2. 天津现代晨辉科技集团有限公司 天津 301800
2. Tianjin Chenhui Modern Technology Limited Company, Tianjin 301800
黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)是一种小型底层淡水经济鱼类,在我国众多水域都有分布,尤其是在长江中下游的湖泊、池塘、溪流中分布广泛(倪勇等, 2006; 李明锋, 2010)。黄颡鱼对生态环境适应性强,且具有极强的耐受性,其味道鲜美,营养价值高,深受人们青睐。随着养殖规模的扩大和养殖密度的增加,黄颡鱼的抗应激能力下降,疾病频发,经济损失很大,开发黄颡鱼用纯天然环保型免疫增强剂迫在眉睫。
姜黄素(Curcumin)是从植物姜黄(Curcumin longa L)中提取的一种黄色酸性酚类物质,是姜黄发挥药理作用最主要的活性成分,主要产于中国、日本、印度等国家热带、亚热带地区(杨小萍等, 2009)。姜黄素色泽稳定且无毒,已经被广泛用作食品色素和调味剂。随着对姜黄素研究的不断深入,其抗炎、抑菌、抗氧化、增强免疫等功能不断被人们发掘(顾军等, 2000)。但姜黄素在水产方面应用的报道仍较少。故本研究通过在黄颡鱼饲料中添加不同水平的姜黄素,探讨其对黄颡鱼生长、肠道消化酶活性和抗氧化能力的影响,以期为姜黄素在黄颡鱼饲料中的应用提供进一步参考。
1 材料与方法 1.1 姜黄素购于郑州永尚化工产品有限公司,纯度为10%。
1.2 实验设计与饲养管理实验在天津市蓝科水产有限公司进行,选取健康的1龄黄颡鱼720尾,平均体重为(13.17±0.68) g,初始体长为(11.86±0.53) cm,随机分为6组,每组3个重复,每个重复40尾鱼。在基础饲料中添加0、50、100、200、400、800 mg/kg姜黄素的6种实验饲料,分别饲喂6组实验鱼,分别标记为T1–T6,T1为对照组。各种原料经粉碎机粉碎后,过60目筛,混匀加水,用江苏牧羊集团牧羊MUZLM V4型饲料制粒机加工成粒径为2 mm的沉性颗粒饲料,于室温通风处晾干2 h,保存于–20℃冰箱中待用。
每组实验鱼饲养在1.5 m (直径)×0.75 m (高)的玻璃拉丝鱼缸中,实验期间水温为(24±2)℃,连续充氧,每天换水1/2,日投饲率为3%,每天投喂2次,根据具体情况进行调整。实验周期为60 d。实验饲料组成及营养水平见表 1。
养殖实验结束后,每个重复随机抽取黄颡鱼15尾,使用MS-222麻醉,擦拭体表后,使用2 ml一次性无菌注射器进行尾静脉取血,4500 r/min离心15 min,制得血清样品。在冰浴条件下解剖抽血后的黄颡鱼,剥取脑、鳃、肝胰脏、脾脏、中肾、头肾、前肠、中肠、后肠、胃组织。从食道括约肌后到第一个弯曲止为前肠,中肠自第一弯曲到第二弯曲止,此后至肛门一段的直肠为后肠。肠道、胃组织按质量体积比1:4加入预冷生理盐水,其余组织加入1:9预冷生理盐水,所有组织均用YQ-3型电动匀浆机在冰浴条件下进行组织匀浆。匀浆液使用Eppendorf冷冻离心机于4℃、3000 r/min离心15 min,提取上清液即为粗酶液。
1.3.2 生长指标的测定增重率(WGR, %)=100×(Wt–W0)/W0;
特定生长率(SGR, %/d)=(lnWt–lnW0)×100/t;
饲料系数(FCR)=Id/(Wt–W0)
蛋白质效率(PER, %)=(Wt–W0)/(Id×Pd);
存活率(SR, %)=Nt×100/N0
式中,Wt和W0分别为鱼的终末体重和初始体重(g);t为实验天数;Id为摄食量的干重(g);Nt,N0分别为实验末期和初期的鱼体总数;Pd为饲料中蛋白含量。
