凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)俗称南美白对虾，是目前世界养殖产量最高的三大虾种之一，具有抗逆性强、营养要求低、生长速度快、含肉量大等优点(储霞玲等, 2008)。然而，在集约化养殖过程中，密度高、水交换差及环境不稳定等因素，往往引起虾体的应激反应，使其抗氧化能力受损、免疫力下降，导致疾病频发、生长缓慢。各种水产药物的广泛应用引发了社会对养殖对虾食品安全的忧虑，通过营养调控来提高凡纳滨对虾的抗氧化和免疫能力进而提高虾的产量和品质已成为研究的热点。

低分子水解鱼蛋白是一类富含低分子蛋白的寡肽，比高分子物质更易被肠道上皮细胞吸收。林启存等(2010)研究证明，由2–6个氨基酸组成的小肽具有重要的生物学活性，作为促进生长、增强免疫力的营养性添加剂广泛用于畜禽养殖。研究表明，在饲料中添加水解鱼蛋白能提高鱼类的生长、免疫力和对病原的抵抗力(Liang et al, 2006; Tang et al, 2008; Khosravi et al, 2015; 牟玉超等, 2016)。Nazeer等(2012)也证实从红牙鱼(Otolithes ruber)肌肉中提取和制备的水解鱼蛋白在体内外均具有抗氧化活性。

近年来，由于海洋渔业资源的减少和水产养殖的快速发展，导致鱼粉的供应量锐减，而需求量猛增，鱼粉价格飙升，使得养殖成本明显增加，给饲料生产企业和养殖业带来了巨大压力和挑战。因此，亟需寻找替代鱼粉的蛋白资源或技术方案。植物蛋白源因价格低廉且供应稳定，备受研究者关注。但目前的研究表明，饲料中含有较高的植物蛋白会导致水产动物生长缓慢、饲料利用率差、免疫力下降等(Francis et al, 2001; Opstvedt et al, 2003)。其原因，一方面是植物蛋白含抗营养因子、缺乏某些小分子物质，影响了鱼类健康(Rahman et al, 2010; Bulbul et al, 2015; Chiu et al, 2016)，另一个可能的重要因素是植物蛋白在消化过程中低分子肽的释放量和比例与鱼粉明显不同(Aksnes et al, 2006)，影响了动物对蛋白质的吸收。本研究在高豆粕饲料中添加不同水平的小分子水解鱼蛋白，研究其对凡纳滨对虾抗氧化以及相关免疫基因的影响，为对虾配合饲料替代蛋白源研究提供参考。

将新鲜的沙丁鱼(Sardina melanostictus)清洗干净，经组织捣碎机(Retsch GM200)捣碎成糜浆。将糜浆按1: 4的比例加入双蒸水，并用1.2 mol/L的NaOH调至pH为7.5。然后按糜浆重量的0.4%加入木瓜蛋白酶(80万U/g)和胰酶(4000 U/g)(江苏南宁庞博生物工程有限公司)(比例为3: 1)，在恒温磁力搅拌水浴锅里55℃水解8 h。反应结束后，95℃灭活15 min，反应液5000 r/min离心40 min，酶解液经200、1000 Da超滤膜堆装置(世达膜-001A)进行超滤，制成小肽滤液。滤液在真空冷冻干燥机中浓缩冻干、备用。制备的低分子水解鱼蛋白产品采用高效液相色谱仪(HPLC)测得水解鱼蛋白组分(郑珂珂等, 2011)(表 1)。

表 1(Tab. 1)

表 1 低分子水解鱼蛋白的分子量分布 Table 1 Molecular weight of low-molecular-weight fish hydrolysate 分子量 Molecular weight (Da) ＜200 200–500 500–1000 1000–1500 1500–2000 ＞2000 含量 Content (%) 24.10 68.71 4.02 2.92 0.25 0.00

表 1 低分子水解鱼蛋白的分子量分布 Table 1 Molecular weight of low-molecular-weight fish hydrolysate

以鱼粉和豆粕为主要蛋白源，鱼油、豆油和大豆磷脂为脂肪源，小麦面粉为主要糖源，并补充无机盐和维生素等配制基础饲料。以30%鱼粉饲料为高鱼粉对照组，以植物蛋白替代高鱼粉饲料中50%的鱼粉蛋白配制低鱼粉基础饲料，向低鱼粉基础饲料中分别添加0、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%低分子水解鱼蛋白，共配制成6种实验饲料(表 2)。

