四指马鲅(Eleutheronema tetradactylum)俗称午鱼、马友、章跳、鲤后等，隶属于鲻形目(Mugiliformes)、马鲅科(Polynemidae)、四指马鲅属(孙典荣等, 2013)，在我国多分布于东海、南海海域，在全球范围内主要分布于中国、日本、越南及东南亚沿海区域(张涛等, 2009)。四指马鲅肉质鲜美、生长速度快、经济价值高，极具发展前景。目前，人工繁育技术已经突破，对四指马鲅胚胎发育、盐度耐受性、消化道结构和功能细胞的发育等已有系统研究(谢木娇等, 2015、2016a、2016b)，大规模苗种生产技术为其作为新兴养殖品种的推广奠定了物质基础。但是，四指马鲅对应激反应十分敏感，在养殖过程中容易因手工操作受伤死亡，影响了该鱼养殖产业的健康发展。

应激是机体对外界或内部的各种异常刺激所产生的非特异性全身反应，是生物体在长期进化中形成的一种适应性和防御性功能。翁朝红等(2008)的研究表明，在水产养殖生产管理中，一些不可避免的操作，如运输、拉网捕捉、吸残饵排污等，会对大黄鱼(Pseudosciaena crocea)造成一定的胁迫，从而导致鱼类产生应激反应。这些应激反应会对鱼类的生理生化等方面产生不利影响。孙鹏等(2014)的研究表明，长时间的应激胁迫会降低云纹石斑鱼(Epinephelus moara)的抵抗力以及生长速率。目前，有关鱼类环境胁迫的研究相对较多，主要包括盐度对龙虎斑(Epinephelus ianceolatus♂×E. fuscoguttatus♀)和鲻(Mugil cephalus)(王成桂等, 2014; 于娜等, 2011)、温度对舌齿鲈(Dicentrarchus labrax)和银鲳(Pampus argenteus) (Besson et al, 2016; 施兆鸿等, 2016)、pH对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)(马广智等, 2001)、鱼毒性赤潮藻对青鳉(Oryzias latipes)(李昌伟, 2014)¹⁾、养殖密度对北极红点鲑(Salvelinus alpinus) (Wallace et al, 1988)的胁迫等，而有关养殖过程中操作胁迫的研究主要集中在虹鳟(Oncorhynchus mykiss) (Wiseman et al, 2007)、刀鲚(Coilia nasus)(王宇等, 2014; 徐钢春等, 2015; 高金伟等, 2015; Du et al, 2014)，而对四指马鲅的研究相对较少。鱼类机体抗氧化系统在抵御由环境变化导致的氧化压力中有重要作用，包括小分子非酶物质[如谷胱甘肽、维生素C (V_C)、维生素E (V_E)]和抗氧化物酶(如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱肽还原酶等)。四指马鲅受到急性应激时口裂完全张开、肌肉抽搐而死。本研究通过模拟拉网对四指马鲅进行操作胁迫，以探究四指马鲅应激反应特点，为其健康养殖技术的建立提供科学依据。

1) Li CW. The detrimental mechanism of ichthytoxic microalgae species on marine medaka (Oryzias melastigma). Master's Thesis of Jinan University, 2014 [李昌伟.鱼毒性赤潮藻对海洋青鳉鱼的致害机理研究.暨南大学硕士研究生学位论文, 2014]

实验所用的四指马鲅于2015年6–8月在中国水产科学研究院南海水产研究所珠海试验基地培育所得，体长为(6.00±0.21) cm，体重为(4.00±0.15) g。实验开始前暂养1周，暂养期间，每天换水1次，每次换水量1/2左右，连续充气。随机挑选体色正常、健康的幼鱼240尾进行实验。

采用操网捕捉的方式对四指马鲅进行急性离水操作胁迫，每次先将四指马鲅全部聚拢在操网内拥挤胁迫5 s，然后捞起暴露于空气中5 s，再放入水中3 min，重复以上操作共持续10个循环。

将四指马鲅分为3个平行组，然后胁迫结束后的2 h、6 h、12 h和24 h以及各时间点的对照组，分别取样15尾，采集前先用MS-222麻醉实验鱼2–3 min，解剖鱼体，采集肌肉、鳃组织样品，用作组织切片观察的样品固定于4%多聚甲醛溶液中；测量酶活的样品置于液氮中保存以备后续实验使用。

