剂对大西洋鲑的生长性能、消化率、消化酶活性和非特异性免疫能力的影响，探究复合益生菌制剂的促进效果及其在饲料中的适宜添加量，为其在生产中应用提供依据。

从2014年山东东方海洋科技股份有限公司培育的降海后的大西洋鲑中，选择420尾规格一致、体质健康、体重为(180±28) g的大西洋鲑，随机分为4组，分别为对照组和3个添加不同水平复合益生菌剂的实验组，每组3个重复，每个重复35尾，置于12个独立的的室内循环水养殖系统。实验期为42 d。

鲑鳟鱼配合饲料购于北京汉业科技有限公司，基础营养成分为水分6.6%、粗蛋白44.2%、粗脂肪22.4%、灰分10.6%。

复合益生菌制剂(Complex-probiotic-preparation, BSCP)为解淀粉芽孢杆菌CGMCC 10149菌株(Bacillus amyloliquefaciens V4 CGMCC 10149) 和胶红酵母菌CGMCC 1013菌株(Rhodotorula mucilaginosa CGMCC 1013) 的混合发酵液，其中，解淀粉芽孢杆菌为具有抗杀鲑气单胞菌的筛选菌株。两种益生菌均采用LB培养基分别发酵培养，以1:1比例混合后测得混合发酵液中芽孢杆菌含量为2.5×10⁹ CFU/ml，酵母菌含量为10×10¹⁰ CFU/ml，菌液干物质含量约为4.1%，由中国科学院微生物研究所提供。BSCP以体积(ml)/饲料重(g)分别为1%、3%和5%的剂量喷洒到饲料中，晾干。菌液和饲料储存于4℃冰箱备用。

大西洋鲑于小型室内封闭循环水系统养殖，每个养殖池水体为300 L，初始养殖密度约为21 kg/m³。实验鱼暂养14 d，基本恢复正常后开始正式实验，每天08:00和15:00饱食投喂2次，投喂率为1.0%–1.4%，每次投饵后排污，记录饲料残饵数、投喂量、死亡数和水温。每5 d测定一次氨氮和亚硝氮。养殖用水为恒温的地下岩层过滤海水，水质优良。实验期间水温为9–12℃，溶解氧 > 7 mg/L，氨氮 < 0.6 mg/L，亚硝氮 < 0.3 mg/L。

实验初始和结束时，称重每池全部实验鱼。正式实验开始后，每7 d收集每个养殖池粪便，用于测定饲料表观消化率。投喂实验结束时，每池随机取3尾大西洋鲑，用50 mg/L的MS-222麻醉后尾静脉抽血，血液置于肝素钠润湿的2 ml离心管中，4000 r/min离心15 min，取上清液，用于非特异性免疫指标的测定。抽血后鱼体解剖，取肠道和肝脏，去除脂肪组织，于–80℃冰箱保存。

粗酶液制备：将上述组织解冻，称重后加入9倍体积的0.9%无菌生理盐水，组织匀浆机以11000 r/min匀浆2 min，然后3000 r/min离心10 min，取上清液，保存于–80℃，用于测定消化酶和非特异性免疫指标。

表观消化率采用4 mol/L盐酸不溶性灰分法进行测定(Vandenberg et al, 2008)。组织总蛋白含量、消化酶活性和非特异性免疫指标均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。蛋白酶活力测定采用福林–酚法，淀粉酶活力测定采用碘–淀粉比色法，脂肪酶活力测定采用化学比浊法，溶菌酶活力测定采用自身对照法，酸性磷酸酶(Acid phosphatase, ACP)和碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)活性测定采用磷酸苯二钠比色法，超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性测定采用黄嘌呤氧化酶法(羟胺法)。

生长性能指标及表观消化率相关计算公式如下：

增重率(%)=(W_t–W₀)/W₀×100

特定生长率(SGR, %)=(lnW_t–lnW₀)/t×100

投喂率(%)=W_f/[(W₀+W_t)/2]/t×100

饲料系数(FCR)=W_f/(W_t–W₀)

死亡率(%)=(N_t–N₀)/N₀×100

干物质表观消化率(%)=(1–A₁/A₂)×100

蛋白质表观消化率(%)=(1–A₁×P₂/A₂×P₁)×100

脂肪表观消化率(%)=(1–A₁×F₂/A₂×F₁)×100

式中，t为养殖天数，W₀和W_t分别为实验初和实验末鱼总体重(g)，W_f为饲料总投喂量(g)，N₀和N_t分别为实验初和实验末鱼体存池数，A₁和A₂分别为饲料和粪便中盐酸不溶性灰分含量，P₁和P₂分别为饲料和粪便中蛋白质含量，F₁和F₂分别为饲料和粪便中脂肪含量。

