魁蚶(Scapharca broughtonii)，俗称大毛蛤、赤贝、血贝，属埋栖型冷水性贝类，多栖息于底质为泥质粉砂和砂质粉砂的海区(张玉玺等, 1991)¹⁾。在我国黄海北部资源量丰富，主要分布于山东、辽宁等沿海，是我国北方重要的经济贝类之一。因魁蚶肉质鲜美、营养及药用价值高，在中国及韩国市场深受欢迎。但捕捞过度、环境恶化等因素导致魁蚶自然资源量不断衰减、遗传多样性水平降低。深入开展魁蚶种质资源调查，查明不同群体间的遗传结构，是进行种质改良的前提和基础。本课题组已经开展了一些有关魁蚶种质资源调查等方面的研究，运用多变量形态度量学分析方法、RAPD和SSR标记技术，对韩国和我国沿海4个魁蚶地理群体的遗传变异和遗传多样性情况进行了研究(梁超等, 2010; 吴彪等, 2012)，结果显示，4个群体遗传多样性丰富，有较大的育种潜力；对4个魁蚶地理群体样本的核糖体RNA的2个内转录间隔区域(ITS-1和ITS-2)进行扩增，发现各群体之间存在一定的遗传差异，综合考虑不同群体相对优良的生物学特征，可开展选择或杂交培育良种的研究(周丽青等, 2012)。另外，An等(2005)用10个多态微卫星位点对魁蚶进行了遗传多样性分析，等位基因的数量从11到23不等，群体遗传学分析显示，10个位点之间不存在连锁不平衡的现象；孙楠等(2015)利用微卫星标记对魁蚶混交家系进行了鉴定。但利用线粒体基因和核糖体基因进行魁蚶种质资源分析的相关研究报道较少。

1) Zhang YX, Zhou XJ, Jiang HB, et al. Study on the habits and modes of life in the natural environment of Scapharca broughtonii (Shrenck) in Shandong offshore. Transactions of the Chinese Society of Malacology, 1991 [张玉玺, 周学家, 姜海滨, 等.山东近海魁蚶生态习性的调查.中国动物学会、中国海洋湖沼学会贝类学分会第四次代表大会暨第五次学术讨论会论文集, 1991]

线粒体基因组具有突变率高、分子量小、无组织特异性的特点，在分子系统发育中应用广泛。COⅠ(线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ, coxidase Ⅰ)基因通用性比较高，可操作性强(侯丫等, 2016)，可以提供丰富的遗传信息，已成功应用于遗传分析和系统进化研究中(Chen et al, 2009; Shen et al, 2009; Zheng et al, 2009)。12S rRNA基因具有高度的保守性，在贝类的分子系统学研究中发挥着重要的作用(刘春芳, 2014¹⁾; 冯艳微, 2012²⁾)。18S rRNA和28S rRNA在生物体内含量较大，且在进化过程中具有保守性，因此，适合不同层次系统发育的研究，是研究生命起源和早期生物进化、高级分类阶元系统发育关系的主要分子标记，已广泛应用于动植物的种质鉴定和系统发育研究。薛东秀等(2012)从GenBank下载翼形亚纲11个总科80个种类的28S部分序列，进行系统发育关系研究，取得较好结果。

1) Liu CF. Phylogenetic analysis of Arcoidea and genetic diversity of different populations of Tegillarca granosa along Chinese coasts. Master's Thesis of Chinese Academy of Sciences (Institute of Oceanology), 2014, 32-54 [刘春芳.中国近海蚶总科(Arcoidea)贝类的系统发育及泥蚶(Tegillarca granosa)不同群体遗传多样性研究.中国科学院研究生院(海洋研究所)硕士研究生学位论文, 2014, 32-54]

2) Feng YW. DNA barcoding and molecular phylogeny of the Pteriina and Arcoida. Doctoral Dissertation of Ocean University of, 96-101 [冯艳微.珍珠贝亚目和蚶目DNA条形码与系统发生学研究.中国海洋大学博士研究生学位论文, 2012, 96-101]

本研究对魁蚶5个地理群体进行COⅠ、12S、18S和28S序列变异分析及系统进化分析，旨在明确魁蚶群体遗传多样性水平和不同地理群体的系统进化关系，为魁蚶资源保护及种质改良提供基础资料。