组织切片观察，采用区又君等(2015)的研究方法：取多聚甲醛固定的肌肉和鳃，经过流水冲洗、70%–100%的乙醇脱水和二甲苯透明、石蜡包埋处理后，用Leica切片机进行连续切片，切片厚度为5– 6 μm，采用HE染色和中性树脂封片，于Zeiss显微镜下拍照。

肌肉抗氧化酶以及鳃Na⁺-K⁺-ATP酶活性测定，取经液氮固定的肌肉和鳃，准确称取组织重量，按重量(g)：体积(ml)=1：9的比例加入9倍生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，250 r/min离心10 min，取上清液(10%的组织匀浆液)。按照南京建成试剂盒说明书分别测定酶活，以BCA法测定蛋白含量。总抗氧化能力(T-AOC)通过520 nm波长37℃条件下每分钟每毫克组织蛋白使反应体系的吸光度(OD)值每增加0.01时，为1个总抗氧化能力单位来测定；过氧化氢酶(CAT)活性通过405 nm波长处测定过氧化氢减少量来测定，单位定义为每毫克组织蛋白每秒分解1 μmol的H₂O₂的量为1个活性单位；超氧化物歧化酶(SOD)活性单位定义为：反应体系中SOD抑制率达到50%时所对应的酶量为1个SOD活性单位(U)；过氧化脂降解产物丙二醛(MDA)通过TBA法来测定，其测定原理为MDA分子与硫代巴比妥酸(TBA)分子在酸性条件下共热，形成粉红色复合物，该复合物在波长532 nm处有最大吸收峰；还原型谷胱甘肽(GSH)可与二硫代二硝基甲酸(DTNB)反应，生成一种黄色化合物，可在405 nm波长处进行比色定量测定GSH含量；鳃组织的Na⁺-K⁺-ATP酶活性定义为：每小时每毫克组织蛋白的组织中ATP酶分解ATP产生1 μmol无机磷的量为1个ATP酶活性单位。

经实验测量得到的数据都表示为平均值±标准差(Mean±SD)。利用Excel 2003以及SPSS 22.0软件进行方差分析，Duncan氏检验进行显著性分析和多重比较，P < 0.05时，认为数据有显著性差异。由于对照组在各时间点的数据之间无显著差异(P > 0.05)，故都归于同一组。

对照组未经胁迫，鳃组织表现为正常的生理形态，鳃丝整齐密集，两侧鳃小片对称完整，上皮细胞排列规则，线粒体丰富细胞呈椭圆形(图 1-1)。离水胁迫后2 h，鳃组织轻微损伤，部分鳃丝两侧的鳃小片出现轻微弯曲，其中，鳃丝血管、基底层细胞未见异常(图 1-2)。胁迫后6 h，鳃组织损伤明显，鳃小片血管收缩，血细胞减少且红细胞染色不明显，着色力减弱，鳃丝部分区域的鳃小片出现弯曲，有些在中上部出现断裂。高倍镜下观察，鳃小片基底部的黏液细胞和线粒体丰富细胞数量增多，部分细胞出现水肿，体积增大(图 1-3)。胁迫后12 h，鳃损伤更为明显，主要表现为鳃小片严重弯曲，其末端出现肿胀，鳃小片出现多处断裂，大部分上皮细胞水肿变性(图 1-4)。胁迫后24 h，鳃组织表现为不可逆的损伤，鳃丝整体偏离正常形态，鳃小片扭曲紊乱，细胞变形严重，部分细胞核发生溶解(图 1-5、图 1-6)。

图 1(Fig. 1)

图 1 急性离水操作胁迫对四指马鲅鳃组织结构的影响 Figure 1 The effects of acute off-water handling stress on microstructure of gills of E. tetradactylum 1：对照组；2：胁迫后2 h；3：胁迫后6 h；4：胁迫后12 h；5、6：胁迫后24 h；MC：黏液细胞；PVC：扁平上皮细胞；MRC：线粒体丰富细胞；BL：鳃小片；BV：血管；BC：血细胞 1: Control group; 2: 2 h after off-water handling stress; 3: 6 h after off-water handling stress; 4: 12 h after off-water handling stress; 5 and 6: 24 h after off-water handling stress; MC: Mucous cells; PVC: Pavement cells; MRC: Mitochondrion-rich cells; BL: Gill lamella; BV: Blood vessel; BC: Blood cell

