2. 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071;
3. 青岛海洋科学与技术国家实验室 海洋生态与环境科学功能实验室 青岛 266071
2. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071;
3. Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071
C型凝集素(C-type lectin)是最早发现的动物凝集素，种类繁多，几乎存在于所有的多细胞生物中(Robinson et al, 2006)。作为固有免疫中一类重要的模式识别受体(PRR)，能够专一性地识别病原相关分子模式(PAMP)，与糖类可逆结合，在病原菌入侵过程中参与“非己”识别，并能激活一系列免疫防御反应，从而吸附和凝集异物，促进机体清除和杀灭异物(Tamplin et al, 1989; 张峘, 2010)。C型凝集素具有钙离子依赖性，它们均含有约130个氨基酸残基构成的糖识别结构域(Carbohydrate-recognition domain，CRD) (Drickamer et al, 1993)。每个CRD在空间上形成双环状结构，4个高度保守的Cys形成的2对二硫键保持了该结构的稳定性，含有4个Ca2+结合位点，其中Ca2+结合位点2与糖基特异性结合有关(Zelensky et al, 2005)。大多数C型凝集素可以与D型甘露糖(D-mannose)、D型葡萄糖(D-glucose)这一类的Man型配体(Man-type ligands)或D型半乳糖(D-galactose)及其衍生物(Gal型配体，Gal-type ligands)结合(Kolatkar et al, 1996)，在免疫识别方面发挥重要作用。
C型凝集素作为凝集素家族中研究最多的一类，越来越受到广泛的关注。近几年，软体动物C型凝集素的研究越来越普遍，对于其在免疫方面的功能研究越来越深入。目前，已在皱纹盘鲍(Haliotis discus discus) (王圣, 2015)、合浦珠母贝(Pinctada fucata)(胡钰婷等, 2011)、海湾扇贝(Argopecten irradians)(Zhu et al, 2008)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)(Wang et al, 2007)等软体动物中发现并克隆获得C型凝集素的全长序列。
魁蚶(Scapharca broughtonii)是一种大型海洋底栖经济贝类，具有较好的市场前景和开发利用价值，在太平洋西北部浅海区域广泛分布(唐启升等, 1994)。作为亚洲一种重要的经济贝类(Mao et al, 2013)，近几年由于过度捕捞、环境污染、海洋生态系统恶化、不健康养殖导致病害发生，致使魁蚶资源减退(刘寒苗等, 2017)。魁蚶作为一种软体动物，固有免疫是其抵御外界病原侵害的主要方式。迄今为止，国内外对于魁蚶自身免疫系统组成、特点和功能的研究逐渐深入，有关魁蚶免疫相关基因的报道越来越多，如杀菌渗透性增强蛋白(BPI)和脂多糖结合蛋白(LBP)(Mao et al, 2013)、过氧化氢基因(CAT)(黄永欢等, 2016)、半乳糖凝集素(SbGal)(郑利兵等, 2015)、大防御素(SbBDef1)(Li et al, 2012)、锰超氧化物歧化酶(SbMnSOD)(Zheng et al, 2015)、铁蛋白(SbFer)(Zheng et al, 2016)等基因，另外，血细胞作为魁蚶的重要免疫部位，对其分类和免疫作用也有研究(周丽青等, 2013)。然而，对魁蚶凝集素的研究几乎空白，因此，深入开展魁蚶凝集素相关的研究，可以丰富魁蚶免疫系统，为进一步研究魁蚶的免疫防御机制提供材料。
本研究在魁蚶转录组文库的基础上，筛选得到魁蚶C型凝集素Sb-Lec1基因，运用RACE技术扩增得到cDNA全长，同时，运用实时荧光定量PCR技术检测该基因在魁蚶中的组织表达情况及其在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激后的表达响应情况，探究该基因在魁蚶免疫应答方面的作用，从而为魁蚶病害防治以及育种提供资料。
1 材料与方法 1.1 实验材料实验所用魁蚶购自山东省莱州市长渔水产有限公司。壳长约为60 mm，于25℃实验室充气暂养，暂养约1周后开始实验，期间投喂螺旋藻，实验处理前2 d停止投喂。鳗弧菌为本实验室保存的菌种。
1.2 魁蚶C型凝集素全长的克隆 1.2.1 总RNA的提取Trizol(TaKaRa，日本)法提取总RNA：解剖组织，用研磨棒充分研磨后，12000 r/min离心5 min后，取上清液，加入200 μl氯仿，剧烈震荡3 min，静置后，离心15 min。取上清液400 μl，加入相同体积的异丙醇，上下颠倒混匀，–20℃沉降核酸。75%乙醇洗涤核酸，干燥后，DEPC水溶解核酸，用DNase(Progema，美国)去除基因组DNA。1.0%琼脂糖检测RNA完整性，核酸分析仪(Eppendorf)检测其纯度和浓度。
