鱼类繁殖是种群延续的基础，直接决定了其资源量变动。性腺发育是鱼类繁殖的关键过程，是鱼类把所获得的物质和能量用于繁殖再分配的过程。了解鱼类性腺发育特征以及性腺发育的调控因子，准确确定鱼类的产卵特性，对于鱼类繁殖生态、种群结构和资源增殖研究，以及掌握鱼汛和中心渔场的变动均具有重要意义。

近年来，受环境变化和人为因素的影响，很多鱼类生物学特征发生了显著变化，渔获个体小型化、低龄化日趋严重(宓崇道, 1997; 林龙山等, 2004; 李显森等, 2006; 张国政等, 2010)，同时，伴随着繁殖生物学的相应变化(凌建忠等, 2005; 李建生等, 2015)，性成熟提早、相对繁殖力提高已经是普遍现象(李城华, 1983; 曾玲等, 2005; 林龙山等, 2009)。

黄海高眼鲽(Cleisthenes herzensteini)隶属于鲽形目Pleuronectiformes、鲽科Pleuronectidae、高眼鲽属Cleisthenes，为冷温性底层鱼类，主要分布于33 °N以北的海区(Wan et al, 1998)，是黄、渤海鲆鲽类中数量最多的种类，也是黄海渔业生态系统中的主要种类。研究证明，黄海高眼鲽种群结构已经改变，其资源量明显下降，体长分布集中，优势体长减小，“小型化”明显(Shan et al，2012)。因此，本研究基于近年来高眼鲽黄海调查资料，对高眼鲽卵巢发育特征及卵径分布进行了分析，以期为黄海高眼鲽补充动态研究和资源的合理开发利用提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 样品来源

高眼鲽样品来源于“北斗”号调查船2016年8月、10月、11月及2017年1月在黄海的渔业资源调查，取样站位见图 1。样品采集159尾，体长为80~353 mm，体重为7~531 g。现场进行解剖留取卵巢，自卵巢血管面的前、中、后三部分各切取组织小块保留。采用Davidesons AFA固定液固定，24 h后换浓度为70%乙醇保存，组织学测定40尾。

1.2 组织切片

固定的卵巢组织经过自动脱水机(LEICA TP1020)脱水，二甲苯透明和浸蜡后，用包埋机(LEICA 1160)包埋，用半自动切片机(LEICA RM2145)切片，切片厚度为6 μm，自动染色机(SHANDON Varistain 24-4)进行HE染色，每份样品非连续切片2张，用中性树胶进行封片。

1.3 卵巢发育观测

用ZEISS Scope.A1显微镜与配套的图像处理软件Axiovision LE64观察卵巢内卵母细胞的发育特征并进行时相组成分析。卵巢发育分期及卵母细胞时相的划分采用Мейeh BA(1939)的原则，同时参考楼允东(1980)和刘筠(1993)。每张切片统计视野为5~10个(约100~500个卵母细胞)，以平均数的百分数表示。

1.4 卵径分布分析

取保存完好的卵巢左右2叶的前、中、后共六部分，随机取500~1000粒，在ZEISS Scope.A1显微镜下进行观察，用Axiovision LE64专业图像处理软件测量卵径(长径)。以0.05 mm分组间距统计卵径分布，各卵径组统计包括卵径组下限的卵母细胞，不包括卵径组上限的卵母细胞。

2 结果与分析 2.1 卵母细胞的发育特征 2.1.1 第1时相

卵原细胞或卵原细胞向初级卵母细胞过渡期。细胞圆形或椭圆形、体积小，卵径为17.40~ 48.42 μm，细胞质少，细胞核明显。核内染色质细丝状，形成稀疏的网。

2.1.2 第2时相

小生长期的初级卵母细胞。细胞体积变大，卵径为22.46~193.04 μm，呈多角形。细胞质嗜碱性，呈疏松微粒状，细胞核仁数增加，靠核膜内侧分布，核径为20.01~86.41 μm，细胞核周围出现生长环，强嗜碱性(图 2A)；后期卵膜稍微增厚，出现1层较薄的滤泡细胞，核仁外移到核膜边缘，胞质外围出现卵黄核(图 2B)。

2.1.3 第3时相

大生长期的初级卵母细胞。细胞体积进一步增大，基本呈圆形，卵径为98.04~286.33 μm，核径为39.07~77.96 μm。细胞外出现2层滤泡膜，外层厚内层薄，界限不明显，放射膜开始形成。早期的卵母细胞细胞核呈不规则叶状，核仁多位于核膜内缘，细胞质弱嗜碱性。并且胞质边缘出现液泡，形成环状结构(图 2C)，随着卵母细胞体积的增大，液泡从细胞质边缘向内逐渐增多、变大；后期的卵母细胞放射膜逐渐增厚，核膜变得凹凸不平，大部分核仁在核膜边缘分布，少数分散在核中央，卵黄核消失，卵膜内缘液泡之间卵黄开始形成，随着生长逐渐增多(图 2D)。

