微卫星DNA(Simple sequence repeat, SSR)，是由基本单元为1~6个核苷酸所构成的简单重复序列，是目前应用较为广泛的分子标记之一(OxConnell et al, 1997)，其稳定性和可重复性高，特异性和共显性强，现已应用于生物遗传多样性分析、全基因组相关分析、分子标记辅助育种等诸多方面(刘志毅等, 2001; Alam et al, 2005; Cavagnaro et al, 2010; Zhu et al, 2012; 王日芳等, 2017)。海洋生物的微卫星筛选及多态性分析、利用微卫星构建连锁图谱和抗病相关标记的连锁分析等工作已陆续开展(赵莹莹等, 2006a、b; 李春艳等, 2009; Hou et al, 2011)。

虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)自20世纪80年代引入中国，经过几十年的培育与发展，现已成为我国重要的海洋养殖物种。目前，已有采用分子标记开展虾夷扇贝种群遗传研究的报道，如同工酶电泳技术(高悦勉等, 2003、2004)、AFLP(鲍相渤等, 2009; 丁君等, 2010)、SSR(Sato et al, 2005; 赵莹莹等, 2006b; 常亚青等, 2007; 李春艳等, 2009; Hou et al, 2011)，而对虾夷扇贝基因组水平上的微卫星及其分布特征还知之甚少。本研究采用第二代高通量测序技术对虾夷扇贝进行简化基因组测序(Restriction-site associated DNA sequencing, RAD-seq)，通过对基因组中不同类型微卫星的统计与分析，了解其微卫星分布频率和数量，从基因组水平阐明虾夷扇贝基因组SSR特征及组成，对进一步利用微卫星开展遗传标记辅助育种和种群遗传学研究具有重要的参考价值。

虾夷扇贝于2015年7月采自我国北黄海獐子岛虾夷扇贝底播养殖海域，冰冻保存运送至实验室，解剖处理，取虾夷扇贝闭壳肌组织，存于–20℃备用。

采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型) (天根，北京)进行基因组DNA的提取，琼脂糖凝胶电泳初步检测提取的DNA质量，采用核酸蛋白分析仪检测DNA浓度与纯度，选取质量较好的DNA样品保存于–20℃备用。

将所获取的虾夷扇贝DNA样品送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行测序。DNA样品通过随机酶切打断，经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个RAD文库的制备，构建好的文库通过Illumina(测序仪)进行双末端测序，测序个数乘以测序序列长度即为原始数据值。对原始数据进行过滤：去除带接头(Adapter)的reads pair；去除单端测序read中含有的N(未读碱基)含量超过该条read长度比例的10%的reads pair；去除单端测序read中含有的低质量(Q≤5)碱基数超过该条read长度比例的50%的reads pair。对所得数据样本含有的酶识别位点reads用cd-hit-est软件(Li et al, 2006)进行聚类，并保证每类中reads支持数在10~400之间。根据聚类结果，用Velvetopt软件(Zerbino et al, 2008)进行组装，得到最后的组装序列，并对125 bp以下的contig进行过滤。

使用SR search软件(Rozen et al, 2000)对过滤所得的contig进行简单重复序列的检测，检测标准如下：(1) SSR重复的最小长度为2；(2) SSR重复的最大长度为6；(3) SSR序列的最小长度为12；(4) SSR上下游序列长度为100 bp；(5) 2个SSR的最小距离为12 bp。使用Primer 3软件(Rozen et al, 2000)对鉴定出的含有SSR重复基元的序列片段进行引物设计：引物的长度范围为20~28，最适长度为24；引物退火温度范围为60~65℃，最适退火温度为63℃，且一对引物退火温度差值不超过1℃。

SSR分布密度(D)计算公式为：

式中，D为不同重复微卫星分布密度(ind./Mb)；L为虾夷扇贝基因组重叠群(contig)总长(Mb)；N为各重复类型微卫星数量(ind.)。

SSR不同长度的分布频率(F)计算公式为：

式中，F为不同长度微卫星的分布频率；N为各长度微卫星数量(ind.)；T为微卫星总数量(ind.)。

测序结果共产生原始数据2.872 G，经过滤后共获得有效数据2.847 G (表 1)。Illumina HiSeq产生的序列的碱基质量用Qphred表示，Phred值为20和30，碱基正确识别率分别为99%和99.9%。本测序中Phred数值大于20和30的碱基占所有碱基的百分比分别为96.77%和92.66%，RAD-Tag捕获率为93.07%，数据量符合预先设定，表明建库成功，测序质量合格。

表 1(Tab. 1)