1.2.2 基因全长的克隆与测序根据获得的魁蚶C型凝集素的部分序列，设计特异性引物用于扩增Sb-Lec1基因的全长。利用载体上的通用引物T7与特异性引物Sb-Lec1-F1扩增Sb-Lec1基因的3'末端，用pBluescript SK(+/-)载体上的通用引物T3与特异性引物Sb-Lec1-R1扩增Sb-Lec1基因的5 末端(表 1)。具体步骤：扩增体系为25 μl，内含cDNA模板1.0 μl，10×PCR Buffer 2.5 μl，1.5 μl of MgCl2 (25 mmol/L)，dNTPs Mixture(2.5 mmol/L) 2.0 μl，正向引物、反向引物各1.0 μl (10 μmol/L)，Taq酶(1U) 0.2 μl，ddH2O 15.8 μl；3'RACE反应程序：94℃ 30 s，57.5℃ 30 s，72℃ 30 s，33个循环，5′RACE反应程序为94℃ 35 s，57℃ 35 s，72℃ 35 s，32个循环。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后，将目的条带切胶回收、纯化。纯化获得的片段与pMD18-T载体连接，连接产物转化到感受态细胞TOP10中。获得的阳性克隆子经菌液PCR鉴定后，由青岛海大蓝科公司测序。
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表 1 引物序列 Table 1 Primers used in this study |
将筛选拼接得到的魁蚶凝集素基因全长序列，利用NCBI的ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)程序进行开放阅读框分析，预测编码氨基酸序列；利用ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)对C型凝集素分子量(Mw)及理论等电点pI进行预测；SignalIP 4.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)查找C型凝集素信号肽；SMART (http://www.expasy.ch/SMART)进行蛋白质结构域分析；ExPASy PROSITE(http://prosite.expasy.org/)查找形成二硫键的半胱氨酸。用NCBI的Blastp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)对序列进行同源检索，选取不同物种的C型凝集素氨基酸序列，用DNAman8.0软件与魁蚶Sb-Lec1氨基酸序列进行同源性比对分析，在此基础上用MEGA6.0构建系统发育树。
1.3 魁蚶C型凝集素基因对鳗弧菌刺激的响应 1.3.1 鳗弧菌刺激将魁蚶个体随机分为对照组和处理组，为鳗弧菌刺激实验做准备。鳗弧菌用LB液体培养基重悬后，扩大培养，培养至OD600 nm=0.4 (1 OD=5×108 CFU/ml)(郑利兵等, 2015)，取一定体积的菌液离心后取沉淀，用同体积的PBS悬浮沉淀备用。用微量注射器向处理组个体的前闭壳肌处注射50 μl菌悬液，然后放回原养殖槽内。分别在注射后0、2、4、8、12、24、48、72 h，随机选取4个个体解剖，取血(4℃，12000 r/min离心15 min，收集血细胞沉淀)、外套膜、闭壳肌、斧足、鳃、肝胰腺，用于提取总RNA，对照组注射等量的PBS(0.1 mol/L, pH=7.4)，每个时间点取4个个体作为对照。
1.3.2 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)为了检测魁蚶凝集素基因的组织分布以及其在鳗弧菌刺激下的响应状态，将解剖获得的各种组织提取总RNA，根据PrimeScriptTM RT reagent kit (TaKaRa，日本)试剂盒反转录得到的cDNA作为进行qRT-PCR的模板。根据获得的魁蚶C型凝集素全长，运用Primer Premier 5.0软件设计qRT-PCR引物qSb Sb-Lec1-F2、qSb Sb-Lec1-R2(表 1)，β-actin作为内参基因，运用ABI7500荧光定量PCR仪进行实验，反应参照SYBR® Premix Ex TaqTM(TaKaRa，日本)试剂盒说明书进行。反转录体系为20 μl：SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ(2×)，10 μl；PCR正向引物(10 μmol/L)，0.4 μl；PCR反向引物(10 μmol/L)，0.4 μl；ROX Reference DyeⅡ(50×)，0.4 μl；cDNA模板，2.0 μl；DEPC水，6.8 μl，反应程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40个循环；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。实验设置4个平行组。反转录产物置于–20℃保存备用。
