凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)又称南美白对虾，是世界上产量最高的对虾种类之一，在我国年产量高达158万t (农业部渔业渔政管理局, 2015)，占世界对虾总产量的45%(FAO, 2015)。因其具有广盐性、生长快、高抗病性、适合高密度养殖等特点，成为了半集约化和集约化养殖的最佳选择，是世界上最受欢迎的养殖品种之一(Lu et al, 2015)。然而，目前凡纳滨对虾养殖中普遍采用的集约化或半集约化养殖模式常常会导致水质恶化，来自恶化水质中的毒理因子的胁迫应激作用致使在对虾养殖中出现高死亡率现象，严重影响了对虾的产量和质量(Alagappan et al, 2010)。在众多毒理因子中，氨氮超标是最普遍的现象之一，其在多种对虾中被检测到具有致死作用，包括凡纳滨对虾、中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)、斑节对虾(Penaeus monodon)、长毛对虾(Penaeus penicillatus)和刀额新对虾(Metapenaeus ensis)等(Cobo et al, 2014; Chen et al, 1990; Chen et al, 1992; Chen et al, 1991; 冉繁华等, 1991; Wajsbrot et al, 1990; Ostrensky et al, 1995)。除了对对虾有直接的致死作用外，氨氮胁迫还会抑制对虾的免疫系统并增加其对病原的敏感性(Liu et al, 2004)，而且在贝类和鱼类中也发现了相同现象(Cheng et al, 2004; Hurvitz et al, 1997)。然而，随着人类活动范围和影响深度的逐渐扩大，加上多变的气候和全球变暖的趋势，使得水产养殖环境不断恶化。因此，探索培育对环境胁迫应激具有较高耐受性的优良对虾品种，将可能成为降低死亡率和病原感染率的有效办法。我们已经对核心育种群体的氨氮急性胁迫应激的耐受性进行了遗传评估，其较高的遗传力(0.575)表明，凡纳滨对虾的抗逆性可通过选育得到快速的改良(Lu et al, 2017a)。

环境毒理因子会对对虾养殖业造成一定的影响，病害问题更是制约其可持续发展的一个重要因素，如白斑综合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)。WSSV是造成养殖对虾死亡的重要病毒(朱卫卫等, 2015)，给全球对虾养殖业带来了巨大的经济损失(Verbruggen et al, 2016)。为了控制疾病的发生，减少经济损失，诸多学者探究WSSV的防治措施(曹家旺等, 2017)。然而，迄今尚未找到可有效控制WSSV的方法。本团队通过遗传选育的方式对中国对虾开展了十几代的抗WSSV选育，极大地提高了感染WSSV对虾的存活时间，但对虾抗病性状遗传力较低，选育进展缓慢(Gitterle et al, 2007; Lu et al, 2017b)。另外，由于病原感染测试的传播性、测试场地紧缺，受试个体感染实验耗时耗力且很难达到同时感染的大规模测试要求，使得选择强度不够高，进一步延缓了选育进程。若通过提高对虾对逆境胁迫的耐受性能来间接提高其抗病力，将会加快对虾抗病力选育的进程、克服抗病测试受场地限制的问题、降低对人力和物力的需求。目前，对虾对逆境胁迫应激的耐受力与对病原的抵抗力之间的关系尚不清楚。因此，本研究利用氨氮急性胁迫应激测试获得耐受群体和敏感群体，开展凡纳滨对虾对氨氮急性胁迫应激的耐受性与WSSV抗性之间的关系，探索对虾对逆境急性胁迫应激的耐受力与对病原抵抗力的关系，研究结果将对培育抗逆抗病优良新品种具有指导作用。

实验所用材料来源于在2011年启动的凡纳滨对虾育种项目核心群体的第5代，参与测试的共94个家系，这些家系构建于2016年6月。为了测试此核心群体对急性毒理胁迫带来的应激抗逆能力，利用94个全同胞家系对其进行高浓度氨氮胁迫测试，对虾平均体重为0.5 g，平均体长为3.77 cm。测试实验于河北省黄骅市鑫海水产生物技术有限公司进行，由于实验时对虾太小无法进行物理标记，因此，从每个家系中随机选取40尾对虾，置于容量为100 L的独立白色桶中。测试条件为氨氮浓度34 mg/L，实验期间pH为8.05，温度为(27.0±0.5)℃，盐度为30，24 h充气。实验期间，每隔1 h收集1次死虾，判定对虾死亡的标准为失去平衡、侧躺于桶底、对外界刺激无反应。在整个实验期间，每小时的初期利用捞网捞取死亡对虾，并且记录每个个体的家系编号、体长和死亡时间。每日投喂2次(06:00、22:00)配合饲料(日投饵量占对虾总体重的3%)，吸污1次。为了保持家系间的测试环境一致，整个实验期间各个桶之间的环境维持一致。在实验开始后的第72小时，胁迫测试实验结束。