表 1 虾夷扇贝简化基因组测序主要数据 Table 1 Mean data of reduced-representation genome sequencing in P. yessoensis 类目Category 数值Value 原始数据量Raw base (bp) 2, 871, 603, 900 有效数据量Clean base (bp) 2, 847, 335, 100 组装总长度Total contig base (bp) 92, 551, 435 组装总个数Total contig number 259, 535 组装平均长度Average contig length (bp) 356

表 1 虾夷扇贝简化基因组测序主要数据 Table 1 Mean data of reduced-representation genome sequencing in P. yessoensis

通过聚类组装获得序列总长度为92, 551, 435 bp，过滤掉小于125 bp的contig后获得259, 535个contig，其中，N₅₀ (将序列从大到小排列，当长度达到组装总长度一半时，contig的长度)的长度为419 bp，组装基因组的平均覆盖深度为14.55×，其中，4×覆盖度在86.64%以上，GC含量为35.63%，拼接结果正常，拼接序列质量较高。

通过对虾夷扇贝基因组的序列进行微卫星查找，在虾夷扇贝的高通量测序数据库中进一步搜索含有2~6重复单元的SSR，从总长为92, 551, 435 bp的259, 535个contig中筛选出3618个潜在微卫星位点，经引物设计共获得3460个微卫星引物，利用微卫星密度计算公式可得，平均26, 748.97 bp出现1个SSR (表 2)。由表 2可以看出，虾夷扇贝微卫星各重复类型之间SSR数量均相差较大，各类型SSR分布密度差异明显。所获得的3460条微卫星序列中，分布最多的重复类型为三核苷酸重复(45.87%)；其次是二核苷酸重复(37.05%)、四核苷酸重复(14.48%)、五核苷酸重复(2.02%)；分布最少的是六核苷酸重复(0.58%)。

表 2(Tab. 2)

表 2 虾夷扇贝不同重复类型微卫星所占比例及分布密度 Table 2 The proportion and density of different repeat types in SSR database of P. yessoensis 重复类型 Repeat type 数量 Number 百分比 Percentage(%) 密度 Density (Mb) 二核苷酸Dinucleotide 1282 37.05 13.93 三核苷酸Trinucleotide 1587 45.87 17.25 四核苷酸Tetranucleotide 501 14.48 5.45 五核苷酸Pentanucleotide 70 2.02 0.76 六核苷酸Hexanucleotide 20 0.58 0.22 总数Total 3460 100 37.61

表 2 虾夷扇贝不同重复类型微卫星所占比例及分布密度 Table 2 The proportion and density of different repeat types in SSR database of P. yessoensis

统计微卫星各重复类型中不同重复单元的数量显示，二核苷酸重复有12种重复单元，三核苷酸重复59种，四核苷酸重复100种，五核苷酸重复47种，六核苷酸重复20种。统计微卫星各重复类型中不同重复单元的百分比(表 3)，在二核苷酸重复微卫星中，AT/TA重复单元所占比例最高(79.17%)，共计1015个；其次是TG/GT重复单元103个(8.03%)。在三核苷酸重复的微卫星中，ATA重复单元所占比例最高(11.41%)，共计181个；AAT、TAT、ATT、TAA这4种重复单元紧随其后，分别有155个(9.77%)、150个(9.45%)、137个(8.36%)和120个(7.56%)。四核苷酸重复中每种重复单元所占比例相对均匀，其中，数量最多的为CAAA重复单元，共计48个，所占比例为9.58%。五核苷酸重复中，数量最多的重复单元为AAACC，共计11个，占比15.71%。六核苷酸重复共计20个，每一种重复单元仅有1个。

表 3(Tab. 3)

表 3 虾夷扇贝SSR重复单元的数量及百分比 Table 3 The numbers and percentage of SSR repeat motifs in P. yessoensis 重复类型 Repeat type 重复单元 Motif 数量 Number 重复单元百分比 Percentage of each repeat motif (%) 二核苷酸 Dinucleotide AT/TA 1, 015 79.17 TG/GT 103 8.03 AC/CA 99 7.72 CT/TC 31 2.42 AG/GA 28 2.18 CG/GC 6 0.47 三核苷酸 Trinucleotide ATA 181 11.41 AAT 155 9.77 TAT 150 9.45 ATT 137 8.63 TAA 120 7.56 TTA 71 4.47 TTC 62 3.91 Others 711 44.80 四核苷酸 Tetranucleotide CAAA 48 9.58 AAAT 29 5.79 GACG 26 5.19 ATAA 24 4.79 AAAC 18 3.59 ATCA 18 3.59 Others 338 67.47 五核苷酸 Pentanucleotide AAACC 11 15.71 Others 59 84.29