1.3.3 实验数据分析根据软件获得的每个反应的CT值，对实验结果进行统计分析，采用2-ΔΔCT方法(Livak et al, 2001)进行。根据每个样品的4个平行实验所得的数据计算相对表达量平均值和标准差。
2 结果 2.1 Sb-Lec1基因cDNA序列分析运用PCR和RACE技术扩增Sb-Lec1基因3 、5 端，经过拼接，该基因的全长为700 bp，其中5'-UTR为29 bp，3'-UTR为167 bp。开放阅读框(Open reading frame，ORF)长度为504 bp，编码167个氨基酸，预测的分子量为19.11 kDa，理论等电点为4.74，其起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，polyA加尾信号为AATAAA(图 1)。
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图 1 魁蚶Sb-Lec1基因全长cDNA及推测的氨基酸序列 Figure 1 The full-length cDNA sequence and the deduced amino acid sequence of Sb-Lec1 gene of S. broughtonii 下划线部分表示信号肽序列，终止密码子用星号标出；结构域用波浪线标出，阴影部分为Sb-Lec1的6个半胱氨酸，带框的氨基酸序列为糖结合位点，polyA信号序列AATAAA用双下划线标出 The putative signal peptide is underlined. The asterisk (*) indicated the stop codon. The carbohydrate-recognition domains (CRD) were wave-underlined and six conserved disulfide-bonded cysteine residues that define the CRD were indicated by shadow. The sugar binding sites were enclosed in a box. PolyA signal AATAAA was double underlined |
信号肽预测结果显示，该氨基酸序列第1~23个氨基酸为其信号肽序列，运用Smart预测蛋白质的结构域，结果显示，第2~155个氨基酸为魁蚶C型凝集素的糖识别结构域(CRD)，该CRD含有的参与二硫键形成的6个半胱氨酸，分别位于Cys27、Cys38、Cys56、Cys129、Cys146、Cys154，其中，Cys56、Cys129、Cys146、Cys154为其保守的半胱氨酸，分别在Cys56和Cys154、Cys129和Cys146之间形成2个二硫键。在CRD区域中具有决定糖结合的特异性序列为“EPN”和“WND”(图 1)。
2.2 Sb-Lec1基因cDNA同源分析运用NCBI将拼接得到的Sb-Lec1基因CRD编码氨基酸序列进行同源分析。结果显示，魁蚶Sb-Lec1基因CRD编码的氨基酸序列与其他物种具有一定的相似性，例如，与海湾扇贝(FJ469995、FJ469996)相似性分别为39%、38%，与紫贻贝(Mytilus galloprovincialis) (KP125900、KP125901)相似性分别为34%、35%，与长牡蛎(Crassostrea gigas) (XM_011438591、XM_011452629、XM_011450108)的相似性分别为40%、41%、38%，与九孔鲍(Haliotis diversicolor)(JN314432)的相似性为38%，与皱纹盘鲍(Haliotis discus discus)(EF103335)的相似性为36%，与文昌鱼(Branchiostoma floridae) (XM_ 002613005.1)的相似性为35%，与网纹鳉(Poecilia reticulata) (XM_008414919)的相似性为33%，与家蝇(Musca domestica)(XM_011296834)的相似性为41%。
DNAMAN软件将Sb-Lec1基因与上述物种C型凝集素基因进行序列比对(图 2)，结果显示，Sb-Lec1基因所编码的氨基酸序列与其他物种的凝集素基因具有相似的结构，如都含有形成二硫键4个保守的半胱氨酸，糖结合位点几乎都具有独特的“WND”和“EPN”结构。用Mega 6.0软件以邻位相接法(NJ法)构建基因系统Sb-Lec1进化树，在该系统进化树中，魁蚶先与海湾扇贝、长牡蛎、九孔鲍、紫贻贝、菲律宾蛤仔等软体动物聚为一起，再与文昌鱼、网纹鳉、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)几种鱼类聚在一起(图 3)。