表 2(Tab. 2)

表 2 实验饲料配方及营养组成(以干物质为基础%) Table 2 Formulation and the proximate chemical composition of the experimental diets (Dry-matter basis %) 原料 Ingredients HFM LFM0 LFM0.5 LFM1.0 LFM1.5 LFM2.0 鱼粉 Fish meal 30.00 15.00 15.00 15.00 15.00 15.00 豆粕 Soybean meal 25.00 47.00 47.00 47.00 47.00 47.00 鱿鱼膏 Squid visceral paste 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 虾粉 Shrimp meal 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 低分子水解鱼蛋白 Low-molecular-weight fish hydrolysate 0.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 小麦粉 Wheat flour 31.00 22.30 21.80 21.30 20.80 20.30 鱼油 Fish oil 1.00 2.20 2.20 2.20 2.20 2.20 大豆油 Soybean oil 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 大豆磷脂 Soybean lecithin 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 氯化胆碱 Choline chloride 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 磷酸二氢钙 Monocalcium phosphate 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 矿物质混合物 Mineral premixa 0.05 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 维生素混合物 Vitamin premix 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 维生素C磷酸酯 L-ascorbate-2-phosphate 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 防霉剂 Mold inhibitor 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 海藻酸钠 Sodium alginate 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 氨基酸混合物 Amino acid mixtureb 0.00 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 乙氧喹啉 Ethoxyquin 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 主要成分 Proximate composition   水分 Moisture 12.97 13.46 11.78 11.35 11.26 12.27   粗蛋白 Crude protein 44.44 44.49 43.68 45.74 45.37 45.56   粗脂肪 Crude lipid 7.59 7.56 7.55 7.55 7.54 7.54 注：a：以占每千克饲料重为标准，含有Mg 233.3 mg、Zn 92.8 mg、Se 40 mg、I 20 mg、Mn 220.1 mg和Cu 128 mg；b：以占总氨基酸量的百分比为标准，赖氨酸占50%、蛋氨酸30%、苏氨酸20%。所有氨基酸为晶体氨基酸 Notes：a: Provided per kg of feed, Magnesium 233.3 mg, Zinc 92.8 mg, Selenium 40 mg, Iodine 20 mg, Manganese 220.1 mg, and Copper 128 mg; b: Provided as percentage of total amino acids, Lysine 50%, Methionine 30%, Threonine 20%. All amino acids were crystal amino acids

表 2 实验饲料配方及营养组成(以干物质为基础%) Table 2 Formulation and the proximate chemical composition of the experimental diets (Dry-matter basis %)

各种实验饲料原料经粉碎，过80目筛网，按配比称量后逐级混合均匀，然后加入适量的水揉匀，经双螺杆制粒机(CD4×1TS多功能催化剂成形机)加工成1.5 mm×2 mm的颗粒状饲料，并在60℃烘干至饲料水分含量约12%，于–20℃冰箱保存备用。

实验所用凡纳滨对虾购于福建省漳州市正大集团育苗场。养殖实验在集美大学水产实验场中进行。正式实验前，凡纳滨对虾暂养于2个1000 L的水族箱中，以实验低鱼粉基础饲料投喂2周，待其适应实验饲料后，禁食24 h，然后选择健康、体重为(0.44±0.02) g的幼虾，随机放入24个实验桶(约120 L水体)中，每桶放养30尾虾。正式实验期间，每种饲料投喂4个养殖桶，且每天饱食投喂3次(08:00、14:00和18:00)，实验持续48 d。实验期间，每天清除残饵和粪便，记录摄食量和对虾健康状况。实验用水为经砂滤后的天然海水，盐度为20–23，养殖全程不间断充气。实验期间水温为25–28℃，pH为7.9–8.2，溶解氧约为6 mg/L。每天排污1次，每次换水占总水量约10%。

实验结束时，将实验虾禁食24 h，以丁香油(1: 10000)麻醉。分别从每桶随机抽取10尾实验虾，经麻醉后取肝胰腺和肠道于液氮速冻，放入–80℃冰箱保存。

采用凯氏定氮法测定饲料粗蛋白含量；采用索氏抽提法，以乙醚为抽提剂测定饲料粗脂肪含量；将饲料样品在烘箱里烘(105℃) 6 h后测得样品水分含量。

丙二醛(MDA)含量，总超氧化物歧化酶(T-SOD)、碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)的酶活力均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定。