未经胁迫的对照组肌细胞呈现其正常形态，其外形呈纺锤状，肌纤维之间排列紧密，无弯曲现象，细胞核位于肌纤维的中央一侧(图 2-1)；在胁迫后2 h，肌肉组织部分区域出现肌纤维轻微变形扭曲，纤维束间隙增宽，肌细胞未见异常(图 2-2)。胁迫后6 h，肌组织损伤明显，肌纤维变形加剧，部分区域可见纤维束弯曲紊乱，有些部位发现肌纤维断裂，肌纤维间隙明显增宽，形成空泡(图 2-3)。胁迫后12 h，肌组织损伤更为明显，肌纤维排列紊乱，扭曲变形呈锯齿状，多处出现肌纤维断裂，肌细胞轻微变形，有些部位出现肌细胞核聚集现象，部分细胞核变形，肌纤维束间隙增宽，空泡化严重(图 2-4、图 2-5)。胁迫后24 h，肌肉组织损伤程度进一步加重，而肌纤维和肌细胞变形程度均加深，肌肉组织整体失去固有形态，呈逐渐分解的趋势(图 2-6)。

图 1(Fig. 1)

图 2 急性离水操作胁迫对四指马鲅肌肉组织结构的影响 Figure 2 The effects of acute off-water handling stress on microstructure of muscles of E. tetradactylum 1：对照组；2：胁迫后2h；3：胁迫后6 h；4、5：胁迫后12 h；6：胁迫后24 h；N：细胞核；M：肌细胞 1: Control group; 2: 2 h after off-water handling stress; 3: 6 h after off-water handling stress; 4 and 5: 12 h after off-water handling stress; 6: 24 h after off-water handling stress; N: Nucleus; M: Muscle cells

与对照组相比，离水胁迫后2 h的SOD活性显著下降(P < 0.05)。随着时间的延长，SOD活性渐渐升高，直到胁迫后12 h，SOD活性达到最高值，显著高于对照组及其他处理组(P < 0.05)。处理后24 h，SOD活性降到较低水平，显著低于对照组(P < 0.05)(图 3)。

图 1(Fig. 1)

图 3 急性离水操作胁迫对四指马鲅肌肉SOD活性的影响 Figure 3 The effects of acute off-water handling stress on the activity of SOD in muscles of E. tetradactylum 不同字母表示组间存在显著差异(P < 0.05)，下同 Different letters indicated significant differences among groups (P < 0.05), the same as below

胁迫后2 h，CAT活性无明显变化(P > 0.05)。随后，CAT活性明显升高，直到12 h达到最高值，显著高于对照组及其他处理组(P < 0.05)。处理后24 h，CAT活性降到最低值，显著低于对照组及其他处理组(P < 0.05)(图 4)。

图 1(Fig. 1)

图 4 急性离水操作胁迫对四指马鲅肌肉CAT活性的影响 Figure 4 The effects of acute off-water handling stress on the activity of CAT in muscles of E. tetradactylum

离水胁迫2 h，肌肉中MDA含量无明显变化(P > 0.05)。处理6 h后，MDA含量达到最大值，显著高于对照组及其他处理组(P < 0.05)。随着时间延长，MDA含量逐渐降低，直至24 h MDA含量降到处理前水平(图 5)。

图 1(Fig. 1)

图 5 急性离水操作胁迫对四指马鲅肌肉中MDA含量的影响 Figure 5 The effects of acute off-water handling stress on the content of MDA in muscles of E. tetradactylum

胁迫后2 h，GSH含量显著降低(P < 0.05)。随后其含量升高，直到胁迫后的12 h GSH含量达到最高值，显著高于对照组及其他实验组(P < 0.05)。胁迫后24 h，GSH含量恢复到正常水平，与对照组无显著差异(P > 0.05)(图 6)。

图 1(Fig. 1)

图 6 急性离水操作胁迫对四指马鲅肌肉中GSH含量的影响 Figure 6 The effects of acute off-water handling stress on the content of GSH in muscles of E. tetradactylum

在胁迫开始的2 h，肌肉T-AOC无显著变化(P > 0.05)。胁迫后2–12 h，肌肉T-AOC逐渐升高，直到胁迫后12 h达到最大值。胁迫后24 h，肌肉T-AOC与对照组无显著差异(图 7)。

图 1(Fig. 1)

图 7 急性离水操作胁迫对四指马鲅肌肉T-AOC的影响 Figure 7 The effects of acute off-water handling stress on T-AOC in muscles of E. tetradactylum

离水胁迫后2 h，鳃Na⁺-K⁺-ATPase活性明显升高(P < 0.05)；胁迫后6 h，Na⁺-K⁺-ATPase活性与胁迫后2 h无显著差异(P > 0.05)；胁迫后12 h，鳃Na⁺-K⁺-ATPase活性达到较高水平(P < 0.05)，24 h后酶活水平下降，与对照组无显著差异(P > 0.05)(图 8)。