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图 2 不同物种C型凝集素氨基酸序列比对 Figure 2 Multiple sequence alignment of C-type lectin from different species 各物种GenBank登录号为海湾扇贝1(FJ469995)，海湾扇贝2(FJ469996)，紫贻贝1(KP125900)，紫贻贝2(KP125901)，长牡蛎1(XM_011438591)，长牡蛎2(XM_011452629)，长牡蛎3(XM_011450108)，九孔鲍(JN314432)，皱纹盘鲍(EF103335)，文昌鱼(XM_002613005)，网纹鳉(XM_008414919)，家蝇(XM_011296834)。黑色背景表示相同的氨基酸，灰色表示性质相似的氨基酸，保守的半胱氨酸用三角形标出 A. irradians1(FJ469995), A. irradians2(FJ469996), M. galloprovincialis1(KP125900), M. galloprovincialis2 (KP125901), C. giga1(XM_011438591), C. giga2(XM_011452629), C. giga3(XM_011450108), H. diversicolor(JN314432), H. discus discus(EF103335), B. floridae(XM_002613005), P. reticulata (XM_008414919), M. domestica(XM_011296834). The identical amino acids were shown with black shadow and the similar amino acids were indicated by gray shadow. The cysteines constituting disulfide bonds in the structure domain acids were marked with black triangle "▲" |
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图 3 NJ法构建Sb-Lec1基因系统进化树 Figure 3 The phylogenetic tree of Sb-Lec1 gene constructed by Neighbor-Joining method |
以β-actin作为内参，检测Sb-Lec1基因在不同组织中的表达(图 4)。结果显示，Sb-Lec1基因在肝胰腺、血细胞、鳃、斧足、闭壳肌、外套膜6种组织中均有表达，且表达量存在差异。Sb-Lec1基因在肝胰腺中表达量最大，为闭壳肌的21.92倍(P < 0.05)，其次是在血细胞中，其表达量为闭壳肌的8.40倍(P < 0.05)。
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图 4 Sb-Lec1 mRNA在不同组织中的表达分布 Figure 4 The expression of Sb-Lec1 mRNA in different tissues of S.broughtonii 不同字母表示组织之间Sb-Lec1基因表达量差异显著(P < 0.05)。数据以平均值±标准差(n=4)表示，下同 Significant differences among tissues were indicated with different alphabets at P < 0.05. Values were shown as Mean±SD (n=4), the same as below |
运用qRT-PCR检测魁蚶血细胞、肝胰腺、外套膜、闭壳肌、鳃、斧足6种组织中的Sb-Lec1基因对鳗弧菌刺激的响应(图 5)。结果显示，鳗弧菌刺激后，Sb-Lec1基因在6种组织中的表达量较对照组均呈现出明显上升的趋势。以对照组Sb-Lec1基因的表达量为基准，鳗弧菌刺激2 h后，肝胰腺、血细胞中的表达量明显高于对照组，分别为对照组的4.67倍和11.53倍；而在鳃和斧足中，8 h的表达量出现明显的上升趋势，分别为对照组的4.50倍和2.83倍；在闭壳肌中，刺激2 h就开始出现表达量显著升高的现象，在4 h时达到最高，为对照组的9.55倍；在外套膜中，刺激4 h时的表达量明显升高且达到最大值，为对照组的19.55倍，随后各组织表达量均出现回落现象。由此可见，经鳗弧菌刺激后，Sb-Lec1基因在各组织中的表达量表现为先升高后降低的变化趋势。
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图 5 鳗弧菌感染后魁蚶6种组织中Sb-Lec1 mRNA的表达 Figure 5 Sb-Lec1 mRNA expression level after V. anguillarum challenge in six tissues A：肝胰腺；B：血细胞；C：鳃；D：闭壳肌；E：斧足；F：外套膜与对照组相比，1个星号表示组间差异显著(P < 0.05)，2个星号表示组间差异极显著(P < 0.01) A: Hepatopancreas; B: Hemocytes; C: Gill; D: Adductor muscle; E: Foot; F: Mantle. Compared with the control group, significant differences were indicated with an asterisk at P < 0.05, and with two asterisks at P < 0.01 |