实验所用的5个地理群体的魁蚶分别取自山东青岛胶南(J)、山东荣成(R)、山东长岛(C)、山东蓬莱(P)、韩国统营(H)，样品均为近海野生个体，低温运至实验室迅速解剖，取闭壳肌，置于-80℃超低温冰箱保存。

每个群体随机取15个样品，采用常规酚-氯仿法提取基因组DNA，实验用DNA模板稀释至100 ng/μl。运用PCR扩增魁蚶COⅠ、12S、18S和28S基因，所用引物序列见表 1。PCR反应体系为30 μl：3 μl PCR 10×buffer，3 μl高纯度的dNTP (2.5 mmol/L)，10 μmol/L的正反方向引物各1 μl，0.5 μl Easy Taq (5 U/μl)，1 μl DNA(80 ng/μl)，20.5 μl灭菌水。PCR反应程序：94℃预变性5 min；35个循环(94℃变性20 s, 52℃退火45 s, 72℃延伸1 min)；最后，72℃延伸10 min。得到清晰、单一的目的片段，所得PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测(1×TAE, 130 V, 30 min)，然后利用凝胶成像系统进行观察拍照。切取目的条带、胶回收，将目的片段与T载体连接，转化感受态细胞，进行单克隆，用M13通用引物进行双向测序。其中，8个个体没有扩增出COⅠ条带，3个个体没有扩增出12S条带。

表 1(Tab. 1)

表 1 COⅠ、12S、18S和28S引物序列 Table 1 Primer sequences of COⅠ, 12S, 18S, and 28S 基因 Gene 引物序列 Primer sequence 引物出处 Reference COⅠ F: ATYGGNGGNTTYGGNAAYTG R: ATNGCRAANACNGCNCCYAT Matsumoto, 2003 12S 12S-SR-J14197: FGTACAYCTACTATGTTACGACTT 12S-SR-N14745: GTGCCAGCAGYYGCGGTTANAC Simon et al, 1994 18S 1F: TACCTGGTTGATCCTGCCAGTAG 5R: CTTGGCAAATGCTTTCGC Giribet et al, 1996; Okusu et al, 2003 28S 3311F: GGGACTACCCCCTGAATTTAAGCAT 4434R: CCAGCTATCCTGAGGGAAACTTCG Giribet et al, 1996; Okusu et al, 2003

表 1 COⅠ、12S、18S和28S引物序列 Table 1 Primer sequences of COⅠ, 12S, 18S, and 28S

先用Chromas检查所得序列的测序质量，并在NCBI数据库中进行Blast比对，验证其同源性。运用BioEdit和ClustalX 1.8软件进行序列比对，利用DnaSp软件分析魁蚶群体单倍型数(Number of haplotype, H)、平均核苷酸差异(Average number of nucleotide difference, K)及核苷酸多样性指数(Nucleotide diversity, P_i)等遗传多样性参数，运用MEGA 5.0软件对序列的碱基组成(Nucleotide composition)、多态位点数(Number of polymorphic sites, S)、变异位点(Variable sites)进行分析，采用NJ (Neighbor-joining)法构建魁蚶5个地理群体的系统发育树。

测序后获得的COⅠ、12S、18S和28S基因片段长短不一，经序列比对去除序列两端部分碱基后，分别得到67条长度均为776 bp的COⅠ序列、72条长度为443 bp的12S序列、75条长度均为909 bp的18S基因片段、75条长度均为894 bp的28S基因片段。魁蚶5个群体的COⅠ、12S、18S和28S基因部分片段的碱基组成见表 2、表 3。5个群体的18S基因部分序列碱基组成比例相对稳定，COⅠ基因部分序列A+T含量要比12S、18S和28S的A+T含量高，而C的含量最少，28S基因部分序列中，G的含量相对较高。

表 2(Tab. 2)

