中国明对虾亦称中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)，主要分布在太平洋西北海岸的黄海和渤海海区的山东、河北、辽宁、天津及江苏近海(王清印, 2014)。20世纪80年代，中国对虾养殖技术得到突破，中国对虾的养殖产量迅速增加，到1991年年产量达到20万t，成为我国最重要的对虾养殖品种(李健等, 2015)。然而，高速发展的中国对虾养殖业遇到诸多问题的挑战，尤其是1993年白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus, WSSV)的出现，使中国对虾的养殖业迅速衰退。新品种的培育为中国对虾养殖业走出困境提供了希望(Wang et al, 2003)。中国对虾"黄海2号"在连续多代的选育过程中，为了保持选育群体的遗传多样性水平，近交一直被控制在小于1%的水平(罗坤等, 2014)。但累代人工选育是否会降低中国对虾的遗传多样性，影响中国对虾的选育效果，尚缺少实际检测数据的支撑。

微卫星又称简单重复序列(Simple Sequence Repeat, SSR)，具有反应快速、技术简单、多态性高、共显性且符合孟德尔遗传等特点，现广泛应用于水生生物的遗传多样性分析。刘连为等(2014)利用筛选的8个微卫星位点对北太平洋柔鱼(Ommastrephes bartramii)6个群体的遗传多样性及遗传结构进行分析，显示具有较高的遗传多样性水平；Wang等(2016)利用8个微卫星位点分析了中国对虾亲本和回捕群体的遗传多样性，显示2个群体均具有较高的遗传多样性；毛守康等(2016)利用14个微卫星位点分析了梭鱼(Liza haematocheila) 4个野生地理群体的遗传多样性。

为进一步做好中国对虾的选育工作，本研究利用筛选的15对微卫星引物对韩国西海岸捕获的中国对虾野生群体和"黄海2号"人工选育第10代群体进行遗传多样性分析，以期深入了解累代人工选育条件下中国对虾遗传多样性水平和群体遗传结构的变化，为后续的人工选育、遗传改良和种质资源保护提供理论依据。

中国对虾野生群体是2013年从韩国西海岸(34°30'N, 127°30'E)捕获。人工选育群体为中国对虾"黄海2号"连续选育第10代群体。野生群体和人工选育群体各随机取40尾，取肌肉组织于–80℃保存，用于DNA的提取。

微卫星引物：利用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术筛选多态性高的SSR引物，共获得15对多态性高、反应好的中国对虾SSR引物。对正向引物的5'端进行荧光标记，荧光标记种类为FAM、HEX、TAMRA

采用醋酸铵法提取中国对虾尾节肌肉全基因组DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后(GeneFinder染色)，凝胶成像系统显示DNA无降解，利用Biodropsis2000超微量紫外分光光度计定量，用灭菌水将DNA浓度稀释到50 ng/μl，置于4℃冰箱保存备用。

PCR反应体系总体积为25 μl：模板DNA 2.0 μl (100 ng)，2×TSINGKE^TM Master Mix 12.5 μl (北京擎科新业生物技术有限公司)，正向和反向引物各0.5 μl，灭菌超纯水9.5 μl。PCR反应程序：94℃预变性5 min；每个循环包括94℃ 30 s，退火30 s (各引物的退火温度见表 1)，72℃ 30 s，30个循环；72℃延伸5 min；4℃保存。PCR产物的基因测序工作在生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表 1(Tab. 1)