2.1.4 第4时相

发育晚期的初级卵母细胞。体积大幅增大，卵径为271.21~623.19 μm。在本时相早期，细胞核位于卵母细胞中央，核径为58.32~127.56 μm，核仁分散于核中央，并逐渐溶解，放射膜增厚为10.56~ 18.47 μm，除核周及靠近卵膜边缘含有较多嗜碱性细胞质外，其余充满卵黄颗粒(图 2E)；后期的卵母细胞核膜开始溶解，细胞核逐渐向卵膜孔方向移动，核仁逐渐消失，动物极形成，卵母细胞进入成熟期(图 2F)。

2.1.5 第5时相

初级卵母细胞向次级卵母细胞过渡期。卵母细胞体积达到最大，卵径为420.12~806.24 μm。本时相早期，卵母细胞仍可见细胞核，核仁变成细小颗粒状，多聚集于中间，放射膜变薄，细胞质中充满粗大的卵黄颗粒(图 2G)；后期，卵黄颗粒变大并逐渐形成较大的卵黄板块，核膜、核仁溶解(图 2H)，成熟的卵从滤泡膜中释放出来，形成空滤泡(图 2I)。即将排出的卵母细胞发生水合作用，游离于卵巢腔中，水合卵母细胞在石蜡切片上透明并收缩成阿米巴形(图 2J)。

2.1.6 退化卵母细胞

退化吸收前期，充满卵黄的卵母细胞卵膜界限不清，放射膜开始溶解，滤泡膜内2层滤泡细胞排列混乱，滤泡膜增厚，层数增加，有单个细胞游离出来，并且侵入细胞内，卵黄颗粒胶液化，逐渐被分解，卵母细胞内开始出现不规则空腔(图 2K)；退化后期，滤泡膜基本不存在，由于滤泡细胞的吞噬作用，靠近卵膜的卵黄粒基本消失，中间只剩下吸收的残余组织和少量未吸收卵黄颗粒，放射膜断裂，卵膜发生皱褶，最后断裂而消失(图 2L)。

2.2 卵巢形态与组织学特征 2.2.1 Ⅰ期

卵巢整体大致呈细条状、透明，前部延伸短小，表面无血管或甚微弱。外观不能与雄性精巢区分。卵巢壁薄，为30.02~38.24 μm，细胞排列紧密、体积较小、形成明显的蓄卵片，其上主要为第1时相的卵原细胞以及发育早期的第2时相卵母细胞(图 3A)。

2.2.2 Ⅱ期

卵巢体积增大，呈浅粉色或浅白色，前部稍大逐渐往后延伸，后端细长，呈圆锥形，表面可见微细的血管。卵巢内结缔组织和血管发达，卵巢壁较薄，为34.65~39.25 μm。卵母细胞发育整齐，为第1、2时相的卵母细胞(图 3B)。

2.2.3 Ⅲ期

卵巢呈黄白色，体积明显增大，占据整个腹腔的1/2，总体呈扁平状，前段膨胀延长，呈三角形。肉眼可见黄色卵粒，卵子紧密连接于蓄卵片，较难剥离，表面血管丰富。卵巢内卵母细胞为圆形，体积增大，卵巢壁增厚，为46.37~116.43 μm，主要由第2时相晚期卵母细胞以及第3时相卵母细胞组成，也有出现第4时相早期卵母细胞(图 3C)。

2.2.4 Ⅳ期

卵巢体积进一步增大、呈橘黄色或橘红色，体表可见明显隆起，占据腹腔的2/3。卵巢表面血管发达，前部三角形变得更加丰满，在腹腔内向后延伸明显。肉眼可见饱满卵粒，其中还出现少量半透明卵粒。卵巢中同时存在1、2、3、4、5五个时相的卵母细胞，其中第4时相卵母细胞占主要优势，卵巢壁为40.34~135.56 μm(图 3D)。

2.2.5 Ⅴ期

卵巢进入临产期，充满整个体腔，松软而膨大，呈橘黄色，对鱼体腹部稍加压力，卵粒即能流出体外。卵粒清晰易辨、大而透明。此时卵巢内第5时相卵母细胞占主要成分，除此之外，还存在不同发育程度的第4时相卵母细胞和初积卵黄的第3时相卵母细胞以及处于小生长期的第1、2时相卵母细胞分布在大型卵母细胞之间。卵巢壁为35.17~74.24 μm (图 3E)。Ⅴ期停留阶段较短，产完1次卵后卵巢处于Ⅵ-Ⅳ'期。