所有数据均以平均值±标准误(Mean±SE)表示，用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，若存在显著差异，则进行Duncan多重比较，P < 0.05为差异显著。

BSCP对大西洋鲑生长性能的影响见表 1。与对照组相比，大西洋鲑投喂添加1%–5% BSCP的饲料42 d后，增重率和SGR均分别升高约21%和16%(P < 0.05)，饲料系数和死亡率分别降低15%和47% (P < 0.05)。1%组和3%组总摄食量和摄食率较对照组高17%和13%(P > 0.05)，5%组高于前三者，且具有显著性差异(P < 0.05)。

表 1(Tab. 1)

表 1 复合益生菌制剂对大西洋鲑生长性能的影响 Table 1 Effects of the BSCP on the growth performance of Atlantic salmon (n=3, Mean±SE) 项目Items 对照组 Control group 1%组 1% group 3%组 3% group 5%组 5% group 初均重Initial weight (g) 181.80±1.61 182.39±2.58 177.13±1.23 179.39±2.20 末均重Final weight (g) 303.19±5.72b 328.24±6.37a 320.60±5.29ab 325.17±3.66a 总摄食量Total feed intake (kg) 3.69±0.10b 4.37±0.17ab 4.29±0.20ab 4.46±0.06a 摄食率Feed intake rate (%) 1.13±0.03b 1.27±0.04ab 1.28±0.03ab 1.32±0.02b 增重率Weight gain rate (%) 66.85±4.50b 80.12±5.80a 81.01±3.35a 81.27±0.67a 饲料系数Feed coefficient 1.15±0.06a 0.96±0.01b 0.96±0.02b 1.01±0.10b 特定生长率Specific growth rate (%/d) 1.22±0.06b 1.40±0.13a 1.41±0.04a 1.42±0.10a 死亡率Mortality rate (%) 9.52±1.90a 4.76±0.95b 4.76±0.95b 5.71±0.85b 注：同行肩标不同小写字母者表示差异显著(P < 0.05) Note: In the same line, values with different superscripts were significantly different (P < 0.05)

表 1 复合益生菌制剂对大西洋鲑生长性能的影响 Table 1 Effects of the BSCP on the growth performance of Atlantic salmon (n=3, Mean±SE)

BSCP对大西洋鲑的饲料表观消化率的影响见表 2。与对照组相比，大西洋鲑投喂5%的BSCP后，蛋白质表观消化率升高8%(P < 0.05)，但其脂肪的表观消化率显著降低0.4%(P < 0.05)，而1%组和3%组与对照组无显著差异(P > 0.05)。投喂BSCP使鱼体饲料干物质的表观消化率呈现升高的趋势，但各组间无显著差异(P > 0.05)。

表 2(Tab. 2)

表 2 复合益生菌制剂对大西洋鲑饲料表观消化率的影响 Table 2 Effects of the BSCP on the apparent digestibility coefficient of Atlantic salmon (n=3; Mean±SE; %) 项目Items 干物质Dry-matter 蛋白质Protein 脂肪Lipid 对照组 Control group 69.33±1.88 87.49±0.98b 98.10±0.31a 1%组 1% group 70.59±1.62 88.20±3.25ab 97.83±0.20ab 3%组 3% group 71.01±1.51 92.29±2.70ab 97.93±0.21ab 5%组 5%group 72.16±1.20 94.07±2.28a 97.67±0.08b

表 2 复合益生菌制剂对大西洋鲑饲料表观消化率的影响 Table 2 Effects of the BSCP on the apparent digestibility coefficient of Atlantic salmon (n=3; Mean±SE; %)

BSCP对大西洋鲑消化酶活性的影响见表 3。大西洋鲑投喂BSCP后，肝脏蛋白酶活性均显著升高(P < 0.05)，肠道蛋白酶活性随添加量而升高，3%组和5%组较对照组提高31%(P < 0.05)。肠道和肝脏脂肪酶活性随添加量的升高呈先升高后降低的趋势，3%组肠道和肝脏脂肪酶活性最高且显著高于对照组47%和32%(P < 0.05)，而5%组的肝脏脂肪酶活性却显著低于其他各组(P < 0.05)。复合益生菌对大西洋鲑肝脏和肠道中的淀粉酶活性无显著影响(P > 0.05)。

表 3(Tab. 3)