表 1 中国对虾15个微卫星位点的引物序列及其特征 Table 1 Primers and characteristics of 15 microsatellites of F. chinensis 位点 Locus GenBank登录号 GenBank accession No. 引物序列 Primer sequences (5'–3') 退火温度 Annealing temperature (℃) 荧光标记 Marker RS1101 AY132811 F: CGAGTGGCAGCGAGTCCT 52 FAM R: TATTCCCACGCTCTTGTC EN0033 AY132813 F: CCTTGACACGGCATTGATTGG 64 HEX R: TACGTTGTGCAAACGCCAAGC BX06-2 / F: CCTTCGTCGTCCTCTTACTA 55 FAM R: TGGAAGAAACTAAGAGAGCA BX0130 AY132826 F: CTTTATCTACACACAAACCGC 55 TAMRA R: TGATACCAAAGGCTGTAGAGG IOPC14 / F: CGACCATTTTCGGTGTTC 55 HEX R: GCTGCGATAATTGAGACG Hrd4292 EF580117 F: AAGGGATGACAGGACATTTGC 58 HEX R: GACGCCATTTCTTCTCTTTCTG FCKR013 JQ650353 F: GCACATATAAGCACAAACGCTC 55 ROX R: CTCTCTCGCAATCTCTCCAACT SX201 AF525779 F: TATCGTTGAGGTTCGTCAATGC 60 FAM R: TCGCACTTCGTGTCAGTGTACC RS0683 AY132823 F: ACACTCACTTATGTCACACTGC 64 ROX R: TACACACCAACACTCAATCTCC RS062 AY132778 F: TGCTGAAGCTACACTACCTTCG 63 FAM R: TGATGAAACGCAAGCAAAGGC BM29561 BM295611 F: AACAGACCACATACGGGAC 53 HEX R: TTTTCGGAAGTAACATCACA BX916 / F: AAGTGCTGATAGTGGAAAGG 58 TAMRA R:TCTGGACAGATGTGTTTGACGC Hrd4353 EF580118 F: AGACTGTGAGGCAAATCCCG 57 TAMRA R: AGGCACTTCATTTCGCTTACAG FCKR002 JQ650349 F: CTCAACCCTCACCTCAGGAACA 60 ROX R: AATTGTGGAGGCGACTAAGTTC 113(B) AY132816 F: TGTCAAGAGAGCGAGAGGGAGG 66 ROX R: ATGCTTGTGACTTAGTGTAGGC

表 1 中国对虾15个微卫星位点的引物序列及其特征 Table 1 Primers and characteristics of 15 microsatellites of F. chinensis

利用Cervus 3.0.7软件计算15个微卫星位点的等位基因数(N_a)、有效等位基因数(N_e)、观测杂合度(H_o)、期望杂合度(H_e)和多态信息含量(PIC)。利用GenALEx 6.502软件进行Hardy-Weinberg平衡检验、Shannon指数(H)分析并计算群体F统计值、Nei's无偏遗传距离(uD)、无偏遗传相似度(uI)及基因流(N_m)。

有效等位基因$ {N_e} = 1/\sum {p_i^2} $

式中，p_i为位点第i个等位基因的频率，i为等位基因的个数。

Shannon指数$ H = - 1 \times \sum {({p_i}\ln {p_i})} $

式中，p_i为第i个等位基因在群体中出现的频率，i为等位基因的个数。

群体遗传多样性$ {H_{sp}} = - 1 \times \sum {\left[ {{p_i}Mln\left( {{p_i}M} \right)} \right]} $

式中，p_iM为位点在n个群体中的综合表型频率，n为研究群体的数量。

群体内的遗传多样性$ {H_{pop}} = \mathop \sum \nolimits H/n $

式中，H为位点在某个群体中的Shannon指数，n为研究群体的数量。

群体内遗传多样性所占的比例为H_pop/H_sp，群体间遗传多样性所占的比例为(H_sp-H_pop)/H_sp。

15个微卫星位点在2个群体共检测到462个等位基因，位点等位基因数(N_a)为3~44，有效等位基因数(N_e)为2~29，观测杂合度(H_o)和期望观测杂合度(H_e)分别为0.385~1.000和0.518~0.977，多态信息含量(PIC)为0.611~0.964。对野生群体和选育群体的各项参数进行分析，可以看出野生群体的等位基因各参数都在一定程度上高于选育群体(WP：N_a=26，N_e=15，H_o=0.852，H_e=0.909，PIC=0.886；BP：N_a=18，N_e=9，H_o=0.810，H_e=0.875，PIC=0.848)，说明野生群体的遗传多样性水平高于选育群体。Hardy-Weinberg平衡检验显示，野生群体有4个位点未偏离，其余位点均在一定程度上偏离；而选育群体大部分(11个)位点未偏离平衡，只有少数位点偏离。15个微卫星位点的遗传多态性见表 2。