2.2.6 Ⅵ-Ⅳ'期

产卵后的卵巢外层包膜变成紫黄色，体积变小，卵巢腔间隙变大，仍然能看到有大量卵粒存在。卵巢内存在较多结缔组织，血管布满卵巢膜，卵巢壁较厚，为80.78~116.46 μm。卵母细胞排列较为稀松，具有大量第2时相卵母细胞、第3时相早期卵母细胞，以及充满卵黄的第4时相的卵母细胞和部分未排出的成熟的第5时相卵母细胞。此外，有空滤泡和呈泡沫状的退化卵(图 3F)。Ⅵ-Ⅳ'期停留时间不长便转入Ⅴ'期，再次进行产卵。

2.2.7 Ⅴ'期

外观和未产卵Ⅴ期没有明显差别，体积稍有减小，外观橘黄色，卵巢壁稍有松弛、柔软，卵巢壁为50.40~86.51 μm，卵粒彼此分离，透明卵的比例略有增加。主要由第4、5时相卵母细胞以及水合卵母细胞组成，同时，第2、3时相的卵母细胞变多(图 3G)，卵母细胞之间存在空滤泡以及排卵痕迹。

2.2.8 Ⅵ期

产完卵后的卵巢进入Ⅵ期，卵巢退化，体积和重量明显减小，血管丰富，呈紫红色，卵巢腔萎缩，卵巢膜松弛变厚，呈缩皱的囊状。排卵后卵巢成为中空状态，未排出的卵在卵巢周围，卵巢腔内有一些紫色粘浆液。卵巢有很多空滤泡、结缔组织和血管，后部空虚，前、中部尚有未成熟卵母细胞和少量的未排出的成熟卵母细胞。隔壁崩溃，未排出的成熟卵母细胞被吸收(图 3H)。

2.2.9 Ⅵ-Ⅱ期

卵巢为深红色，基部颜色深，卵母细胞发育转入Ⅱ期，早期卵母细胞明显增加，卵巢腔内空滤泡和残留卵被吸收，还能见未吸收完的退化卵母细胞。卵母细胞发育较未产卵Ⅱ期不整齐，除了第1、2时相卵母细胞，还有少数已经开始积聚卵黄的发育到第3时相前期的卵母细胞。卵巢壁厚，为232.46~274.59 μm(图 3I)。

2.2.10 退化卵巢

外观特征与Ⅵ-Ⅱ期卵巢相似，呈现暗红色，个体较大且饱满，卵巢松弛有明显褶皱。卵巢内有结缔组织，细胞排列较为紧密。卵母细胞退化，细胞内变为泡沫状，同时存在发育早期卵母细胞(图 3J)。

2.3 卵巢中卵母细胞组成

Ⅰ期主要由第1、2时相卵母细胞组成，其中第1时相卵母细胞占绝对优势，85.05%。

Ⅱ期主要由第1、2时相卵母细胞组成，相比于Ⅰ期卵巢，第2时相卵母细胞比例增加，为59.24%。

Ⅲ期主要由第2、3时相卵母细胞组成，第1时相卵母细胞比例下降为12.86%，并且出现第4时相早期卵母细胞，为12.89%。

Ⅳ期主要由第2、4时相卵母细胞组成，相比较Ⅲ期卵巢，第3时相卵母细胞比例下降为13.27%，第4时相卵母细胞增加为30.93%。

Ⅴ期主要第2、4时相卵母细胞组成，第4时相卵母细胞占绝对优势49.09%，同时，出现第5时相卵母细胞且部分已经发生水合作用。

Ⅵ-Ⅳ'期中第2时相卵母细胞比例较高，为59.44%，其余各时相卵母细胞同时存在且比例接近。

Ⅴ’期卵巢中第4时相卵母细胞比例最高，第4、5时相卵母细胞比例有较大提高，分别为40.51%、24.85%，并且第5时相卵母细胞大部分处于水合状态。

Ⅵ-Ⅱ期卵巢存在第1、2、3时相卵母细胞，其中第2时相卵母细胞占优势60.73%，并且第3时相卵母细胞占较高比例19.62%(表 1)。

2.4 卵径分布

Ⅳ期卵巢中卵母细胞卵径呈单峰分布，卵径主要分布在0.45~0.55 mm。

Ⅴ期卵巢中卵母细胞呈单峰分布，卵径分布范围扩大，在0.70~1.15 mm间呈浅锯齿状分布，主要分布在0.50~0.70 mm，其中0.60~0.65 mm所占比例最高，为24.27%。

