2. 中国水产科学研究院南海水产研究所 广东省渔业生态环境重点实验室 农业部南海渔业资源开发利用重点实验室 广州 510300;
3. 南海生物资源开发与利用协同创新中心 广州 510275;
4. 中国水产科学研究院南海水产研
2. Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation & Utilization, Ministry of Agriculture; Key Laboratory of Fishery Ecology and Environment, Guangdong Province; South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300;
3. South China Sea Bio-Resource Exploitation and Utilization Collaborative Innovation Center, Guangzhou 510275;
4. Tropical Aquaculture Research and Development Center of South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Sanya 572018
池塘中有害甲藻频繁暴发，对养殖水产动物的健康生长造成严重威胁(周进等, 2014; 龚良玉等, 2010; 程玲等, 2016)。目前，防控有害甲藻暴发主要通过向水体中投入CuSO4、KMnO4和漂白粉等化学药物抑制或杀灭有害甲藻(刘征宇等, 2016; 李京等, 2009; Kuzminov et al, 2013)。该方式虽操作简单、起效快，但易造成二次污染，不利于水体生态环境的恢复(骆灵喜等, 2015)。随着生态系统稳定性和生物安全等问题日益受到重视，生态法控藻逐渐成为新趋势，其中，溶藻菌更是生物控藻领域的一个研究热点(王寿兵等, 2016)。
溶藻菌是指能够通过直接或间接方式抑制藻类生长或杀死藻类、溶解藻细胞的细菌(Lupette et al, 2016)。已发现的溶藻菌属主要有芽孢杆菌属(Bacillus sp.)(Hou et al, 2016)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)(陈庆丽等, 2015)、交替假单胞菌属(Pseudoaltero-monas sp.)(Cai et al, 2011)、红细菌属(Rhodobacte-raceae sp.)(Chen et al, 2014)、海杆菌属(Marinobacter sp.)(郗建云等, 2016)等。在自然水环境中存在可溶解有害甲藻的藻际溶藻菌，但其物种数量有限，群落结构简单，菌体生物量相对较低(Grossart et al, 2005)，加之当环境营养和生态条件改变时，菌–藻动态失衡，有害甲藻易在短时间内暴发成为优势种，致使菌群结构发生改变，有效溶藻菌浓度降低，其溶藻效应受到抑制(史荣君等, 2013; 李东等, 2013)。因此，设法强化溶藻菌的生态优势、提高有效溶藻菌浓度、维护菌藻间的生态平衡是有效防控甲藻暴发的重要途径之一。Yang等(2013)和苗祯等(2015)指出，菌群结构的改变往往体现在能源物质利用效能的变化。溶藻菌的能源物质来源主要为碳、氮营养物质(张俊等, 2010)。另外，能对菌群结构产生影响的还包括温度、溶氧、pH值等生态因素。王金霞等(2012)分析了环境因子对溶藻菌S7的影响，指出在不同环境因素下，菌–藻动态平衡会发生不同的变动，进而造成微藻暴发式增长或溶藻菌抑藻的不同结果。因此，科学探究营养和生态因子对溶藻菌生长的影响，对调控和促进溶藻菌生物量的增长，强化其溶藻效应具有重要意义。
目前的研究大多只是以单因素实验方法分析营养或生态因子对溶藻菌的影响(赵鹏超等, 2012; 张家顺等, 2015)，该法虽然操作简单，但不能进行横向比较，无法判断出主效因素。Plackett-Burman实验是一种能估计出各个因素的效应值并筛选出显著影响因素的实验方法。该方法不仅实验次数少、实验结果精确，而且可以横向比较各因素的效应值(Maneeboon et al, 2010)。在自然生态环境中，营养和生态因素于同一时空维度对溶藻菌产生协同影响(谢凤行等, 2013; 费聿涛等, 2016; 魏南等, 2016)。为此，本研究选择一株具有良好甲藻溶藻专一性的芽孢杆菌A4，在分析不同碳源和氮源对菌株生长影响的基础上，再以Plackett-Burman方法综合比较碳、氮、pH、接种菌量、温度、转速、装液量等因子对菌株生长的协同影响，明确在多因素共同作用下各因素对菌株生长影响的贡献，为进一步优化芽孢杆菌A4的培养条件及菌剂研发与应用提供参考。