图 1(Fig. 1)

图 8 急性离水操作胁迫对四指马鲅鳃Na+-K+-ATPase活性的影响 Figure 8 The effects of acute off-water handling stress on the activity of Na+-K+-ATPase in gills of E. tetradactylum

未经胁迫的四指马鲅幼鱼表现正常，即沿暂养池壁集体朝同一方向不停地游动；胁迫后2 h，其主要表现为向不同的方向快速、杂乱无章地游动，并撞击池壁；胁迫后6 h，个别幼鱼死亡，其他则仍无规律地游动、撞击池壁，但游动速度明显下降；胁迫后12 h，部分幼鱼死亡，其他则游泳动作不协调，速度减慢，甚至侧游或翻身游动；胁迫后24 h，四指马鲅幼鱼出现大量死亡，剩余幼鱼大部分处于侧游或翻身游动状态。

鱼类在进化过程中对内外界剌激形成了一定的适应能力，轻度刺激可促进鱼类的生长，改善鱼类体质(刘小玲, 2007)。但剧烈或长期的刺激会对鱼体产生危害，导致机体各种生理功能紊乱、甚至死亡。刘小玲(2007)的研究表明，鱼类的应激包括一系列复杂的生理变化，可分为初级、次级和第三级应激反应，其中，次级反应是由初级反应引起的组织和器官水平上的一系列功能和结构的变化。本研究表明，经过急性离水操作胁迫2 h后鳃小片、扁平上皮细胞及线粒体丰富细胞开始出现不同程度的损伤；肌肉从肌纤维变性、肌纤维束之间的间隙增宽，空泡化至肌肉组织整体失去固有形态呈逐渐分解的趋势，表明急性胁迫确实会引起四指马鲅显著的应激反应。急性离水操作胁迫后，鳃小片基底部的线粒体丰富细胞数量增多，这个结果与盐度胁迫遮目鱼(Chanos chanos)幼鱼实验的结果(区又君等, 2014)相类似。类比翁朝红等(2008)对大黄鱼的研究结果推测，这可能与四指马鲅为克服操作胁迫造成的应激反应，调动相关生理反应，增加额外的能量代谢有关。鱼类鳃部的黏液细胞可分泌大量黏液性物质，在鳃的表面形成一层对鳃组织具有保护作用的屏障，本研究发现，操作胁迫后6 h，黏液细胞数量增多，体积增大，也是机体抵御应激的保护机制(图 1-3、图 2-3)。在操作胁迫后6 h，鳃和肌肉的组织结构开始出现损伤，表明胁迫后6 h四指马鲅的应激反应已经进入次级反应阶段，随时间持续操作胁迫对机体鳃和肌肉组织造成的损伤逐渐加剧，表明所施加的胁迫强度已经超出机体能够适应和调控的范围，对鳃和肌肉产生不可逆的损伤。本研究结果显示，在四指马鲅的养殖管理过程中要科学操作，适当添加抗应激制剂，严格控制各种胁迫因子，避免造成不良影响。

Martínez-Álvarez等(2005)的研究表明，通常情况下，鱼体代谢产生的自由基处在动态平衡中。当受到外界环境干扰之后，平衡被打破，自由基大量积累，过量的自由基会对鱼体产生不利影响。一般情况下，鱼体率先利用第一道防线(如V_C、V_E等小分子非酶物质)清除过多的自由基；当第一道防线不足以清除过多的自由基时，鱼体则会启动第二道防线，即合成相应的抗氧化酶以减少氧化压力。本研究中，操作胁迫后2 h，肌肉SOD、GSH活性出现显著性下降，表明SOD、GSH可以作为四指马鲅受到氧化应激的灵敏指示物，这也与其功能相一致。CAT、GSH活性也在操作胁迫后2 h下降，但变化不显著，T-AOC稍微增加，表明此时肌肉组织主要依靠第一道防线抵御胁迫造成的氧化应激，尚未启动抗氧化酶系统来应对操作胁迫。在整个处理过程中，SOD、GSH与CAT活性有相同的变化趋势，也证明了四指马鲅肌肉组织SOD、CAT和GSH之间在抗氧化应激方面具有协同作用，此结论与杨唐斌等(1994)的研究结果相似。胁迫后6 h，实验所测抗氧化酶都出现显著增加，表明机体已经启动抗氧化系统清除逐渐增多的自由基，这与孙鹏等(2014)对云纹石斑鱼进行惊扰胁迫的研究结果类似；操作胁迫后12 h，四指马鲅肌肉组织内积累的自由基达到最高峰，随后就逐渐下降，这也是操作胁迫后机体内氧化压力与抗氧化防御响应之间动态互作过程，表明抗氧化酶系统在应对氧化压力过程中发挥主要作用。