表 3 虾夷扇贝SSR重复单元的数量及百分比 Table 3 The numbers and percentage of SSR repeat motifs in P. yessoensis

虾夷扇贝基因组微卫星长度范围为12~36 bp，平均长度为14.96 bp。微卫星长度分布频率计算结果显示，微卫星长度越长其分布频率越低，其中，12~16 bp的微卫星占绝对优势，比例高达79.35% (图 1)。

图 1(Fig. 1)

图 1 虾夷扇贝微卫星长度分布及不同长度微卫星频率 Figure 1 The length distribution and frequency of P. yessoensis SSR

针对虾夷扇贝基因组微卫星数量进行分析发现，当同一重复类型的微卫星随着重复数增加其数量相对减少(表 4纵向)，而相同重复数的微卫星随着重复单元长度的增加其数量也呈下降趋势(表 4横向)，且随着不同重复单元长度的增加其重复数范围逐渐减小(表 4)。如，二核苷酸重复单元按照重复数多少可分成11种，其中，重复数为6的二核苷酸重复单元数量有695，随着重复数增加其数量逐渐减少，当重复数增加至16时该重复单元的数量降至7；当重复单元长度增加至六核苷酸时，该重复类型数量仅有20种。可见，随着重复单元长度的增加，微卫星数量和重复数范围均呈下降趋势，推测虾夷扇贝基因组中长度较短的微卫星变异速率比长度较长的微卫星变异速率快。

表 4(Tab. 4)

表 4 虾夷扇贝SSR不同重复数及不同重复类型的数量 Table 4 The number of SSR with different repeat types and different copy number in P. yessoensis 重复数Copy number 二核苷酸Di- nucleotide 三核苷酸Tri- nucleotide 四核苷酸Tetra- nucleotide 五核苷酸Penta- nucleotide 六核苷酸Hexa- nucleotide 4 1006 318 53 19 5 315 117 14 1 6 695 123 44 1 7 308 64 12 2 8 103 43 9 9 53 13 1 10 40 17 11 27 6 12 14 13 14 14 13 15 8 16 7

表 4 虾夷扇贝SSR不同重复数及不同重复类型的数量 Table 4 The number of SSR with different repeat types and different copy number in P. yessoensis

本研究基于虾夷扇贝基因组获得有效SSR数目为3460个，其中出现频率最高的为三核苷酸重复(45.87%)，主要以ATA(11.41%)和AAT(9.77%)重复单元为主，然后依次是TAT、ATT、TAA重复单元；而二核苷酸重复中，则是以AT最多，其次为TA。Hou等(2011)采用454测序技术对虾夷扇贝转录组进行测序，在其转录组中搜索到的2748个SSR中，三核苷酸重复的频率最高(39.4%)，其次是二核苷酸重复(21.1%)、四核苷酸重复(15.5%)、五核苷酸重复(14.6%)和六核苷酸重复(9.4%)。可见，无论是在转录组还是基因组水平上，虾夷扇贝微卫星三核苷酸重复类型的出现频率均最高。

通过二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸3种重复类型中各重复单元对比研究，在各种长度的重复中，A/T都较G/C含量高很多，这与多数生物基因组微卫星具有的特点相一致，如中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)微卫星(高焕等, 2004)，红鳍东方鲀(Sargassum fusiforme)微卫星(崔建洲等, 2006)，三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)微卫星(宋来鹏等, 2008)。生物基因组微卫星富含A/T的可能原因是微卫星序列A/T含量高，则T_m值降低，DNA链容易解开，通过DNA复制滑动机制和重组机制，产生富含AT重复类型的机率更高。此外，Schlotterer等(1992)认为，基因组DNA因CpG甲基化的胞嘧啶C很容易经过脱氨基作用转变成胸腺嘧啶T，使其具有较高的突变可能性，并且少量的GC又是维持DNA热力学稳定性所必需的，一定程度上可解释生物体基因组微卫星中G/C含量如此之少的原因(黄杰等, 2015)。还有一种可能是，统计结果中GC重复过少也可能与GC重复的测序工作比较困难有关(高焕等, 2004)。具体原因，现今仍无定论，尚有待进一步的研究探讨。

对虾夷扇贝基因组不同重复类型微卫星的长度变异情况进行分析，发现这些微卫星的数量与重复长度成反比，微卫星的数量随着重复长度的增加而降低。Samadi等(1998)的模拟分析研究认为，重复长度越长，经受的选择压力越大，则它们的重复数就越少，数量越低。此外，在中国对虾(高焕等, 2004)、红鳍东方鲀(崔建洲等, 2006)、枸杞(Lycium barbarum) (党少飞等, 2016)等不同种类的动植物基因组微卫星的研究中也得到了相同的结论。这意味着虾夷扇贝基因组中重复长度较短的微卫星比重复长度较长的微卫星变异速率快，为虾夷扇贝进一步的多态性微卫星标记筛选工作提供选择方向和依据。