1 材料与方法 1.1 菌株芽孢杆菌A4由中国水产科学研究院南海水产研究所提供，该菌株从甲藻暴发海域的滩涂池塘中分离获得，具有良好的甲藻溶藻专一性，能高效溶解锥状斯氏藻(Scrippsiella trochoidea)、海洋原甲藻(Prorocentrum micans)、楯形多甲藻(Peridinium umbonatum)等有害甲藻，而对蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、条纹小环藻(Cyclotella striata)、四尾栅藻(Scenedesmus quadricauda)等有益微藻无不良影响(郗建云, 2016)1)。
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1.2 培养基基础培养基：葡萄糖10.00 g/L，蛋白胨3.00 g/L，NaCl 1.00 g/L，KH2PO40.20 g/L，MgSO4 0.20 g/L，MnSO4 0.03 g/L，CaCl2 0.10 g/L。参考杨莺莺等(2005)和Rao等(2007)的方法配制。种子培养基为营养肉汤培养基，培养平板为营养琼脂培养基。
1.3 种子液的制备取斜面菌种，接种至种子培养基，200 r/min 30℃恒温摇床振荡培养12 h。
1.4 不同碳源、氮源对菌株生长的影响碳源分别用蔗糖(Su)、葡萄糖–蔗糖(G-Su)、可溶性淀粉(St)、糖蜜(M)、玉米浆(C)、麸皮–糖蜜(B-M)及可溶性淀粉–玉米浆(St-C)等量替代基础培养基中的葡萄糖(G)，配制成不同碳源的培养基。氮源分别用酵母膏(Y)、蛋白胨–酵母膏(P-Y)、硫酸铵(A)、豆粕(Sm)、大豆蛋白(Sp)及豆粕–大豆蛋白(Sm-Sp)等量替代基础培养基中的氮源蛋白胨(P)，配制成不同氮源的培养基。将A4菌种子液以1%的量分别接种至不同的培养基，30℃、200 r/min摇床培养24 h，以平板计数法测定菌浓度(沈萍等, 1996)，分析不同碳源和氮源对A4菌生长的影响。
1.5 影响菌株生长的多因素分析根据1.4的测定结果，参考Venil等(2015)的方法，以Plackett-Burman实验设计法，选取玉米浆、大豆蛋白、pH、接种菌量、温度、转速、装液量7个因子作为测试变量。各变量分别取高、低值2个水平，测试次数设定为12，并增设4个虚拟变量以减少系统误差(表 1)。再以菌浓度作为响应值对比分析以上各因子对A4菌生长影响的贡献。
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表 1 Plackett-Burman实验设计的因素及水平编码 Table 1 Factors and levels designed by Plackett-Burman method |
以单因素方差分析(One-Way ANOVA)比较各因素的差异性，显著性水平设定为P < 0.05；通过Design-Expert(8.0.6.1)软件对Plackett-Burman实验结果进行方差分析，比较各因素贡献率。
2 结果与分析 2.1 不同碳源对菌株生长的影响不同碳源的培养基中，A4菌的终菌量依次为玉米浆组(C) > 麸皮–糖蜜组(B-M) > 可溶性淀粉–玉米浆组(St-C) > 糖蜜组(M) > 可溶性淀粉组(St) > 葡萄糖–蔗糖组(G-Su) > 蔗糖组(Su) > 葡萄糖组(G)。单因素方差分析结果显示，不同碳源对A4菌生长的影响有显著差异(图 1)。其中，玉米浆组(C)菌浓度最高(3.58×108 CFU/ml)，与麸皮–糖蜜组(B-M)差异不显著(P > 0.05)，但显著高于其他碳源实验组(P < 0.05)。因玉米浆(C)组的菌量最佳，将其作为培养基碳源进行后续研究。