1.3.3 生化指标的测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、谷胱甘肽(GSH)、一氧化氮(NO)、消化酶等指标,均采用南京建成生物工程技术研究所的试剂盒进行测定。
1.3.4 饲料常规成分测定方法参照最新国标要求,测定饲料常规成分含量,方法如下:水分用105℃常压恒温烘干法(GB/T5009.3-2010)测定,粗蛋白用杜马斯灼烧法(GB/T24318-2009)测定,粗脂肪用索氏抽提法(GB/T5009.6-2010)测定,粗灰分用550℃高温灼烧法(GB/T5009.4-2010)测定。
1.4 数据处理实验数据用平均值±标准误(Mean±SE)表示,数据分析采用SPSS 17.0软件中的单因素方差分析(One-way ANOVA)处理,以P < 0.05为差异显著。
2 结果 2.1 姜黄素对黄颡鱼生长性能的影响投喂添加不同水平姜黄素的饲料,60 d后,测定实验鱼的体重和体长,计算增重率、特定增长率、存活率、饲料系数和蛋白质效率(表 2)。从表 2可以看出,随着姜黄素含量的增加,增重率呈现先升高后下降的变化趋势,其中,T4组增重率显著高于对照组(P < 0.05),其余各组之间差别不显著(P > 0.05);特定增长率呈现先升高后下降的变化趋势,各实验组均显著高于对照组(P < 0.05);饲料系数呈现先下降后升高的变化趋势,T3、T4组饲料系数显著低于对照组(P < 0.05);存活率呈现先升高后下降的变化趋势,各实验组均显著高于对照组(P < 0.05);蛋白质效率呈现先升高后下降的变化趋势,其中,T4组蛋白质效率与对照组相比显著升高(P < 0.05),其余各组之间无显著差异(P > 0.05)。参考生长指标,200 mg/kg姜黄素水平(第4组)可显著提高黄颡鱼生长性能。
黄颡鱼脂肪酶活力为前肠 > 中肠 > 胃 > 后肠。前肠T3组、T4组、T5组脂肪酶活力显著高于对照组(P < 0.05),随着姜黄素添加量的升高,脂肪酶活力呈现先上升后下降的趋势;T5组后肠脂肪酶活力显著高于对照组(P < 0.05);各实验组,中肠脂肪酶活力与对照组相比无显著差异(P > 0.05);T5、T6组胃脂肪酶显著高于对照组(P < 0.05)。
黄颡鱼淀粉酶活力为中肠 > 后肠 > 前肠 > 胃。T4组前肠淀粉酶活力显著高于对照组(P < 0.05),随着姜黄素添加量的升高,淀粉酶活力呈现先上升后下降的趋势;各实验组中肠、后肠和胃淀粉酶活力与对照组相比无显著差异(P > 0.05)。
黄颡鱼蛋白酶活力为胃 > 前肠 > 中肠 > 后肠。T2组黄颡鱼中肠蛋白酶活力显著高于对照组(P < 0.05)。各实验组前肠、后肠和胃蛋白酶活力与对照组相比无显著差异(P > 0.05)(表 3)。
黄颡鱼体内SOD活力为脑 > 鳃 > 肝胰脏 > 脾脏 > 中肾 > 头肾 > 血清(表 4)。与对照组相比,T6组肝胰脏、T5组脾脏、T4组头肾的SOD活力均有显著提升(P < 0.05)。T4组鳃、T5组脑、各组血清的SOD活力与对照组相比显著升高(P < 0.05)。
黄颡鱼体内MDA含量为肝胰脏 < 鳃 < 头肾 < 中肾 < 血清 < 脾脏 < 脑(表 5)。T4组肝胰脏的MDA含量显著低于对照组(P < 0.05);T5、T6组头肾的MDA含量均显著低于对照组(P < 0.05);实验各组脑的MDA含量均显著低于对照组(P < 0.05);其余各组织实验组的MDA含量与对照组相比无显著差异(P > 0.05) (表 5)。
黄颡鱼体内各组织CAT活力为肝胰脏 > 脑 > 鳃 > 血清 > 中肾 > 头肾 > 脾脏。T6组肝胰脏、T5组脾脏的CAT活力显著高于对照组(P < 0.05);其余组织的CAT活力与对照组相比无显著差异(P > 0.05)(表 6)。