表 3 复合益生菌制剂对大西洋鲑消化酶活性的影响 Table 3 Effects of the BSCP on the digestive enzyme activities of Atlantic salmon (n=3; Mean±SE; U/mg prot) 项目 Items 对照组 Control group 1%组 1% group 3%组 3% group 5%组 5% group 肠道 Intestinal 淀粉酶Amylase 0.31±0.04 0.27±0.06 0.35±0.05 0.29±0.08 脂肪酶Lipase 42.30±2.86b 54.13±7.79ab 70.21±1.20a 43.93±9.42b 蛋白酶Protease 101.27±13.37b 107.74±12.22b 130.27±12.52a 134.52±9.25a 肝脏 Liver 淀粉酶Amylase 0.42±0.08 0.42±0.08 0.47±0.12 0.45±0.14 脂肪酶Lipase 30.94±4.13b 35.56±3.07ab 41.03±3.84a 23.63±2.35c 蛋白酶Protease 20.25±4.26b 32.55±3.50a 33.12±5.93a 36.07±5.45a

表 3 复合益生菌制剂对大西洋鲑消化酶活性的影响 Table 3 Effects of the BSCP on the digestive enzyme activities of Atlantic salmon (n=3; Mean±SE; U/mg prot)

BSCP对大西洋鲑非特异性免疫指标的影响见表 4。投喂大西洋鲑BSCP 42 d后，血清和肝脏SOD活性随添加量的升高呈先降后升的趋势，3%组最低，较对照组显著降低(P < 0.05)。5%组肝脏ACP显著高于对照组和1%组(P < 0.05)，与3%组无显著差异(P > 0.05)。随着复合益生菌剂量的增加，肝脏溶菌酶和AKP的活性呈先升后降的趋势，且1%和3%组溶菌酶活性显著升高(P < 0.05)。BSCP对大西洋鲑血清溶菌酶、ACP和AKP的活性均无影响(P > 0.05)。

表 4(Tab. 4)

表 4 复合益生菌制剂对大西洋鲑非特异性免疫指标的影响 Table 4 Effects of the BSCP on the nonspecific immune indices of Atlantic salmon (n=3; Mean±SE) 项目Items 对照组 Control group 1%组 1% group 3%组 3% group 5%组 5% group 血清 Serum (U/ml) 溶菌酶Lysozyme 16.51±3.46 14.46±1.15 15.88±1.66 14.29±1.12 酸性磷酸酶Acid phosphatase 5.63±0.54 6.17±0.54 5.70±0.33 6.12±0.40 碱性磷酸酶Alkaline phosphatase 21.31±4.10 20.75±2.77 22.08±3.05 20.48±1.64 超氧化物歧化酶Superoxide dismutase 85.12±5.86a 78.84±6.97ab 71.42±5.34b 79.32±5.47ab 肝脏 Liver (U/mg prot) 溶菌酶Lysozyme 14.72±1.82b 20.54±1.18a 20.48±3.47a 17.47±1.43ab 酸性磷酸酶Acid phosphatase 140.28±8.20b 139.02±15.67b 161.53±13.25ab 165.46±12.60a 碱性磷酸酶Alkaline phosphatase 27.85±3.55 31.90±2.85 32.46±2.40 28.39±4.35 超氧化物歧化酶Superoxide dismutase 92.57±14.56a 93.03±8.38a 71.99±3.95b 82.07±6.74ab

表 4 复合益生菌制剂对大西洋鲑非特异性免疫指标的影响 Table 4 Effects of the BSCP on the nonspecific immune indices of Atlantic salmon (n=3; Mean±SE)

不同种类的益生菌所具有的生理特性不同，其在体内发挥的主要作用也有所差异(Oelschlaeger, 2010)。芽孢杆菌具有稳定性好、抗逆性强、存活率高等特点(李海兵等, 2008)，在极端环境下可以形成孢子。本研究中，复合发酵菌液中的活性芽孢杆菌喷洒到饲料表面以后，由于环境不适，会以孢子形式进入鱼体消化道，在肠道迅速萌发成营养型菌体(周小辉等, 2009)，进而发挥其所具有的多种作用。酵母菌由于其结构的特殊性，具有较好稳定性，能耐受高酸环境，进入肠道后可以合成多种营养素和消化酶(李海兵等, 2008; 楚杰等, 2006)，且本身含有多种益生因子，是良好的功能性营养型饲料添加剂，芽孢杆菌和酵母菌复合投喂的效果明显优于单一菌种。

投喂益生菌可以促进养殖动物的生长性能已得到广泛证实。芽孢杆菌单独或配合多糖使用能够明显促进鲟鱼(Acipenser baeri) (刘晓勇等, 2011; 高欣等, 2009)、鲫鱼(Carassius auratus)(刘波等, 2006)、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)(李丽鹃等, 2013)和罗非鱼(Oreochromis niloticus)(付天玺等, 2008)等多种鱼类的生长，活性酵母菌或其干粉对重口裂腹鱼(Schizothorax davidi)(何敏等, 2008)、罗非鱼(Abu-Elala et al, 2013)和中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)(陈昌福等, 2005)等的生长也具有类似的促进作用。本研究中，大西洋鲑投喂芽孢杆菌和酵母菌的复合发酵液后，生长性能得到显著升高，摄食率明显升高，饵料系数降低，与上述研究的结果相似。