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图 1 不同碳源条件下A4菌的菌量 Figure 1 Quantity of Bacillus A4 cultured with different carbon sources 字母完全相同或部分相同表示差异不显著(P > 0.05)，反之表示差异显著(P < 0.05)；后图同此。St：可溶性淀粉；C：玉米浆；St-C：可溶性淀粉–玉米浆；M：糖蜜；B-M：麸皮–糖蜜；G：葡萄糖；Su：蔗糖；G-Su：葡萄糖–蔗糖 The same letters or partially same letters indicated no significant difference (P > 0.05), while different letters indicated significant difference (P < 0.05); the same applied as followings. St: Starch; C: Corn steep liquor; St-C: Starch-Corn steep liquor; M: Molasses; B-M: Bran-Molasses; G: Glucose; Su: Sucrose; G-Su: Glucose-Sucrose |
不同氮源培养基中，A4菌的终菌量依次为大豆蛋白组(Sp) > 豆粕–大豆蛋白组(Sm-Sp) > 豆粕组(Sm) > 蛋白胨组(P) > 酵母膏组(Y) > 蛋白胨–酵母膏组(P-Y) > 硫酸铵组(A)(图 2)。单因素方差分析结果显示，不同氮源组菌株的生长状况不同。其中，大豆蛋白组(Sp)和豆粕–大豆蛋白组(Sm-Sp)的菌量差异不显著(P > 0.05)，但显著高于其他实验组(P < 0.05)，分别达到3.19×108、1.85×108 CFU/ml。因大豆蛋白组(Sp)的菌量最佳，将其作为培养基氮源进行后续研究。
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图 2 不同氮源条件下A4菌的菌量 Figure 2 Quantity of Bacillus A4 cultured with different nitrogen sources P：蛋白胨；Y：酵母膏；P-Y：蛋白胨–酵母膏；Sm：豆粕；Sp：大豆蛋白；Sm-Sp：豆粕–大豆蛋白；A：硫酸铵 P: Peptone; Y: Yeast; P-Y: Peptone-Yeast; Sm: Soybean meal; Sp: Soybean protein; Sm-Sp: Soybean meal-Soybean protein; A: Ammonium sulfate |
根据Plackett-Burman实验结果建立多元拟合方程，分析各因素对A4菌的影响贡献，数学模型方程如下：
Y=0.65X1+2.04X2+0.27X3+1.22X4+0.45X5－0.19X6－0.37X7+6.30
式中，Y为菌浓度，X1–X7分别为玉米浆、大豆蛋白、pH、接种菌量、转速、温度、装液量7个因素的编码值。该方程决定系数为0.9630，校正系数为0.8982，表明该模型方程可靠性良好(表 3)。方差分析结果显示，各因素的重要性排序依次为大豆蛋白 > 温度 > 玉米浆 > 转速 > 接种菌量 > pH > 装液量。各因素对菌株生长影响的贡献差别明显。其中，大豆蛋白、温度对菌浓度影响显著(P < 0.05)。可见，除了温度之外，碳、氮营养因素对菌株生长影响贡献明显大于其他培养条件。
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表 3 不同因素对A4菌生长影响的重要性 Table 3 The effects of different factors on the growth of Bacillus A4 |