目前，比较成熟的微卫星开发与筛选技术有磁珠富集法、构建cDNA文库筛选EST-SSR法以及基于二代测序的转录组测序和简化基因组测序法。不同方法获得微卫星标记数量不同，所体现出的分布特征也不尽相同。传统的磁珠富集法筛选微卫星标记，获得率较低，每次仅能获得百余个微卫星标记，因其筛选探针多用二核苷酸重复的微卫星序列，在富集过程中，磁珠经过多个洗涤过程将一些因重复数目较少而附着不牢固的微卫星序列洗去，仅能获得较长序列的微卫星标记，因此，不能完全反映其微卫星的分布情况(赵莹莹等, 2006a; 李春艳等, 2009)。李云峰等(2010)通过构建虾夷扇贝cDNA文库获得74个EST-SSR，由于EST序列仅能反映转录加工后的mRNA信息，除去了许多内含子和其他序列，因此，并不能反映基因组DNA的真实信息。随着测序技术的发展，获取效率高、技术难度低且花费成本与传统方法相近的二代测序被广泛应用到微卫星引物开发中，基于转录组或基因组进行全部或部分高通量测序的方法可以获得大量的核酸序列信息，微卫星标记的开发也就水到渠成，而且二代测序一次性开发标记数据量大，可以比较完整地反应物种的微卫星分布特征。

由虾夷扇贝基因组微卫星特征分析得知，其三碱基重复类型微卫星数量最多，在已开展基因组微卫星开发的贝类中(表 5)，栉孔扇贝(Chlamys farreri) (Zhang et al, 2008)和三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)(Bai et al, 2009)微卫星数量最多的同样为三碱基重复类型，而在马氏珠母贝(Pinctada martensii)(王忠良等, 2015)、里氏拟石磺(Paraoncidium reevesii)(吴欣等, 2015)、菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)(闫路路等, 2015)和文蛤(Meretrix meretrix)(Wang et al, 2011)中，却呈现出单核苷酸重复数量最多，二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸重复数量依次递减的趋势。而长牡蛎(Crassostrea gigas)(张琳琳等, 2011)的EST-SSR则呈现六核苷酸重复数目最多(851)，单核苷酸次之(805)，二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸重复依次递减的趋势。由此可见，在已有贝类微卫星研究中，各重复类型的微卫星分布并未呈现较明显的规律，产生这样的结果，一方面可能是微卫星开发手段不同而导致结果不同，另一方面，也可能是不同物种其微卫星组成存在较大差异，这些都有待进一步研究。

表 5(Tab. 5)

表 5 不同贝类SSR分布特征 Table 5 The characteristics of SSR distribution in different molluscs 物种 Species SSR类型 SSR type 平台/方法 Method/Sequencing platform 个数 Numbers 主要特征 Main features 参考文献 References 马氏珠母贝 P.martensii EST-SSR Illumin/ Hiseq-2000平台 9872 单核苷酸重复最多(8042)，二核苷酸重复(1035)、三核苷酸重复(630)、四核苷酸重复(158)依次递减 王忠良等, 2015 文蛤 M.meritrix EST-SSR 454平台 2970 未考虑单核苷酸重复，二核苷酸重复最多(1194)，三核苷酸重复(1123)、四核苷酸重复(357)次之 Wang等, 2011 三角帆蚌 H.cumingii EST-SSR 构建cDNA文库，3730测序 201 未考虑单核苷酸重复，三核苷酸重复最多(110)，二核苷酸重复次之(83) Bai等, 2009 长牡蛎 C.gigas EST-SSR NCBI下载EST序列标签 2602 六核苷酸重复最多(851)，单核苷酸重复次之(307)，二核苷酸重复(258)和三核苷酸重复(240)个数相差不大 张琳琳等, 2011 里氏拟石磺 P.reevesii 基因组SSR Illumin/ Hiseq-2000平台 67696 单核苷酸重复最多(53948)，二核苷酸重复(7577)、三核苷酸重复(4579)、四核苷酸重复(1572)依次递减 吴欣等, 2015 菲律宾蛤仔 R.philippinarum 基因组SSR 454平台 1601 三核苷酸重复最多(903)，其次为二核苷酸重复(492)和四核苷酸重复(160)，单核苷酸重复较少(22) 闫路路等, 2015

表 5 不同贝类SSR分布特征 Table 5 The characteristics of SSR distribution in different molluscs