黄颡鱼体内各组织GSH-PX活力为头肾 > 肝胰脏 > 血清 > 中肾 > 脾脏 > 鳃 > 脑。与对照组相比,T4组肝胰脏、T5组脾脏与T5组中肾的GSH-PX活力显著提升(P < 0.05);各组血清的GSH-PX活力均显著高于对照组(P < 0.05),且呈现先上升后下降的趋势;姜黄素对黄颡鱼头肾、鳃、脑的GSH-PX活力无显著影响(P > 0.05)(表 7)。
黄颡鱼体内各组织GSH含量为血清 > 脑 > 头肾 > 肝胰脏 > 鳃 > 中肾 > 脾脏。各组肝胰脏的GSH含量均显著高于对照组(P < 0.05),且呈现先上升后下降的趋势;T6组脾脏、T5组中肾、T4组鳃、T5组血清中的GSH含量均显著高于对照组(P < 0.05);姜黄素对黄颡鱼头肾、脑GSH含量无显著影响(P > 0.05)(表 8)。
黄颡鱼体内各组织NO含量为血清 > 中肾 > 脑 > 鳃 > 肝胰脏 > 脾脏 > 头肾。各实验组中肾、头肾、脑、鳃NO含量与对照组相比无显著差异(P > 0.05);T5组肝胰脏、T4组脾脏和T4组血清的NO含量显著高于对照组(P < 0.05)(表 9)。
本研究发现,在饲料中添加不同水平的姜黄素饲喂黄颡鱼,对促进鱼体的增重率、特定增长率、存活率、降低饲料系数及提高蛋白质效率均有一定的功效。其中,400 mg/kg姜黄素水平对黄颡鱼存活率和肥满度的提高效果最佳,而200 mg/kg姜黄素水平对黄颡鱼增重率、特定增长率的促进效果和降低饲料系数的效果最佳。陈征义等(2010)研究发现,姜黄素能显著提高实验前期肉仔鸡的末重、日增重、料重比及肉仔鸡的存活率(P < 0.05),促进肉仔鸡的生长,这与本研究结果相似。王斌等(2010)报道,杜长大肥育猪饲料中添加400 mg/kg的姜黄素,饲喂3周,发现对肥育猪的生长性能影响显著(P < 0.05),这与本研究结果类似。但其达到最佳效果的姜黄素添加量比本研究高,这可能是由于实验动物不同造成的。对水产动物的研究表明,在饲料中添加姜黄素可以提高水产动物的生长性能。胡忠泽等(2003)在姜黄素喂食草鱼(Ctenopharyngodon idellus)的研究中,分别在草鱼基础饲料中添加姜黄素,实验时间为30 d,结果显示,在草鱼饲料中添加0.02%、0.04%和0.06%的姜黄素可以分别使相对生长率提高14.67%、16.22%和22.93%,同时,饲料系数分别降低13.29%、9.79%和18.88%,表明姜黄素对草鱼生长具有明显的促进作用,可提高饲料利用率和蛋白质效率,这与本研究结果一致。姜黄素可能通过提高鱼体对蛋白质的利用率,从而促进其生长性能。俞军等(2015)研究表明,投喂含姜黄素的饵料45 d后,大黄鱼SR和SGR显著提高。饵料中添加300 mg/kg姜黄素能有效提高大黄鱼的生长性能,且长期投喂效果更佳,是一种安全高效的饲料添加剂。史合群等(2013)的实验结果显示,草鱼基础饲料中添加200 mg/kg的姜黄素能够显著提高草鱼相对增重率(P < 0.05),降低饲料系数(P < 0.05),该研究中添加剂量与本研究较为接近,但由于研究对象规格种类的不同,姜黄素在黄颡鱼基础饲料中的最适添加量仍需进一步研究。
3.2 姜黄素对黄颡鱼消化能力的影响鱼类体内消化酶活力直接影响着机体对营养物质的消化与吸收,对鱼体的生长速度起决定性作用(吴旋, 2011)1)。蛋白酶能够将难被机体直接吸收的蛋白质降解为蛋白胨和氨基酸等小分子物质;脂肪酶能够催化油脂水解为脂肪酸、甘油等;淀粉酶能够将淀粉、糖原等水解为麦芽糖、葡萄糖等容易被鱼类吸收的单糖(牛凤池等, 2015)。已有研究表明,饲料中添加姜黄素可以提高鱼类肠道消化酶的活力。张宝彤等(2014)在罗非鱼(Oreochromis spp)的基础饲料中添加姜黄素,发现罗非鱼中肠绒毛数和绒毛高度显著增加,进而提高了罗非鱼肠道消化酶活力,此结果在一定程度上揭示了姜黄素促进罗非鱼肠道消化酶活力的机理。胡忠泽等(2003)研究表明,当在草鱼饲料中姜黄素添加量为0.02%–0.06%时,可以极显著提高草鱼肠道蛋白酶和淀粉酶的活力(P < 0.01)。与上述研究结果相似,本研究中添加200–400 mg/kg姜黄素可以有效提高黄颡鱼肠道和胃的消化酶活力,从而促进黄颡鱼的生长,但本研究中未涉及姜黄素对黄颡鱼肠道和胃组织结构影响,姜黄素对黄颡鱼肠道及胃的作用机理仍需今后进一步深入探讨。