由于无脊椎动物缺乏类似于脊椎动物的获得性免疫系统，只有依靠固有免疫来防止病原的感染，以维持机体的正常生命活动。C型凝集素作为固有免疫系统重要的体液免疫因子，参与固有免疫的多种途径，包括抗原的识别与清除(张峘, 2010)，在Ca2+存在下能够特异性识别病原微生物表面的糖类物质，引起一系列免疫反应，从而有效地清除入侵的病原微生物(邢建晓等, 2016)，在软体动物尤其是贝类中得到广泛研究。本研究在以前研究的基础上，将魁蚶作为对象，对其免疫相关基因研究进行补充，通过构建魁蚶高通量测序转录组文库，并利用RACE技术获得了魁蚶Sb-Lec1基因全长cDNA；检测了其mRNA在魁蚶中各组织的分布情况和在外源微生物刺激下表达量的变化，对探讨C型凝集素在固有免疫防御中发挥的作用具有重要意义。
结构分析显示，Sb-Lec1基因含有1个由23个氨基酸构成的信号肽序列，说明该C型凝集素基因编码的蛋白质是通过经典的分泌方式分泌到细胞外起作用。Sb-Lec1含有1个CRD，具有丰富的二硫键，这与许多贝类C型凝集素的结构相似，如文蛤(Meretrix meretrix)Mm-Lec1和合浦珠母贝Po-Lec1序列中也包含1个CRD和6个保守的半胱氨酸(胡钰婷等, 2011；李猛等, 2015)，而栉孔扇贝C型凝集素基因Cflec-3和Cflec-4中分别含有3个和4个CRD，海湾扇贝AiCTL-6中含有1个CRD(张峘, 2010)。在C型凝集素中，一般含有EPN基域和WND基域与Ca2+共同作用完成对糖基分子的结合(胡钰婷等, 2011)，Sb-Lec1含有参与糖基特异性识别的基序EPN和WND，EPN可以对甘露糖进行识别，且仅在胶原凝集素和选凝素中存在(陈政良等, 1997)。所以，Sb-Lec1有可能是一种胶凝集素或选择凝集素，而WND基序一般只在脊椎动物中有高保守性(胡钰婷等, 2011)。研究发现，文蛤Mm-Lec1中含有糖基化位点QPN，可识别半乳糖(李猛等, 2015)，而海湾扇贝AiCTL-6中含有1个EPD基序，栉孔扇贝Cflec-5含有的基序为EPN(张峘, 2010)，这些基序与Ca2+共同作用参与对糖类的识别，在魁蚶Sb-Lec1基因中含有WND的特殊性，可能与物种的差异有关，有待进一步研究。
将魁蚶Sb-Lec1基因与其他种类进行同源比对分析并构建进化树，比对结果显示，魁蚶Sb-Lec1基因与其他序列同源性在33%~41%之间，且都具有1个结构域和4个保守的半胱氨酸，与长牡蛎、家蝇的相似性最高，为41%，与网纹鳉的相似性最低，为33%。进化树分析结果显示，魁蚶Sb-Lec1基因与软体动物亲缘关系较近，与鱼类关系较远，与其分类地位一致。将魁蚶与其他物种的CRD所编码的氨基酸序列进行同源性和相似性比对，发现它们的同源性与相似性并不是很高。在张峘(2010)的研究中，栉孔扇贝的Cflec-3基因与其他物种的相似性为40%~56%，海湾扇贝AiCTL-6基因与其他物种的相似性为45%~54%，可见C型凝集素是一个进化较快的基因，但具有高保守性特征序列。
qRT-PCR检测发现，Sb-Lec1基因在魁蚶所有组织中均有表达，这与其他贝类C型凝集素基因的研究结果基本一致。Sb-Lec1基因在肝胰腺中的表达量最高，血细胞次之，外套膜中的表达量最少，在合浦珠母贝中，Po-LEC1 mRNA在不同组织中的均有表达量，消化腺中最高，血细胞中最低(胡钰婷等, 2011)，而文蛤Mm-Lec1 mRNA在所检测组织中都有表达，其中，鳃中表达量最高(李猛等, 2015)；海湾扇贝中AiCTL1和AiLec基因分别在海湾扇贝的血细胞和肝胰腺中表达量最高(Zhu et al, 2009)；栉孔扇贝Cflec-4基因只在肝胰腺和性腺中表达，而在其他组织中检测不到mRNA的表达。鳃是软体动物中免疫系统的“第一道防线”，肝脏和血液是行使免疫功能的主要组织器官。在不同种类的贝类、不同组织中表达量不同，可能是由于不同物种C型凝集素的分布及发挥功能不同造成的。
在弧菌刺激下，不同时间、不同组织中Sb-Lec1基因表达量均出现先升高后降低的趋势(P < 0.05)，这与文蛤(李猛等, 2015)和栉孔扇贝(胥炜等, 2005)等的表达模式相同。在栉孔扇贝中，C型凝集素在血细胞中的表达量较低，但在鳗弧菌刺激后，6 h时表达量达到最大，随后表达量逐渐减弱，而在文蛤中，弧菌感染6 h时，Mm-CTL基因表达量明显上升，在12 h时达到最高值，随后有所下降，说明C型凝集素基因的表达受微生物刺激的诱导。本研究表明，魁蚶Sb-Lec1基因能够参与免疫激活反应，并能维持机体的稳态，参与机体的免疫和防御，为进一步研究C型凝集素的免疫功能提供了依据。
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