氨氮急性胁迫应激测试实验结束后，根据每个家系的平均存活时间对其进行排序。在家系间体长无显著差异的前提下，从中分别挑选5个存活时间较长和5个存活时间较短的家系组成耐受群体(TP)和敏感群体(SP)，用于WSSV感染测试。

取甲壳有明显白斑、濒死的对虾，实时荧光定量PCR检测肌肉中WSSV拷贝数，制成病毒载量为10⁷copies/mg的毒饵。在充分预冷的组织匀浆机中搅匀，加入可食用红色素，制成混合均匀、颜色醒目的毒饵，毒饵制备过程在低温环境中快速进行，并置于–80℃冰箱保存备用。

当TP群体和SP群体每个家系的对虾个体的平均体重达到3 g左右时，进行VIE荧光标记，以便于混养测试。标记完成、暂养恢复后，运回中国水产科学研究院黄海水产研究所，暂养4 d，每日投喂2次(06:00、22:00)配合饲料(日投饵量占对虾总体重的3%)，期间利用吸污器将养殖整理箱中的水排出，添加应激灵后补充干净海水。暂养后，从每个家系中选取大小相近的50尾虾，用于WSSV感染测试。每个群体设置3个处理水平：①高浓度氨氮水平(10 mg/L)下WSSV感染组，TP群体和SP群体的命名分别为TPAV和SPAV；②正常海水条件下(氨氮水平小于0.01 mg/L)WSSV感染组，TP群体和SP群体的命名分别为TPV和SPV；③正常海水无WSSV感染的空白对照组，TP群体和SP群体的命名分别为TPC和SPC。

每个家系平均分在6个200 L的塑料整理箱，即每个处理有2个平行。饲喂毒饵前，对虾饥饿处理24 h，保证其胃肠排空。用WSSV毒饵进行单尾人工口饲感染，将制备的毒饵置于冰上，用镊子夹取等量的毒饵(约10 mg)轻轻送至对虾口器处，待抱食后的对虾胃部出现明显的红色，将其放到装有海水的整理箱。1 h内完成所有个体的毒饵饲喂工作。根据预实验结果，选取1周内不会导致对虾显著死亡的氨氮浓度(10 mg/L)，在TPAV和SPAV组的整理箱内同时加入NH₄Cl，使总氨氮浓度为10 mg/L。实验期间，pH为7.8，温度为27℃，盐度为30，24 h充气，进行正常的日常管理，正常投饵、换水，观察对虾死亡情况。利用同样的方式每隔1 h收集1次死虾，记录每个个体的颜色号(用于区别家系)、体重和死亡时间。为了保持家系间的测试环境一致，整个实验期间各个桶之间的环境尽量维持一致。

以存活时间和家系半致死存活率为指标，评价家系对氨氮胁迫的耐受能力。个体存活时间是从胁迫开始到死亡的时间(h)，家系存活时间是家系内所有个体的平均存活时间(h)，家系半致死存活率是全部测试个体死亡50%时各个家系的存活率(SS₅₀)。以存活率作为2个群体的WSSV抵抗力高低的指标。采用SAS软件对数据进行相关描述性统计分析，利用R绘制箱线图，利用SPSS19.0软件对数据进行其他统计分析。

本研究中共有3688个个体参与高浓度氨氮急性胁迫实验，氨氮胁迫后的个体水平和家系水平的存活时间以及家系半致死存活率见表 1。结果显示，在个体水平上，个体间的存活时间表现出较大的差异，最短存活时间为2.00 h，最大存活时间为78.00 h，平均存活时间为36.61 h；在家系水平上，家系间的平均存活时间同样表现出较大的差异，存活时间最短的为15.63 h，最长的为64.56 h；无论在个体水平还是在家系水平，存活时间的标准差和变异系数均较大，且个体水平的变异系数(46.90%)比家系水平(28.50%)高出近一倍。家系间半致死存活率同样表现出较大的差异，最小存活率是0，最大是94.87%，且变异系数较高(54.71%)。由图 1可见，无论是家系存活率SS₅₀ (图 1a)还是家系平均存活时间(图 1b)，家系间的差异都比较大，表明家系间在氨氮急性胁迫耐受力方面具有较大的选育潜力，获得的氨氮耐受性差异较大的2个群体为WSSV感染测试提供了较为理想的材料。

图 1(Fig. 1)