表 2(Tab. 2)

表 2 15个微卫星位点在野生和人工选育群体中的遗传多态性 Table 2 Genetic diversity at 15 microsatellite loci in wild and breeding populations 位点 Locus 野生群体(WP) 选育群体(BP) Na Ne HO He PIC P Sig Na Ne HO He PIC P Sig RS1101 19 6 0.750 0.851 0.824 0.000 *** 8 4 0.525 0.736 0.679 0.053 ns EN0033 40 24 0.875 0.970 0.956 0.000 *** 23 12 0.821 0.926 0.908 0.000 *** RS062 28 20 0.850 0.961 0.947 0.000 *** 21 11 0.850 0.924 0.907 0.065 ns RS0683 29 12 0.975 0.929 0.913 0.867 ns 22 8 0.825 0.882 0.864 0.707 ns FCKR002 18 13 1.000 0.933 0.916 0.000 *** 18 12 1.000 0.929 0.912 0.390 ns FCKR013 31 22 0.950 0.967 0.953 0.001 ** 24 14 0.825 0.940 0.924 0.018 * BX06-2 22 7 0.385 0.862 0.842 0.000 *** 16 7 0.385 0.870 0.844 0.000 *** BX0130 34 24 0.925 0.970 0.957 0.144 ns 19 12 0.925 0.926 0.908 0.169 ns IOPC14 26 15 1.000 0.945 0.929 0.003 ** 19 11 1.000 0.921 0.903 0.298 ns HRD4353 30 21 0.974 0.966 0.951 0.000 *** 24 11 0.900 0.927 0.906 0.155 ns HRD4292 28 13 0.975 0.937 0.920 0.000 *** 17 9 1.000 0.901 0.880 0.748 ns 113B 12 5 0.711 0.809 0.775 0.779 ns 14 5 0.692 0.810 0.780 0.011 * SX201 44 29 1.000 0.977 0.964 0.319 ns 22 15 0.950 0.943 0.927 0.912 ns BM295611 24 14 0.950 0.939 0.923 0.007 ** 18 7 0.875 0.878 0.854 0.964 ns BX916 3 3 0.455 0.612 0.521 0.002 ** 5 2 0.577 0.611 0.518 0.627 ns Mean 26 15 0.852 0.909 0.886 18 9 0.810 0.875 0.848 注：P为Hardy-Weinberg平衡检验值；Sig表示Hardy-Weinberg平衡显著性，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，ns表本不显著 Note: P was Hardy-Weinberg equilibrium test value; Sig indicated the Hardy-Weinberg significance, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ns indicated no significance

表 2 15个微卫星位点在野生和人工选育群体中的遗传多态性 Table 2 Genetic diversity at 15 microsatellite loci in wild and breeding populations

以微卫星位点RS1101和IOPC14为例，其在野生和选育群体中的等位基因频率如表 3所示。

表 3(Tab. 3)

表 3 位点RS1101和IOPC14在野生和选育群体中等位基因频率 Table 3 The allele frequency of RSI 101 and IOPC14 in wild and breeding populations 位点 Locus 群体 Population 等位基因及频率 Alleles and allele frequency RSI 101 野生WP 411 413 414 418 419 422 423 435 442 443 447 448 455 459 486 491 523 527 528 0.00 0.01 0.29 0.05 0.03 0.01 0.09 0.01 0.01 0.01 0.19 0.03 0.16 0.01 0.04 0.01 0.01 0.01 0.01 选育BP 0.03 0.00 0.36 0.00 0.00 0.01 0.03 0.00 0.00 0.00 0.29 0.01 0.24 0.00 0.00 0.00 0.00 0.04 0.00 IOPC14 野生WP 189 197 201 203 205 207 209 211 213 215 217 219 221 229 231 233 235 237 239 241 243 245 246 247 251 253 255 257 0.03 0.01 0.03 0.04 0.04 0.05 0.11 0.04 0.06 0.11 0.04 0.00 0.01 0.05 0.01 0.03 0.14 0.03 0.00 0.00 0.05 0.01 0.01 0.01 0.01 0.04 0.01 0.01 选育BP 0.05 0.00 0.01 0.03 0.03 0.04 0.00 0.14 0.11 0.11 0.01 0.04 0.05 0.16 0.01 0.05 0.00 0.00 0.04 0.08 0.00 0.03 0.00 0.00 0.00 0.01 0.01 0.00