用全自动研磨仪将50–100 mg肠道组织研磨至无大血块，用Trizol(Invitrogen, 美国)提取总RNA。用氯仿抽提，异丙醇沉淀RNA，再用75%的乙醇洗涤2次，最后用无菌水溶解RNA。用NanoDrop 2000分光光度计检测RNA纯度和浓度。用1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。以Thermo Scientific Revert Aid First-Strand Synthesis System (Invitrogen, 美国)试剂盒合成cDNA。

实时荧光定量PCR采用20 μl体系：上下游引物各1 μl，稀释的cDNA模板溶液9 μl，AceQ^® qPCR SYBR^® Master混合物10 μl。程序为95℃ 10 min预变性；95℃ 15 s，60℃ 15 s，60℃ 60 s，共40个循环。基因表达结果采用相对表达量的形式，以2^–ΔΔC_t法进行计算。凡纳滨对虾免疫基因、内参基因β-actin引物序列参考张盛静等(2015)(表 3)。

表 3(Tab. 3)

表 3 凡纳滨对虾非特异免疫基因引物(张盛静等, 2015) Table 3 Primers for genes of nonspecific immunity of L.vannamei(Zhang et al, 2015) 基因Gene 正向引物 Forward primer(5'–3') 反向引物 Reverse primer(5'–3') 退火温度 Annealing temperature (℃) IMD ATACATCCTGCCGTTGCCGA CCGAGATGGGTTCCCTTGTT 60 Penaiedin 3a CACCCTTCGTGAGACCTTTG AATATCCCTTTCCCACGTGAC 60 LZM TGTTCCGATCTGATGTCC GCTGTTGTAAGCCACCC 60 Crustin GAGGGTCAAGCCTACTGCTG ACTTATCGAGGCCAGCACAC 60 β-actin GAGCAACACGGAGTTCGTTGT CATCACCAACTGGGACGACATGGA 60

表 3 凡纳滨对虾非特异免疫基因引物(张盛静等, 2015) Table 3 Primers for genes of nonspecific immunity of L.vannamei(Zhang et al, 2015)

采用SPSS 17.0对所得数据进行方差分析，若差异达显著性水平P＜0.05，则进行Duncan氏多重比较。

饲料中添加低分子水解鱼蛋白对凡纳滨对虾肝胰腺非特异性免疫和抗氧化指标的影响见表 4。由表 4可知，凡纳滨对虾T-SOD的活力在低分子肽添加组(LFM0.5、LFM1.0、LFM1.5和LFM2.0)显著高于低鱼粉基础组(LFM0)(P＜0.05)，而在低分子水解鱼蛋白添加组中，LFM1.0组的活力最高，显著高于其他组，但与高鱼粉组(HFM)差异不显著(P＞0.05)。当低分子水解鱼蛋白的添加量高于1.0%时，T-SOD的活力显著降低(P＜0.05)。对虾肝胰腺MDA含量在LFM0组最高，但与HFM和LFM0.5组差异不显著(P＞0.05)，当低分子肽的添加量在1.0%–2.0%之间时，MDA含量显著低于其他组(P＜0.05)。对虾肝胰腺AKP活力在LFM1.0组最高，显著高于HFM、LFM0和LFM2.0组(P＜0.05)，其中HFM、LFM1.5和LFM2.0组活力差异不显著。对虾肝胰腺ACP活力在LFM1.0组最高，与LFM0.5组差异不显著(P＞0.05)，但显著高于HFM和LFM0组(P＜0.05)，当低分子水解鱼蛋白的添加量高于1.0%时，ACP活力显著降低。

表 4(Tab. 4)

表 4 饲料添加低分子水解鱼蛋白对凡纳滨对虾肝胰腺非特异免疫和抗氧化指标的影响 Table 4 Effects of dietary low-molecular-weight fish hydrolysate on nonspecific immunity and antioxidant indices of L.vannamei hepatopancreas 指标 Indices HFM LFM0 LFM0.5 LFM1.0 LFM1.5 LFM2.0 总超氧化物歧化酶 T-SOD (U/mg prot) 5.47±0.35ab 3.19±0.09d 4.51±0.00c 5.93±0.13a 5.12±0.15b 4.47±0.31c 丙二醛 MDA (nmol/mg) 1.93±0.07bc 2.09±0.05c 2.04±0.10c 1.67±0.08a 1.70±0.06a 1.82±0.03ab 碱性磷酸酶 AKP (U/g prot) 234.16±1.13b 265.26±14.75b 323.92±8.91a 344.08±4.31a 333.52±23.81a 245.05±21.12b 酸性磷酸酶 ACP (U/g prot) 348.24±30.72d 406.19±3.58cd 532.65±12.63ab 578.35±24.23a 461.94±21.16bc 349.05±41.60d 注：不同字母表示差异显著(P＜0.05) Note: Different letters denoted significant differences (P＜0.05)