图 1 家系半致死存活率SS50(a)及平均存活时间(b) Figure 1 The survival rate at half lethal time (SS50) (a) and the average survival time of the families (b) 25%、50%、75%的家系分别组成了箱子的下、中、上线；最小值、最大值和观测值分别为-、-和○ The 25th (up line), median (inside line) and 75th (bottom line) percentiles of the families were plotted as boxes. The minimum, maximum, and the observed values were shown as -, -, and ○, respectively

表 1(Tab. 1)

表 1 氨氮急性胁迫后存活时间和家系半致死存活率 Table 1 The survival time and survival rate at half lethal time (SS50) after acute ammonia stress 指标Indices 均值 Mean 最小值 Minimum 最大值 Maximum 标准差 Standard deviation 变异系数(%) Coefficient variation 存活时间 Survival time (h) 个体水平Individuals (3688尾) 36.61 2.00 78.00 17.17 46.90 家系水平Families (94) 36.61 15.63 64.56 10.44 28.50 半致死存活率 SS50 (%) 家系水平Families (94) 50.63 0 94.87 27.70 54.71

表 1 氨氮急性胁迫后存活时间和家系半致死存活率 Table 1 The survival time and survival rate at half lethal time (SS50) after acute ammonia stress

根据平均存活时间对所有家系进行排序，结合半致死存活率，从性能表现的两个极端分别选取5个家系组成敏感群体和耐受群体(表 2)。结果显示，敏感家系的存活时间范围是20.13~27.33 h，显著低于耐受家系的51.21~64.56 h；敏感家系的半致死存活率范围是2.38%~17.78%，显著低于耐受家系的86.36%~94.87%。由这10个家系组成的敏感群体和耐受群体用于后续的WSSV感染测试。

表 2(Tab. 2)

表 2 氨氮敏感群体和耐受群体的存活时间和半致死存活率 Table 2 The survival time and survival rate at half lethal time of the ammonia sensitive and tolerant families 家系类型Family types 平均存活时间Average survival time (h) 半致死存活率SS50 (%) 敏感家系 Sensitive family 20.13 5.26 23.02 2.38 23.36 7.69 25.24 4.76 27.33 17.78 耐受家系 Tolerant family 51.21 89.74 55.13 87.50 57.66 86.36 57.79 86.84 64.56 94.87

表 2 氨氮敏感群体和耐受群体的存活时间和半致死存活率 Table 2 The survival time and survival rate at half lethal time of the ammonia sensitive and tolerant families

氨氮耐受群体(TP)和敏感群体(SP)在3个处理水平下的存活水平见表 3，实验结束时每个处理最终的存活率见图 2。结果显示，SP群体在WSSV感染后的5 h开始出现死亡，而TP群体在WSSV感染后出现死亡的时间较晚，约为感染后的16 h。实验结束时，SPAV的存活率显著低于SPV和SPC，同样地，TPAV的存活率显著低于TPV和TPC。SPAV在137 h时全部死亡，而此时TPAV的平均存活率为57.33%，而且在144 h实验结束时的存活率仍然高达53.85%，显著高于SPAV，但显著低于TPC(P < 0.05)。在正常海水条件下WSSV感染后，SPV在实验结束时的平均存活率为26.32%，显著低于SPC(P < 0.05)；此时TPV的存活率为81.01%，显著高于SPV(P < 0.05)，而且与TPC之间无显著差异。表明氨氮急性胁迫应激会增加对虾对病毒的敏感性，而且对氨氮急性胁迫应激耐受力高的群体对WSSV的抵抗力也高。

表 3(Tab. 3)

表 3 WSSV感染后氨氮敏感群体和耐受群体的存活水平 Table 3 The survival level of the ammonia sensitive and tolerant families post WSSV challenge 组别 Groups 起始数 Starting number (ind.) 存活数(存活率) Survival number (Survival rate) (%) 最小存活时间 Minimum survival time (h) 最大存活时间 Maximum survival time (h) SPAV 77 0 (0)a 5 137 SPV 76 20 (26.32)b 5 Alive TPAV 78 42 (53.85)c 18 Alive TPV 79 64 (81.01)d 16 Alive SPC 71 46 (65.22)cd 14 Alive TPC 72 53 (73.61)d 16 Alive 注：不同字母表示组间差异显著(P < 0.05) Note: Different letters showed significant differences between groups (P < 0.05)

表 3 WSSV感染后氨氮敏感群体和耐受群体的存活水平 Table 3 The survival level of the ammonia sensitive and tolerant families post WSSV challenge

图 1(Fig. 1)

图 2 氨氮耐受和敏感群体感染WSSV 144 h的存活率s Figure 2 The survival rate of the ammonia tolerant and ammonia sensitive populations at 144 h post WSSV challenge 不同字母表示组间差异显著(P < 0.05) Different letters showed significant differences between groups (P < 0.05)