益生菌的促生长机理包含多个方面，其中一个非常重要的方面是其本身能够分泌多种消化酶，并能够通过促进肠道中其他益生菌的繁殖间接促进消化酶的分泌，增强营养物质的消化吸收(李文华等, 2013; 李桂英等, 2013)，从而使大西洋鲑肠道中蛋白酶和脂肪酶的活性明显升高，尤其是益生菌制剂添加水平达到3%以上的组。益生菌分泌的消化酶使鱼体对摄入饲料的消化吸收加快，促进肠道食糜排空，使大西洋鲑的摄食率提高。鱼体为了适应摄食量的增加对消化机能进行适应性改变，促使肝脏中消化酶的合成水平适应性升高(Stumpf et al, 2014)，因此，投喂BSCP后大西洋鲑肝脏中的蛋白酶活性显著升高。这使其对肠道内蛋白质的消化吸收更加充分，饲料干物质和蛋白质的表观消化率提高，饲料系数降低。

值得注意的是，投喂5%水平BSCP的大西洋鲑肝脏脂肪酶活性略有降低，其对脂肪的消化率也显著降低，这种现象可能是由于投喂的益生菌促进了肠道内乳酸杆菌的增殖(刘波等, 2006)。在对哺乳动物的研究中，发现乳酸菌具有降低脂肪吸收的作用，其作用机理是乳酸菌能够抑制胰脂肪酶的活性(Matsumura, 2010)，这可能在某种机理上影响了鱼体肝胰脏脂肪代谢相关酶的基因表达(Qiao et al, 2015)，进而影响了肝脏脂肪酶的活性，但具体的作用机理尚需进一步研究。这种现象表明，对鱼体投喂不适剂量的益生菌可能对某些生理功能产生不利影响。

芽孢杆菌和酵母菌含有的抗原类物质具有诱导刺激动物机体先天性免疫的作用，能够增强机体的抗病菌感染能力(刘宗英等, 2005; Selim et al, 2015)。本研究中投喂益生菌后大西洋鲑肝脏溶菌酶和ACP活性升高，这表明肝脏中巨噬细胞的分泌和吞噬活性增强。

机体内SOD的活性变化与超氧阴离子自由基水平有关，后者主要来源于吞噬细胞清除细菌时呼吸爆发产生(邢宇坤等, 2004)，因此，在正常生理条件下，SOD的活性变化与侵染宿主的病原菌数量有一定的关系。本研究中，投喂3%的复合益生菌制剂后大西洋鲑SOD活性显著降低，这与Tovar-Ramírez等(2010)研究中饲喂黑鲈(Dicentrarchus labrax)活性酵母菌后SOD活性及其表达量降低的结果一致。其具体机理可能是益生菌具有抑制肠道有害菌的作用，投喂芽孢杆菌和酵母菌提高了肠道内有益菌的数量(刘波等, 2006; 何敏等, 2008)，使肠道中有害菌的数量及其侵染机会减小，鱼体呼吸爆发的频率降低，SOD活性伴随超氧阴离子水平的降低而降低。在对同一实验的菌群结构研究中发现，大西洋鲑肠道中芽孢杆菌和乳酸菌的比例增加，而弧菌的比例有所降低，表明了以上论述的可能性。然而，添加5%水平的复合益生菌制剂后SOD活性有所升高，其原因可能是过量投喂益生菌扰乱了肠道微生态平衡。

本研究与众多学者研究结果不同的是，投喂益生菌后大西洋鲑血清中大部分非特异性免疫指标均无明显的变化，推测可能与养殖环境和鱼体生理状态有关。血清免疫指标代表整个机体在某一条件下所处的免疫状态，其在无应激状态下一般处于正常水平，而在受到较严重的刺激后可表现出波动性的变化。本研究中，大西洋鲑所处养殖条件较佳，应激因子极少，这可能是造成其血清免疫指标无明显差异的原因。而在后续的杀鲑气单胞菌攻毒实验24 h后，血清各项非特异性免疫指标均有所上升，与上述规律相符。

综上所述，饲料中添加芽孢杆菌和酵母菌的复合益生菌制剂可以提高大西洋鲑某些消化酶和肝脏非特异性免疫酶的活性，进而可以显著促进大西洋鲑的生长，提高饲料蛋白质的消化率，但5%的添加水平不利于大西洋鲑对饲料脂肪的消化吸收。因此，在本实验条件下，复合益生菌制剂的适宜添加水平为3%。