表 4 饲料添加低分子水解鱼蛋白对凡纳滨对虾肝胰腺非特异免疫和抗氧化指标的影响 Table 4 Effects of dietary low-molecular-weight fish hydrolysate on nonspecific immunity and antioxidant indices of L.vannamei hepatopancreas

凡纳滨对虾肠道IMD mRNA的相对表达量在LFM1.5组最高，显著高于LFM2.0组的表达量(P＜0.05)，其他各组的表达量差异不显著(P＞0.05)(图 1)。对虾肠道Penaiedin 3a mRNA的相对表达量在LFM1.0组最高，显著高于LFM2.0组(P＜0.05)，其他各组间差异不显著(P＞0.05)(图 1)。对虾肠道LZM mRNA的相对表达量在低鱼粉基础组(LFM0)和低分子肽添加最高组(LFM2.0)最低，但各组间差异不显著(P＞0.05) (图 1)。LFM1.0和LFM1.5组对虾肠道Custin mRNA的相对表达量显著高于LFM0组(P＜0.05)，其他各组间差异不显著(P＞0.05)(图 1)。

图 1(Fig. 1)

图 1 凡纳滨对虾肠道IMD、Penaiedin 3a、LZM和Crustin mRNA的相对表达量 Figure 1 Relative expression of IMD, Penaiedin 3a, LZM and Crustin mRNA in the intestine of L.vannamei 不同字母表示差异显著(P＜0.05) Different letters denoted significant differences (P < 0.05)

蛋白水解物具有抗氧化、降血压、调节脂肪代谢以及增强免疫等多种生物学功能，这主要依赖于其所含的生物活性肽(王新星等, 2012; Bui et al, 2014)。通过刺激淋巴细胞的增殖、增强自然杀伤细胞的活性和调节抗体合成和细胞因子也证实水解鱼蛋白具有免疫刺激和抗菌的作用(Fitzgerald et al, 2006; Hartmann et al, 2007)。在饲料中添加水解鱼蛋白能够提高鱼类SOD等抗氧化酶的活力以及溶菌酶、呼吸爆发、血清补体、免疫球蛋白等为标志的非特异免疫力(Liang et al, 2006; Tang et al, 2008; Khosravi et al, 2015)。本研究发现，在饲料中添加低分子水解鱼蛋白可显著提高凡纳滨对虾肝胰腺中T-SOD的活力，并且LFM1.0组与HFM组T-SOD的活力差异不显著。T-SOD是一种抗氧化酶，在清除自由基、防御机体衰老及防止生物分子损伤等方面具有极为重要的作用(张明等, 2004)。Nazeer等(2012)制备并分析了红牙鱼肌肉的水解鱼蛋白，发现体内外的抗氧化性与氨基酸序列Lys-Thr-Phe-Cys-Gly-Arg-His (861.6 Da)有关。滕玉清等(2011)认为，水解鱼蛋白分解生成的某些游离氨基酸可能是SOD的催化酶，可使SOD酶活性升高，清除对虾体内过多的自由基，平衡代谢，提高免疫力。由于生物有机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物，如醛基(MDA)、酮基、羟基和羰基等，这些产物能引起细胞损伤，甚至凋亡。因而组织MDA的含量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度。本研究结果显示，当低分子肽的添加水平在1.0%–2.0%时，能显著降低对虾肝胰腺中MDA的含量。综上所述，在饲料中添加低分子水解鱼蛋白能清除对虾肝胰腺过多的自由基，提高抗氧化能力。