Ⅵ-Ⅳ’期卵巢中卵母细胞呈单峰分布，卵径分布在0.40~0.50 mm，其中0.45~0.50 mm占比例最高，为37.77%。

Ⅴ’期卵巢中卵母细胞呈双峰分布，在0.50~0.55 mm和0.90~0.95 mm处形成峰值(图 4)。水合卵母细胞以及处于小生长期的卵径较小的卵母细胞比例均有所提高。

3 讨论 3.1 卵母细胞的发育与退化

在硬骨鱼类中，由于遗传因素和长期环境影响，卵母细胞的发育和生长方式存在一定区别，其中卵黄和液泡的发生顺序在不同种类存在显著差异，这与不同的营养吸收方式有关(施瑔芳, 1988)。高眼鲽卵母细胞发育是先出现卵黄，随后液泡出现，与牙鲆(Paralichthys olivaceus)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)、宽体舌鳎(Cynoglossus robustus)、圆斑星鲽(Verasper variegates)等相同(孙朝徽等, 2008; 柳学周等, 2009; 倪海儿等, 1999; 徐永江等, 2011)；而大西洋牙鲆(Paralichthys dentatus)、欧洲黄盖鲽(Limanda limanda)等(Merson et al, 2000; Htun-Han, 1978)卵母细胞发育过程中液泡、油滴和卵黄颗粒同时出现；鲻鱼(Mugil cephalus)、小黄鱼(Larimichthys polyactis)等卵母细胞发育时液泡首先出现，紧靠在核的外周，随着液泡中脂肪物质的积累，逐渐均匀的分散在细胞质的各个部位，卵黄首先在靠近卵膜边缘的细胞质中形成，逐步向中央填充(吴佩秋, 1981; 何大仁, 1998; 方永强等, 2004)。这种卵黄和液泡发生方式的差异，反映了卵母细胞发育过程中营养积累及代谢的差异，也直接决定了卵母细胞的发育速度和时间，种群不同是造成这种差异的原因，另外，与不同生态类群也有关(倪娜等, 2011)。高眼鲽卵母细胞第2时相随着卵黄核的出现，细胞外围出现1层滤泡膜，滤泡膜是鞘膜细胞层和颗粒细胞层组成的细胞结构，是鱼类合成卵巢类固醇激素的基础结构，而雌激素对于卵黄合成具有诱导作用(Young et al, 1983)，随着卵母细胞发育，出现双层滤泡结构，滤泡上皮细胞突出许多微绒毛深入卵母细胞中，卵母细胞由此获得营养(Riehl, 1980)。当卵母细胞完全成熟时，由于微绒毛移出，滤泡膜脱离，卵母细胞营养积累结束。

高眼鲽卵母细胞退化时滤泡细胞排列紊乱、体积变大，卵黄颗粒从边缘往中心逐渐变小、分解。该时期卵母细胞对不利的外界条件非常敏感，极易受到损伤(何大仁, 1981)。高眼鲽卵巢退化期样品主要采集于11月，此时水温下降，产卵季节结束，卵母细胞被吸收，卵巢退化。另外，卵巢退化可能与鱼类营养状态及其他外部环境有关。通过观察发现，产卵时间早的高眼鲽个体有充足的时间进行排卵，卵巢基本能够达到排空状态，而产卵时间晚的个体在产卵季节结束时残存数量较多的卵母细胞。

3.2 卵巢的发育与卵径分布

高眼鲽卵母细胞发育存在不同步性，其卵巢中同时存在不同时相卵母细胞，并且各期卵巢中均存在一定数量的早期卵母细胞。研究证明，此部分卵母细胞的多少与亲鱼食物供给及生理状态相关(Bower et al, 1961)。另外，各时相卵母细胞的比例、被产出和被吸收数量，与资源状态有一定的关系，如北太平洋无须鳕(Merluccius productus)因资源减少，进而引起被排出的卵母细胞数量增加，被吸收的卵母细胞数量减少(Foucher et al, 1980)，这是鱼类维持其种群延续的内在繁殖机制的调节。

高眼鲽卵巢中各卵母细胞分离生长，卵径在Ⅳ、Ⅴ期卵巢中均呈单峰型分布，产卵后的Ⅵ-Ⅳ’期卵巢，卵径也呈单峰型分布，随着卵母细胞的进一步发育，卵巢到达Ⅴ’期，此时卵巢主要由水合卵母细胞和第4时相的卵母细胞组成，卵径呈双峰型分布。高眼鲽的这种双峰分批产卵，卵母细胞的补充以第4、5时相卵母细胞为主，这种方式不需要同时形成大量卵黄物质，减少了对能量的需求。鱼类卵巢中不同时相卵母细胞分布及排卵规律受神经内分泌和外部环境的双重调控(宋海霞等, 2005)，因此，关于高眼鲽的繁殖机制需结合内分泌及环境因素进一步研究。