表 3 位点RS1101和IOPC14在野生和选育群体中等位基因频率 Table 3 The allele frequency of RSI 101 and IOPC14 in wild and breeding populations

位点RS1101在野生和选育群体中的主要等位基因均为414、447和455，但这3个等位基因在野生和选育群体中的比例分别为29%、19%、16%和36%、29%、24%。位点RS1101在野生和选育群体中的等位基因数(N_a)分别为19和8。位点IOPC14的等位基因209和235在野生群体中的比例分别为11%和14%，但在选育群体中的比例全部为0；相反，等位基因211和229，选育群体所占的比例分别为14%和16%，而在野生群体中所占的比例分别为4%和5%，说明连续10代的人工选育导致了基因数量和比例的变化，其他微卫星位点在2个群体中也有类似特点。

观测杂合度(H_o)和Shannon指数(H)是判定群体遗传多样性水平的重要指标。利用Cervus 3.0.7和GenALEx 6.502对中国对虾野生群体和选育群体各40尾样品的分析结果显示，野生群体的平均观测杂合度为0.852，略高于选育群体的平均观测杂合度0.810(表 2)，二者之间无显著性差异(P=0.556)。野生群体和选育群体的Shannon指数(H)分别为2.786和2.399(表 4)，也无显著性差异(P=0.088)。说明选育采用的技术策略并未导致选育群体的遗传多样性发生显著变化。

表 4(Tab. 4)

表 4 中国对虾15个微卫星位点的F-分析及野生和选育群体的遗传多样性分布 Table 4 F-statistics and partitioning of genetic diversity of wild and breeding populations in F. chinensis at 15 microsatellite loci 位点 Locus Fis Fit Fst H Hsp Hpop Hpop/Hsp (Hsp-Hpop)/Hsp 野生WP 选育BP 野生WP 选育BP RS1101 0.119 0.287 0.179 0.010 2.241 1.485 1.974 1.863 0.943 0.056 EN0033 0.098 0.113 0.113 0.021 3.413 2.734 3.429 3.074 0.897 0.104 RS062 0.116 0.080 0.100 0.014 3.136 2.718 3.217 2.927 0.910 0.090 RS0683 –0.050 0.065 0.014 0.020 2.897 2.589 2.992 2.743 0.917 0.083 FCKR002 –0.072 –0.076 –0.081 0.008 2.636 2.623 2.722 2.630 0.966 0.034 FCKR013 0.018 0.122 0.070 0.014 3.254 2.867 3.269 3.061 0.936 0.064 BX06-2 0.553 0.558 0.569 0.042 2.422 2.224 2.604 2.323 0.892 0.108 BX0130 0.046 0.001 0.029 0.018 3.331 2.656 3.295 2.993 0.908 0.092 IOPC14 –0.058 –0.086 –0.065 0.019 2.957 2.623 3.019 2.790 0.924 0.076 HRD4353 –0.008 0.029 0.012 0.017 3.226 2.755 3.337 2.990 0.896 0.104 HRD4292 –0.041 –0.110 –0.082 0.006 2.926 2.434 2.783 2.680 0.963 0.037 113B 0.121 0.146 0.136 0.014 1.935 2.016 2.060 1.976 0.959 0.041 SX201 –0.024 –0.007 –0.016 0.012 3.571 2.848 3.514 3.209 0.913 0.087 BM295611 –0.012 0.003 0.005 0.022 2.857 2.339 2.874 2.598 0.904 0.096 BX916 0.257 0.056 0.155 0.015 0.990 1.068 1.088 1.029 0.946 0.054 Mean 0.071 0.079 0.076 0.017 2.786 2.399 2.811 2.592 0.925 0.075