AKP和ACP是巨噬细胞溶酶体的标志酶，在对虾免疫体系中是衡量机体免疫机能和健康状况的重要指标，这两种酶能催化磷酸单脂水解，在酸性和碱性条件下水解磷酸苯二钠，释放酚和磷酸，在体内直接参与磷酸基团的转移和代谢(刘树青等, 1999)。低鱼粉饲料1.0%水解物添加组(LFM1.0)中，对虾肝胰腺AKP和ACP的活力显著高于高鱼粉组(HFM)、低鱼粉基础组(LFM0)和2.0%水解鱼蛋白添加组(LFM2.0)，但与LFM0.5、LFM1.5组差异不显著。这表明，在饲料中添加适量的低分子水解鱼蛋白能提高AKP和ACP的活力，而高水平添加则会降低AKP和ACP的活力。滕玉清等(2011)在对中国明对虾(Penaeus chinensis)的研究中也发现，添加10%水解鱼蛋白会降低ACP和AKP的活力，这说明饲料中过高的水解蛋白可能会抑制ACP和AKP的活力。

生物机体利用免疫系统来抵抗病原体的入侵。先天性免疫是无脊椎动物防御致病因子的重要防线(Iwanaga et al, 2005)。一系列免疫因子，如对虾素3a分子(Penaiedin 3a)、溶菌酶(LZM)和甲壳素(Crustin)等在体液免疫中发挥重要作用，与凡纳滨对虾抗感染能力的强弱密切相关。在无脊椎动物中，肠道先天免疫缺陷基因IMD编码一种免疫缺陷蛋白IMD，当机体受到病原菌入侵时，IMD蛋白将特定异物入侵的信号由细胞外向细胞内传递，并引起细胞产生一系列级联反应，形成免疫效应因子(如抗菌肽)(Li et al, 2013)。本研究表明，在对虾饲料中添加低分子水解鱼蛋白会影响IMD、Penaiedin 3a和Crustin基因的表达量，但LZM基因表达量在各实验组间差异不显著。在低鱼粉饲料中低分子水解鱼蛋白的添加量为1.5%时，能显著提高对虾肠道IMD mRNA的相对表达量，但添加量达到2.0%时，IMD mRNA的相对表达量却显著降低。这表明，低鱼粉饲料中添加适宜水平的低分子水解鱼蛋白能刺激IMD mRNA的表达，添加量过高反而会抑制表达。对虾素分子只存在于对虾类中发挥抗菌功能(Li et al, 2010)。本研究中，饲料中添加1.0%的低分子水解鱼蛋白组的Penaiedin 3a mRNA相对表达量最高，而添加2.0%的低分子水解鱼蛋白组的Penaiedin 3a mRNA相对表达量最低，这说明适宜的低分子水解鱼蛋白添加量可提高凡纳滨对虾免疫力，而高水平添加会造成免疫抑制。

溶菌酶广泛分布于对虾体内，能破坏革兰氏阳性菌细胞壁中的肽聚糖层，从而使机体能够抵御病原微生物的入侵(张士璀等, 2014)。张盛静等(2015)以副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)对凡纳滨对虾攻毒，发现饲料益生菌添加组对虾LZM mRNA的相对表达量显著高于未添加组。在本研究中，各实验组LZM mRNA的相对表达量没有显著差异，然而与低鱼粉基础组(LFM0)相比，高鱼粉组LZM mRNA的相对表达量较高，且当低分子水解鱼蛋白的添加量在0.5%–1.5%时，对虾肠道LZM mRNA的相对表达量也有升高趋势。说明高豆粕替代鱼粉可能会造成对虾肠道溶菌酶活力降低，而添加适量的低分子水解鱼蛋白可能在一定程度上提高肠道溶菌酶活力。Crustin被称为甲壳动物阳离子，富含半胱氨酸抗菌肽，具有蛋白酶抑制和抗菌活性。在低鱼粉饲料中添加1.0%–1.5%的低分子水解鱼蛋白，能显著提高Crustin mRNA的相对表达量，并且显著高于低鱼粉组(LFM0)。这表明，在低鱼粉饲料中添加适宜水平的低分子水解鱼蛋白可能会提高凡纳滨对虾肠道的抗菌能力。以上结果显示，在本研究饲料处理条件下，凡纳滨对虾肠道各免疫基因表达的变化趋势存在较大差异，各免疫基因对低分子水解蛋白的刺激存在不同的反应，低分子水解蛋白对凡纳滨对虾免疫力的影响可能存在多种途径。

综上所述，在饲料中添加1.0%–1.5%的低分子水解鱼蛋白能够提高凡纳滨对虾抗氧化能力，增强其非特异性免疫能力。