碳、氮是微生物生长过程中主要的营养物质。碳源作为微生物生长所需的基础营养物质，既能为菌体成分合成提供原材料，又是微生物生长的能量来源；氮源主要用于菌体细胞物质(氨基酸、蛋白质、核酸等)和含氮代谢物的合成(徐洪伟等, 2011; 朱永真等, 2011)。不同的微生物可利用不同的碳、氮源(付维来等, 2012)。实验室及工业化生产中常用的碳、氮源主要分为有机和无机两类(王丽娜, 2014; 马勇等, 2011)。在本研究中，A4菌对天然有机碳源玉米浆和天然有机氮源大豆蛋白利用效果最好，培养24 h后菌量分别达到3.58×108、3.19×108 CFU/ml。这与张文芝等(2010)的报道存在差别，他们认为蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus)AR156的最佳碳、氮源分别为麦芽糖和黄豆粉，培养24 h后菌量分别达到4.76×108、4.56×108 CFU/ml。以上2株菌均为芽孢杆菌属，但最佳碳、氮营养物质存在差别，原因可能是微生物之间存在菌种和菌株的差异性，不同种菌株所产生的酶系不同，造成其对营养物质的利用存在差异。本研究，对碳源、氮源的单因素实验分析表明，A4菌对天然有机物的利用效果明显优于单一有机物和无机物。
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表 2 Plackett-Burman实验设计与结果 Table 2 The design and results of Plackett-Burman test |
温度、溶氧、pH等因子往往与营养因子协同影响微生物生长(高灯州等, 2016; 全汉锋等, 2015; 王欣等, 2014)。温度对微生物的影响主要体现在微生物体内的生化反应，当温度适宜时，微生物体内的酶活相对较高，这会刺激微生物加快代谢促进生长，不适宜的温度则会抑制体内代谢直至死亡(黄思明等, 2013)。pH会影响微生物细胞膜电荷的变化以及代谢过程中酶的活性，进而影响其吸收利用营养物质(李楠等, 2013)。溶氧对微生物的影响主要表现在代谢活动中，一般好氧微生物对溶氧的需求量较大(钱骅等, 2015)。在本研究中，溶氧含量主要通过装液量和转速来调节。装液量是通过控制气液比调节溶氧，转速则是通过水流速度控制气液接触时间调节溶氧(冯玉枚等, 2015; 董淑浩等, 2015)。培养条件对微生物生长的影响作用体现在两个方面，一是溶藻菌的产业化培养过程；二是溶藻菌在池塘的应用过程(刘萍等, 2015)。本研究结果显示，除温度外，pH、溶氧、接种菌量对A4菌生长的影响均不显著，表明A4菌对pH及溶氧的波动不敏感，生理功能相对稳定，有利于产业化生产。在池塘应用过程中，养殖水体理化条件会随着季节及昼夜变化处于波动状态(祁萍等, 2013)。朱浩等(2012)于2009–2010年对上海松江鱼塘的水质进行监测，pH波动范围为7.4–8.2，溶氧波动范围为4–14 mg/L；李卓佳等(2010)对广东汕尾对虾养殖池塘水质进行监测，pH波动范围为7.21–9.37，溶氧波动范围为4–15 mg/L。A4菌对溶氧及pH波动的耐受力较强，可适应上述养殖水体环境，有利于推广与应用。
3.3 多因素的协同影响在对菌株生长条件的探索中，目前研究多关注于营养物质中碳、氮源的筛选及优化(刘金玲等, 2016)，对营养因素和培养条件的协同效应关注不多(胡建恩等, 2012; 石飞虹等, 2009)。另外，目前研究多限于利用单因素实验分析，在其他因子恒定的情况下纵向比较某一因子的影响，虽然操作简单，但不能进行横向比较，无法判断出主效因素(代志凯等, 2010)。Plackett-Burman实验是一种能估计出各个因素的主效应并筛选出显著影响因素的实验方法(Maneeboon et al, 2010)。因此，本研究利用Plackett-Burman实验分析法，对营养条件及培养条件的7个因子进行综合对比分析。研究表明，大豆蛋白和温度对A4菌的生长影响最显著，其余依次是玉米浆、转速、接种量、pH值、装液量。一方面，说明A4菌的生长对氮源的选择性更高；另一方面说明温度对A4菌生长的重要性显著高于碳源，表明培养条件对菌株生长调控也有重要意义。因此，在评估相关因素对菌株生长的影响时，须将营养和培养条件共同加以考虑和比对分析。同时，水体生态环境是复杂的，在没有探清各因素对A4菌生长的综合影响时，将其投放到不适宜生长的水体中，可能难以达到溶藻效果。对此，应综合考虑环境中各种生物因素和非生物因素的影响，从多层面、多角度进行整体性研究分析，建立有效的培养方案。
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