表 4 中国对虾15个微卫星位点的F-分析及野生和选育群体的遗传多样性分布 Table 4 F-statistics and partitioning of genetic diversity of wild and breeding populations in F. chinensis at 15 microsatellite loci

基因流(N_m)是基因从一个种群到另一个种群的转移。N_m < 1，表明由于遗传漂变发生了分化；N_m > 1，表明遗传分化较小；N_m > 4，表明种群间的基因交流更充分，遗传分化更小。本研究获得的中国对虾野生群体与第10代选育群体间的基因流(N_m)为17.997，说明这2个群体间的遗传分化还相当小。F统计显示，群体间遗传分化指数F_st为0.017(P=0.001)。根据对F_st的划分(0 < F_st < 0.05，遗传分化较弱；0.05 < F_st < 0.15，遗传分化中等；0.15 < F_st < 0.25，遗传分化较大；F_st > 0.25，遗传分化极大)，表明野生群体和选育群体之间发生了弱遗传分化。遗传变异来源分析的结果显示，只有7.50%的遗传变异来源于群体之间，而92.50%的遗传变异来源于个体之间。Nei's无偏遗传距离和遗传相似度分别为0.177和0.838。F_is < 0，表明存在杂合子过剩现象，选育群体有4个位点显示杂合子过剩，而野生群体有7个位点显示杂合子过剩。野生群体和选育群体在位点FCKR002、IOPC14、HRD4292以及SX201都出现杂合子过剩现象。中国对虾15个微卫星位点的F统计分析以及野生和选育群体的遗传多样性分布见表 4。

利用微卫星等分子生物学手段对中国对虾野生群体和选育群体的遗传背景进行研究，分析累代人工选育对群体遗传多样性及遗传结构的影响，不仅有利于进一步的人工选育，更有利于对中国对虾基因库的长期利用和保护。本研究利用15对微卫星引物共筛选到462个等位基因，每个位点的等位基因数为3~44不等，平均每个位点检测到31个等位基因。根据Barker(1994)对微卫星选择的标准，至少有4个等位基因的微卫星方能较好地用于遗传多样性分析。本研究显示，野生和选育群体在15个微卫星位点几乎都存在大量的无效等位基因(N_e < N_a)，最主要的原因可能是微卫星位点的侧翼序列发生突变，导致基因无法合成(Lehmann et al, 1996)，而大片段等位基因的丢失也会造成无效等位基因的存在(Wattier et al, 1998)。针对无效等位基因，可以通过重新设计引物，从而避开发生变异的侧翼序列或者估计无效等位基因频率进行研究(刘连为等, 2014)。韩国西海岸的中国对虾野生群体有11个位点偏离Hardy-Weinberg平衡，而选育群体仅有4个位点偏离Hardy-Weinberg平衡，大部分位点都在Hardy-Weinberg平衡中。可能的原因是人工放流在一定程度上打破了野生群体的Hardy-Weinberg平衡，而人工选育群体大部分位点处在Hardy-Weinberg平衡中，可能与中国对虾的累代选育有很大关系。中国对虾育苗期间都会保留数量较大的群体作为种虾，虽然在人工受精时按照计划定向交配，但庞大的亲本群体会减小定向交配带来的影响。

和野生群体相比，中国对虾"黄海2号"第10代选育群体各位点等位基因发生了变化。结果显示，选育群体的主要等位基因发生了富集现象，而其他等位基因在不同程度上发生了缩减。缩减的原因一方面可能是无效等位基因的存在，也可能是由于样本数量较少，稀有等位基因无法检测到。选择育种本身不能产生新的基因，但可以通过选育提高目标性状基因或有利基因的频率，降低非目标性状基因或不利基因的频率，通过不断积累有利基因，以达到提高选育目标性状的目的。中国对虾"黄海2号"在选育过程中针对生长和抗病性状采用了定向选择育种的方式，在每代的选育过程中，选择生长快、抗病力强的家系和个体作为亲本繁育下一代，使生长和抗病相关基因不断积累强化，从而实现了提高养殖产量和成活率的目的。