表 2 魁蚶不同群体COⅠ和12S基因部分序列的碱基组成 Table 2 Base compositions of partial sequences of COⅠ and 12S gene of five populations of S. broughtii 群体 Population COⅠ 12S T(%) C(%) A(%) G(%) A+T(%) T(%) C(%) A(%) G(%) A+T(%) 胶南 J 39.3 14.6 23.8 22.3 63.1 26.4 28.0 27.0 18.4 53.4 长岛 C 39.2 14.6 24.0 22.2 63.2 26.3 26.9 28.0 18.8 54.3 荣成 R 39.7 14.1 23.7 22.5 63.4 27.1 25.0 28.7 19.2 55.8 蓬莱 P 36.9 15.5 24.2 22.3 63.5 26.8 25.0 28.4 19.8 55.2 韩国 H 37.0 15.6 26.4 21.2 63.4 26.6 26.7 26.8 19.8 53.4 平均值 Average 38.3 15.0 25.0 21.8 63.3 26.5 26.3 27.8 19.2 54.3

表 2 魁蚶不同群体COⅠ和12S基因部分序列的碱基组成 Table 2 Base compositions of partial sequences of COⅠ and 12S gene of five populations of S. broughtii

表 3(Tab. 3)

表 3 魁蚶不同群体18S和28S基因部分序列的碱基组成 Table 3 Base compositions of partial sequences of 18S and 28S gene of five populations of S. brouhtonii 群体 Population 18S 28S T(%) C(%) A(%) G(%) A+T(%) T(%) C(%) A(%) G(%) A+T(%) 胶南 J 26.9 21.2 26.4 25.5 53.3 21.7 28.3 21.4 38.7 43.1 长岛 C 27.0 20.9 26.3 25.9 53.3 21.8 28.0 21.3 28.9 43.1 荣成 R 26.9 21.2 26.3 25.6 53.2 21.4 28.4 21.5 32.0 42.9 蓬莱 P 27.0 20.9 26.3 25.8 53.3 21.8 28.6 21.2 28.4 43.0 韩国 H 26.9 21.0 26.3 25.8 52.9 21.5 26.0 21.2 31.3 42.7 平均值 Average 26.9 21.0 26.3 25.7 53.2 21.6 27.8 21.3 29.2 42.9

表 3 魁蚶不同群体18S和28S基因部分序列的碱基组成 Table 3 Base compositions of partial sequences of 18S and 28S gene of five populations of S. brouhtonii

5个群体间的COⅠ、12S、18S和28S的核苷酸遗传多样性参数见表 4。从5个群体67个个体的COⅠ序列中共检测到466个多态位点、32种单倍型、单倍型多样性指数为0.925，说明5个群体的COⅠ基因单倍型很丰富。核苷酸多样性指数为0.086，其中，韩国群体的多态位点(S)和平均核苷酸差异数(K)高于其他群体。12S序列共检测到292个多态位点、43种单倍型，其中，单倍型3有7个个体，分别是荣成(R)群体3个、长岛(C)群体7个、蓬莱(P)群体7个。18S序列中共检测到909个多态位点、74种单倍型，单倍型多样性指数为1.000，说明5个群体的18S单倍型比较丰富，核苷酸多样性指数也很丰富(0.717)。基于18S序列，胶南群体的多态位点最多，核苷酸多样性指数也最丰富，蓬莱群体的多态性最低。从5个群体75个个体的28S序列中共检测到27个多态位点、18种单倍型，其中，单倍型8有26个个体，分别是长岛(C)群体7个，韩国(H)群体5个，蓬莱(P)群体2个，胶南(J)群体5个，荣成(R)群体12个，单倍型多样性指数为0.778，核苷酸多样性指数为0.289。其中，蓬莱群体的多态性是最高的，其次是荣成群体，韩国群体的多态性最低。

表 4(Tab. 4)