SP群体和TP群体的3个处理在实验期间不同时间的累积死亡率见图 3。实验开始40 h内，各个组间的累积死亡率无显著差异；随着实验进行，在60 h后SPAV组的死亡率呈直线上升趋势，到137 h时该组个体全部死亡，其累积死亡率显著高于SPV(70.42%)、TPAV(42.67%)、TPV(18.99%)和SPC (34.78%)(P < 0.05)。在整个实验期间，TPAV、TPV、TPC和SPC的死亡率比较平缓，SPV在40~100 h期间死亡率急剧上升，在100 h后开始趋于平缓；在144 h实验结束时，SPV的累积死亡率为73.67%，显著低于SPAV组，但显著高于TPAV(46.15%)、TPV(18.99%)和SPC(34.79%) (P < 0.05)；此时，TPAV组的累积死亡率显著高于TPV和TPC组(P < 0.05)，而TPV与TPC组间无显著差异(P > 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 3 各组别感染后对虾累积死亡率 Figure 3 Cumulative mortality of infected shrimp of the groups from the two populations

本研究中，无论氨氮急性胁迫应激耐受群体还是敏感群体，在氨氮急性胁迫应激条件下WSSV感染组的死亡率显著高于正常海水条件下WSSV感染组(图 2, 图 3)，表明养殖水环境中的氨氮胁迫会增加对虾对病原的敏感性，进而带来较高死亡率，与前期的研究报道一致。Liu等(2004)利用0、1、5、10、20 mg/L浓度的氨氮胁迫凡纳滨对虾120 h内，不同浓度氨氮处理间的累积死亡率无显著差异，而且0~20 mg/L浓度的氨氮不会影响溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的生长。在0.01 (对照)、1.10、5.24、11.10、21.60 mg/L浓度氨氮的条件下进行弧菌感染测试时，当感染48~168 h后，氨氮胁迫组的死亡率显著高于对照组，而且死亡率随着氨氮浓度升高和胁迫时间的延长逐渐升高，表明氨氮胁迫会抑制对虾的免疫防御功能，增加宿主对病原的敏感性。Cheng等(2004)在0.01 (对照)、1.12、3.22、5.25、10.18 mg/L浓度氨氮的条件下对鲍鱼(Haliotis diversicolor supertexta)进行副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)感染后，鲍鱼的累积死亡率随着氨氮浓度的升高显著增加，当弧菌感染12 h后，氨氮浓度为3.22 mg/L处理组的死亡率显著高于1.12 mg/L处理组及对照组，表明氨氮胁迫会增加鲍鱼对病原的敏感性，死亡率增加。另外，Lu等(2016)利用来自同一家系的个体进行比较转录组分析，揭示氨氮急性胁迫应激对凡纳滨对虾毒理作用的分子机制，结果显示，应答氨氮胁迫的6条KEGG通路中有5条与免疫防疫功能有关，而且被显著富集到GO类别和KEGG通路的绝大多数基因(75%)与免疫功能相关，这些被影响的基因的表达变化基本会降低对虾的免疫防御功能，这从分子水平证明了氨氮胁迫会抑制对虾的免疫防御功能。

既然氨氮胁迫会抑制对虾的免疫防御功能、增加其对病原的敏感性，而且已明确凡纳滨对虾的氨氮耐受性具有较高的遗传力(0.575)，那么能否通过提高凡纳滨对虾的氨氮急性胁迫应激的耐受性而间接地提高其抗病力呢？本研究的结果给予了肯定的答案。由于所在课题组的技术和材料的优势，本研究对遗传多样性丰富的凡纳滨对虾核心群体的氨氮急性胁迫的耐受性进行了遗传评估，结果显示，家系间对氨氮急性胁迫应激的耐受性存在较大的差异(表 1、图 1)，基于评估结果获得了氨氮急性胁迫耐受群体和敏感群体，为本研究的WSSV敏感性差异分析提供了重要的材料。通过对2个群体进行WSSV感染测试发现，氨氮急性胁迫耐受性高的群体同样对WSSV的抵抗力也高。本研究将有助于解决由于抗病测试场地匮乏、耗时耗力而抗病选育进展缓慢的问题。本研究由于场地和样本量的限制，仅设置2个平行；由于密度相对较高，1天1次的换水也无法保证正常海水条件处理的氨氮水平一直维持在安全范围；另外，由于残食现象，导致部分个体的缺失。以上几个原因会导致本研究的结果在一定程度上偏离真实值，但仍然具有一定的参考价值。在未来的研究中，将继续利用已有的耐受群体和敏感群体，增加平行设置并扩大水体，进行进一步的验证工作，并逐步增加对其他病原开展感染测试来证实其普遍性。