中国对虾"黄海2号"选育群体的观测杂合度(H_o=0.810)和Shannon指数(H=2.399)与韩国西海岸野生群体的参数相近(H_o=0.852，H=2.786)，二者均没有显著差异，表明中国对虾"黄海2号"人工选育群体在连续选育10代后遗传多样性并没有显著性降低。张天时等(2005)利用微卫星技术分析了中国对虾人工选育群体第1代和第6代的遗传多样性，结果显示，两代之间没有显著性差异(Ho₁=0.6400，H₁=1.7382；H_o6=0.6300，H₆=1.6830)。张辉等(2010)分析了中国对虾养殖群体与野生群体mtDNA控制区序列，结果显示野生群体的基因多样度为0.9672，略高于养殖群体的0.9380。本研究数据是PCR产物经ABI3730测序后获得，同样的微卫星位点会获得更多的等位基因，因此，微卫星杂合度和Shannon指数偏大。

中国对虾"黄海2号"选育10代后仍具有较高的遗传多样性，这与选育采用的技术路线有很大关系。每代选育严格控制近交水平，且每代留作繁育的对虾亲本数量大，这些措施在一定程度上保证了中国对虾选育群体的遗传稳定性，使得中国对虾在繁育多代后仍保持较高的遗传多样性。遗传多样性是生物适应环境和遗传变异的关键，高遗传多样性的群体也是进行遗传育种的基础。本研究的"黄海2号"第10代选育群体遗传多样性高，在继续纯化现有品种的同时，可以继续对潜在基因进行挖掘和利用，从而为更多新品种的培育提供可能。韩国西海岸中国对虾野生群体和"黄海2号"选育群体的遗传分化指数F_st为0.017(P=0.001)，为弱的遗传分化。该结果与王伟继等(2005)利用AFLP技术分析中国对虾韩国南海群体与养殖群体遗传差异的结果相近(Nei's遗传距离为0.9899，遗传相似度为0.0102，表明群体间无显著的遗传分化)，但小于安丽等(2008)利用AFLP估计野生群体和中国对虾‘黄海1号’选育10代的群体的遗传变异系数(0.070)，也与张辉等(2010)基于K-2P模型计算得到中国对虾野生群体和养殖群体间的F_st (0.0698，P=0.00)有一定差别。这可能与使用的分子标记和研究的对虾群体不同有关。在其他物种的遗传结构分析中也有类似的结论，肖炜等(2015)利用mtDNA D-loop序列差异分析技术，对埃及品系尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的3个选育世代群体共80尾开展世代间遗传结构变异分析，结果显示，在目前选育方式下埃及品系尼罗罗非鱼世代间遗传信息较为稳定，选育并没有对罗非鱼选育群体的遗传结构造成大的影响。关建义等(2010)利用8个ISSR分子标记对4个黄河鲤(Cyprinus carpio)群体(2个野生群体和2个选育群体)的120尾个体的遗传多样性进行了分析，结果显示，这些群体间发生了较弱的遗传分化，表明人工选育群体的遗传结构尚未发生明显变化。

本研究获得的Nei's无偏遗传距离和遗传相似度分别为0.838和0.177，2个群体遗传变异只有7.50%来自于群体之间，其余都来自于个体之间。李朝霞等(2006)利用AFLP分析了连续选育5代的中国对虾群体的遗传变异，显示有92.89%的变异是来源于群体内，只有7.11%是来源于群体间。表明中国对虾"黄海2号"第10代选育群体与韩国西海岸野生群体之间并未发生显著的遗传分化。研究发现，十足目甲壳动物遗传变异型较低(李思发, 1988)。原因一方面可能是中国对虾生命周期较短，发生变异的机率较小；另一方面，中国对虾"黄海2号"在累代繁育过程中会引进野生群体，使繁育群体与野生群体间存在基因交流，这在很大程度上降低了选育群体与野生群体在遗传上的差异。