表 4 魁蚶不同群体COⅠ、12S、18S和28S基因片段的遗传多样性指数 Table 4 The genetic diversity indices of partial COⅠ, 12S, 18S, and 28S in different population of S. broughonii 基因片段 Gene fragment 群体 Population 样本数目 Sample number 单倍型数H Haplotypes 单倍型多样性 Hd Diversity 多态位点S Polymorphic site 平均核苷酸差异数k Average nucleotide differences 核苷酸多样性指数Pi Nucleotide diversity index COⅠ 胶南 J 15 12 1.000 36 16.758 0.019 长岛 C 15 15 1.000 47 16.571 0.017 蓬莱 P 15 9 0.096 45 18.836 0.021 荣成 R 15 12 0.097 472 125.703 0.197 韩国 H 15 15 1.000 505 133.057 0.155 12S 胶南 J 15 13 0.989 232 94.384 0.242 长岛 C 15 8 0.769 311 116.080 0.287 蓬莱 P 15 8 0.769 277 60.800 0.150 荣成 R 15 14 0.990 322 125.700 0.353 韩国 H 15 10 0.857 388 176.120 0.426 18S 胶南 J 15 13 0.971 488 69.724 0.080 长岛 C 15 15 1.000 25 7.791 0.009 蓬莱 P 15 15 1.000 24 8.333 0.009 荣成 R 15 8 0.848 481 65.733 0.172 韩国 H 15 15 1.000 25 7.829 0.009 28S 胶南 J 15 13 0.981 540 272.571 0.318 长岛 C 15 10 0.857 536 276.029 0.305 蓬莱 P 15 14 0.990 589 269.924 0.334 荣成 R 15 13 0.971 557 275.057 0.334 韩国 H 15 10 0.943 461 116.038 0.150

表 4 魁蚶不同群体COⅠ、12S、18S和28S基因片段的遗传多样性指数 Table 4 The genetic diversity indices of partial COⅠ, 12S, 18S, and 28S in different population of S. broughonii

用MEGA 5.0软件计算5个群体内和群体间的遗传距离(表 5和表 6)，构建5个群体个体间基于COⅠ、12S、18S和28S的NJ分子系统树。COⅠ和12S分析结果显示，群体内遗传距离大多小于群体间遗传距离，且韩国群体与其他4个群体的遗传距离都较大，其中，12S序列，韩国群体与其他4个群体的遗传距离较远。18S序列的分析结果显示，5个群体间的遗传距离很小，群体内遗传距离甚至高于群体间遗传距离。韩国群体与其他4个群体间的遗传距离相对较大。在28S序列中，群体间的遗传距离均较大，胶南群体和蓬莱群体间的遗传距离最远。COⅠ的NJ系统进化树见图 1。虽然韩国群体遗传距离与其他4个群体较大，但聚类分析显示，韩国群体并没有形成单独一支。

表 5(Tab. 5)

表 5 基于COⅠ和12S序列的5个魁蚶群体间和群体内的遗传距离 Table 5 Genetic distances between and within five different populations of S. broughtonii 群体 Populations COⅠ 12S 胶南 J 长岛 C 荣成 R 蓬莱 P 韩国 H 胶南 J 长岛 C 荣成 R 蓬莱 P 韩国 H 胶南 J 0.011 0.230 长岛 C 0.001 0.002 0.335 0.260 荣成 R 0.378 0.380 0.646 0.369 0.286 0.320 蓬莱 P 0.038 0.039 0.351 0.002 0.381 0.206 0.236 0.127 韩国 H 0.321 0.323 0.606 0.357 0.297 0.405 0.357 0.390 0.338 0.437 注：加粗为群体内的遗传距离，其他为群体间的遗传距离，下同 Note: The numbers in bold indicated the intragroup genetic distances. Others were intergroup genetic distances. The same as below

表 5 基于COⅠ和12S序列的5个魁蚶群体间和群体内的遗传距离 Table 5 Genetic distances between and within five different populations of S. broughtonii

表 6(Tab. 6)

表 6 基于18S和28S序列的5个魁蚶群体间和群体内的遗传距离 Table 6 Genetic distances between and within five different populations of S. broughtonii 群体 Populations 18S 28S 胶南 J 长岛 C 荣成 R 蓬莱 P 韩国 H 胶南 J 长岛 C 荣成 R 蓬莱 P 韩国 H 胶南 J 0.176 3.333 长岛 C 0.089 0.001 3.062 3.166 荣成 R 0.164 0.089 0.176 3.097 3.041 3.292 蓬莱 P 0.088 0.001 0.089 0.001 3.229 3.168 3.210 3.549 韩国 H 0.089 0.002 0.090 0.002 0.003 2.959 2.630 2.923 3.047 1.529

表 6 基于18S和28S序列的5个魁蚶群体间和群体内的遗传距离 Table 6 Genetic distances between and within five different populations of S. broughtonii

图 1(Fig. 1)

图 1 基于魁蚶5个群体COⅠ部分序列建立的NJ系统发育关系 Figure 1 Phylogenetic relationships among five groups of S. broughtonii based on the partial sequences of COⅠ gene