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3.3 姜黄素对黄颡鱼抗氧化能力的影响姜黄素分子中具有多个功能基团,如2个苯丙烯酸基骨架、苯环上的酚羟基和甲氧基及丙烯基与β-双酮/烯醇式结构的连接,使姜黄素具有很强的抗氧化活性(Ramassamy, 2006)。姜黄素可通过诱导抗氧化酶及还原性物质的生成和活化,如SOD、CAT、GSH等,将多种超氧化物、过氧化物、氧化物等自由基分解或还原,从而起到抗氧化、减少氧化应激损伤的作用(李薇等, 2009)。卢婉怡(2014)用姜黄素添加到饲料中投喂奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus×O. aureus),结果显示,饲料中添加姜黄素能有效提高罗非鱼机体的SOD和CAT活力,800 mg/kg剂量对肝胰脏SOD和CAT活力的提高作用显著(P < 0.05)。张宝彤等(2014)将姜黄素添加到罗非鱼的基础饲料中,结果显示,姜黄素可显著提高罗非鱼的抗氧化能力(P < 0.05),添加姜黄素实验组罗非鱼肝胰脏、肌肉和血清等组织中MDA含量以0.02%水平组最低,显著低于其他实验组(P < 0.05)。本研究结果显示,姜黄素添加到饲料中投喂黄颡鱼,鱼体内各组织SOD、CAT活力均提高,且在鳃和脑等气体交换密切的组织中SOD、CAT活力明显高于肾脏、脾脏等组织,同时,肝胰脏、脑和头肾的MDA含量也显著降低。说明姜黄素通过诱导黄颡鱼鱼体内抗氧化酶和还原性物质的生成,提高了黄颡鱼抗氧化能力。目前,未见关于姜黄素对黄颡鱼脑组织抗氧化酶活性的研究报道,本研究发现脑组织抗氧化酶活性较强,且在投喂添加姜黄素的饲料后效果更显著,表明姜黄素在今后的生产实践中具有良好的开发前景及应用空间。
GSH-PX可分解过氧化物,可在CAT含量少的组织中代替CAT清除H2O2,从而防止机体遭受氧化损伤(Kohen et al, 2002)。GSH能自行或经GSH-PX催化还原H2O2和过氧化脂质,消除自由基造成的损伤(Chen et al, 2009)。本研究中,添加不同水平姜黄素投喂黄颡鱼可以显著提高黄颡鱼肝胰脏、脾脏、血清的GSH-PX活性和GSH含量(P < 0.05)。
iNOS是介导炎症反应的重要酶,iNOS催化L-精氨酸氧化成NO(Murakami, 2009)。NO在生理上涉及血管舒张、神经传递、血小板凝集、免疫防御和胞内信号转导。NO和O2反应形成强烈氧化性物质过氧化亚硝酸盐(狄建彬等, 2010)。在本研究的各组织中,姜黄素对黄颡鱼肝胰脏、头肾的NO含量有促进作用,对鳃、脑这类氧交换密切的组织的NO含量有抑制作用,此结果印证了以上理论,姜黄素可以抑制氧交换密切组织中NO的含量,保护组织不受过氧化亚硝酸盐的损伤。姜黄素对黄颡鱼体内NO含量的影响与姜黄素添加水平、鱼体组织中NO分布等因素有关,其调控机理仍需深入探讨。
4 结论综上所述,饲料中姜黄素添加水平为200– 400 mg/kg时,可显著提高黄颡鱼机体的生长性能、消化能力和抗氧化能力。本研究为姜黄素作为功能性饲料添加剂的开发和利用提供了理论依据。
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