Srikanth等(2013)的研究表明，鱼类氧化应激响应在不同种类的鱼中呈现特定的时间变化趋势。在研究胁迫因子对银鲳、广东鲂(Megalobrama terminalis)、条石鲷(Oplegnathus fasciatus)和黄姑鱼(Nibea albiflora)影响的实验中发现，随处理时间延长，抗氧化酶呈现增高的变化趋势，之后体内新的平衡机制建立，抗氧化酶活性也恢复到正常水平(尹飞等, 2011; 谢明媚等, 2015; 曾艳艺等, 2014; 孙鹏等, 2010; 张晨捷等, 2015)。本研究中，相应的抗氧化酶活性先下降，可能是机体尚未形成有效的抵抗机制，之后才逐渐升高，并在处理后24 h又下降，这与以上研究结果相似。宋林生等(2004)在温度骤升对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)肝胰腺中抗氧化酶活性的研究结果显示，温度升高后，CAT和SOD马上出现显著降低，MDA含量一直增加，认为抗氧化系统受到一定程度的影响，造成机体细胞结构和功能的丧失。本研究中，虽然抗氧化酶活性在胁迫后2 h出现下降，但从6 h又出现上升，表明其细胞结构和功能仍然正常，其下降的原因可能是四指马鲅迅速启动第一道防线，大量释放还原性物质V_C、V_E消除自由基，导致机体氧化水平迅速降低有关，但具体作用机制还需要进一步的深入研究。在处理后24 h，SOD、CAT、MDA和GSH抗氧化指标均低于处理前，而T-AOC和处理前保持一致，表明此时肌肉组织的抗氧化应激主要是非酶促反应。在本研究中，只观察到胁迫后24 h的变化过程，尚不能判定四指马鲅肌肉抗氧化酶系统是否受到损伤，故不能确定其抗氧化酶系统和氧化压力之间平衡机制是否仍然有效运行。基于本研究结果，初步认为四指马鲅肌肉组织应对氧化应激的策略是先依靠第一道防线，然后启动抗氧化酶系统，新平衡建立阶段仍然是非酶促反应。

Papadimitriou等(2002)对湖蛙(Rana ridibunda)的研究表明，细胞中过氧化脂降解产物MDA的含量反映了机体脂质过氧化程度，其间接反映了细胞损伤程度。本研究中，胁迫处理后2 h，MDA含量逐渐升高直到6 h达到最高值，之后MDA降低(图 3)，这表明，操作胁迫后6 h MDA含量逐渐积累到最大值，机体细胞已经受到损伤，这也与组织切片观察的结果相一致。然而，其他抗氧化酶在胁迫后12 h活性最高，MDA高峰出现早于其他抗氧化酶，表示如果抗氧化酶不能及时清除多余的自由基，膜脂过氧化的程度就会加重。表明鱼体通过调节体内抗氧化酶活性，可以使体内脂质过氧化程度降低。本研究结果显示，MDA可以作为四指马鲅氧化损伤的快速响应生物标记物。

尹飞等(2011)的研究表明，Na⁺-K⁺-ATPase是组成Na⁺-K⁺泵活性的主要部分，Na⁺-K⁺-ATPase可水解ATP产生ADP和能量，同时也是一项评价环境胁迫影响的生物学指标。经过离水胁迫后，四指马鲅幼鱼鳃中Na⁺-K⁺-ATPase活性显著升高(P < 0.05)，直到胁迫后12 h，Na⁺-K⁺-ATPase活性达到峰值。组织学观察结果也显示，鳃小片基底部的线粒体丰富细胞数量增多，这两方面的结果相互支持，表明四指马鲅鳃在应对氧化应激过程中耗能较大，需要Na⁺-K⁺-ATPase活性增强，提供抗氧化应激所需能量。胁迫处理后24 h，Na⁺-K⁺-ATPase活性和处理前无显著差异，表明鳃结构和功能尚未受到严重破坏，由于氧化压力降低，鳃中Na⁺-K⁺泵耗能也恢复到处理前水平。