遗传多样性是指生物所携带遗传信息的总和，包括遗传变异程度及其分布格局，即群体的遗传结构，是物种适应多变的环境条件、维持长期生存和进化的遗传基础，是评价群体资源状况的一个重要依据。某个种群的遗传变异越丰富，其对生存环境的适应能力就越强，进化的潜力也越大(张文静等, 2003; 马波等, 2009)。本研究中，基于COⅠ和12S基因的单倍型非常丰富，分别是32种和43种，尤其是韩国群体，多态位点和平均核苷酸差异数都很多。基于18S序列，5个群体都表现出丰富的遗传多样性，共有74种单倍型，胶南群体多态位点有488个，平均核苷酸差异指数是69.724，核酸多样性指数是0.080，相比于其他群体，此群体的变异位点最多，多样性也最丰富。基于28S序列，75个个体共有18种单倍型，蓬莱群体多样性最丰富。周丽青等(2012)对山东蓬莱、山东黄岛、江苏前三岛及韩国统营4个地理群体魁蚶样本的核糖体RNA两个内转录间隔区域(ITS-1和ITS-2)进行扩增，序列比对结果显示，ITS区序列变异相对较高，4个群体的ITS区序列均表现出丰富的遗传多样性，这与本研究结果一致。

遗传距离是起源于共同祖先的相同基因进化趋异的一种测度(张爱兵等, 2002)。在此假定下，遗传距离通常指由基因频率的函数表示群体间的差异(Nei, 1987)，根据其大小可以确定群体间亲缘关系的远近。群体间的遗传距离越大，则基因型差异越大，表明所比较群体的亲缘关系越远，遗传相似性越小；反之亦然(田吉腾等, 2013)。本研究中，魁蚶5个群体间的遗传距离在0.001-3.229之间，韩国群体与其他4个群体的遗传距离相对较大。这与吴彪等(2012)、田吉腾等(2013)的结果较一致，均表现出韩国群体与中国群体遗传距离相差较大。

DNA碱基序列分析可以准确地检测出碱基替换、插入和缺失等变异信息，利用这些变异数据来研究个体或者群体的遗传结构，不仅可以获得丰富的遗传变异资料，而且还可以准确地揭秘种群间进化关系，甚至更准确地鉴别不同的个体(周丽青等, 2012)。线粒体COⅠ基因是DNA条形码技术中常用的分子标记(冯艳微, 2011¹⁾; 孟玮等, 2010; 胡玉婷等, 2016)，它蕴含着丰富的遗传进化信息，可以用来进行物种鉴定和隐存种的发现(陈双雅等, 2012; 张馨月等, 2014)，通过分析物种的种间和种内遗传距离，来判断亲缘关系的远近。18S和28S基因都是高度保守的，适合研究较高阶元的系统发生(Hwang et al, 1999)，也是近年来在海洋贝类分类中研究利用较多的序列之一(Carapelli et al, 2000)。吴文健等(2010)对9个群体的石磺科贝类进行外部形态特征差异分析和内部结构比较，在初步分类基础上利用18S rRNA基因部分序列对9个群体进行系统发育分析，探讨我国大陆沿海石磺科属种间的亲缘关系；孟学平等(2011)利用18S来探讨双壳纲贝类的系统发生关系，发现18S序列有插入∕缺失序列，存在长度多态性；Giribet等(2005)使用18S rDNA、28S rDNA、COⅠ基因以及形态学数据证实了蚶总科的单系性。

1) Feng YW. DNA barcoding and molecular phylogeny of the Pteriina and Arcoida. Doctoral Dissertation of Ocean University of China, 2012, 96–101 [冯艳微.珍珠贝亚目和蚶目DNA条形码与系统发生学研究.中国海洋大学博士研究生学位论文, 2012, 96-101]

本研究表明，基于COⅠ和12S基因，5个群体均表现出较高的遗传多样性，相比于其他4个群体，韩国群体的遗传多样性较丰富。18S和28S序列的遗传信息并不完全一致，序列变异频率也存在差异。因此，为进一步提高遗传多样性评估的准确性，选择进化过程中变异比较大的基因序列，能够更加全面地分析物种的进化和遗传多样性。