2. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室 青岛 266071;
3. 上海海洋大学水产与生命学院 上海 201306
2. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology(Qingdao), Qingdao 266071;
3. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306
栉孔扇贝(Chlamys farreri)主要分布于我国北方近海、日本、韩国和俄罗斯等沿海。随着养殖规模的扩大，出现了养殖产量下降和病害频发等问题(王如才等, 2004)。而虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)属冷水性双壳贝类，原产于日本北海道及本洲北部、俄罗斯千岛群岛的南部海域及朝鲜附近(常亚青等, 2008; 杨爱国等, 2004)。近年来，随着养殖规模的扩大，虾夷扇贝养殖群体出现了苗种成活率低、成体小型化、高死亡率和病害频发等问题(张明明等, 2008; 杨培民等, 2007; 李云峰等, 2011)。虾夷扇贝和栉孔扇贝在育苗和养殖上均遇到了瓶颈和无法单独解决的难题，而应用遗传学手段进行良种培育，选育抗病、抗逆和生长快的新品种(品系)是实现扇贝养殖业可持续发展的有效途径(Li et al, 2005)。
EST-SSR侧翼序列在物种之间高度保守，因此，EST-SSR引物可在物种之间通用。种间通用性分子标记作为重要的遗传学研究工具，对种间进化关系研究、种间比较作图、通用性遗传图谱构建等具有重要的意义(王晓涧, 2012)。虾夷扇贝和栉孔扇贝标记开发及应用的工作已有大量研究，现已有ISSR技术(吕振明, 2006; 何斌等, 2007)、RAPD技术(滕丽莉等, 2005)、SRAP技术(程宁宁等, 2009)和AFLP技术(于涛等, 2011)研究了虾夷扇贝、栉孔扇贝的遗传特性，但由于操作复杂或准确率低等缺点限制了分子标记的进一步发展，而基因组EST(表达序列标签，Expressed Sequence Tags，ESTs)兼具基因组微卫星标记的孟德尔遗传共显性的遗传特征和直接标记功能基因的优点，同时，相比其他分子标记，可靠性更高，且扩增的目标序列在基因的编码区开发成本较低，遗传信息含量丰富等优点(刘芳，2006)。因此，本研究对60对虾夷扇贝EST引物在栉孔扇贝基因组中的通用性进行了分析，对栉孔扇贝和虾夷扇贝的群体遗传多样性和群体遗传结构进行了分析，以期为进一步的分子辅助育种提供理论依据。
1 材料和方法 1.1 材料虾夷扇贝(壳长为10~12 cm)和栉孔扇贝(壳长为7~8 cm)均于2015年6月取自山东烟台长岛养殖区，从2个群体中分别随机选取30个个体作为研究材料，活体运回实验室，–80℃保存备用。
1.2 引物的设计与合成从已发表的文献(Zhang et al, 2016; Sun et al, 2016)中选择多态性高且扩增效果好的60对虾夷扇贝微卫星引物，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。
1.3 模板DNA的制备模板DNA提取自扇贝的闭壳肌。取其闭壳肌组织100 mg剪碎，加入500 μl匀浆缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；100 mmol/L EDTA，pH 8.0)，混匀后加入终浓度为0.5%的SDS和50 μg/ml的蛋白酶K，55℃消化3 h，然后分别用等体积的酚:氯仿(1:1)，氯仿:异戊醇(24:1)抽提，2倍体积乙醇沉淀，ddH2O溶解。基因组DNA浓度由GENEQUANTpro (Eppendorf) RNA/DNA分析定量仪和琼脂糖凝胶电泳检测其质量。模板DNA用灭菌的超纯水稀释成50 ng/μl，–20℃保存备用。
1.4 PCR扩增与电泳检验PCR反应体系总体积为10 μl，包括10×Buffer 1 μl、Mg2+(25 mmol/L)0.6 μl、dNTPs (各2 mmol/L) 1 μl、上下游引物(10 μmol/L)各1μl、模板DNA 1μl、Taq DNA聚合酶(Promega) 0.5 U，加超纯水补足10 μl。反应在Eppendorf扩增仪上进行。PCR反应程序：95℃预变性2 min，然后95℃ 45 s，退火45 s，72℃延伸45 s，共35个循环；最后72℃延伸10 min。扩增产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳进行预检测，然后在8%的变性聚丙烯酰氨凝胶上进行电泳分离，电泳结果银染显色。待凝胶干燥后使用扫描仪记录电泳图谱。
1.5 数据统计与分析根据每个个体产生的条带位置确定其基因型，利用Cervus 3.0软件计算多态信息含量(Polymorphism information content, PIC)、观测杂合度(Observed heterozygosity, Ho)、期望杂合度(Expected heterozygosity, He)、等位基因数(Number of allele, Na)、有效等位基因数(Effective number of allele, Ne)、Nei群体间的相似性系数和群体间遗传距离以及F-统计量进行遗传多样性的分析，统计显著性水平用Bonferroni校正。
有效等位基因数：
| $ {N_e} = 1/\sum {p_i^2} $ |
式中，pi为第i个等位基因的频率。
多态信息含量的计算方法：
| $ \begin{array}{l} {\rm{PIC}} = 1 - \sum\limits_{i = 1}^k {p_i^2} - \sum\limits_{i = 1}^{k - 1} {\sum\limits_{j = i + 1}^k {2p_i^2} } p_j^2 = \\ \;\;\;\;2\sum\limits_{i = 1}^{k - 1} {\sum\limits_{j = i + 1}^k {{p_i}{p_j}} } (1 - {p_i}{p_j}) \end{array} $ |
式中，k为等位基因数目，pi和pj分别为第i和第j个等位基因的频率。
平均杂合度观测值：Ho =观察到的杂合个体总数/观察到的个体总数；
| $ \begin{array}{l} \begin{array}{*{20}{l}} {{\rm{期望杂合度}}:}\\ {{\rm{固定指数}}\left({{F_{is}}} \right):}\\ {F - {\rm{统计量}}\left({{F_{st}}} \right):} \end{array}\begin{array}{*{20}{c}} {{H_e} = 1 - \sum {p_i^2} }\\ {{F_{is}} = 1-\left({{H_{\rm{o}}}/{H_{\rm{e}}}} \right)}\\ {{F_{st}} = {\rm{ }}{{\rm{ \mathsf{ σ} }}^2}P/P\left({1-P} \right)} \end{array}\\ \end{array} $ |
式中，P为某等位基因在整个群体中的平均频率; σ2P为该等位基因在分群体之间的方差。
Nei群体间的相似性系数：
| $ I = \sum {({X_i}{Y_i})} /{[\sum {({X_i}})^2}\sum {({Y_i}} {)^2}{]^{1/2}} $ |
式中，Xi、Yi分别为X和Y群体第i个位点的等位基因频率。
Nei群体间遗传距离：
| $ {D_A} = - {\rm{ln}}I $ |
加上偏差矫正后为：
| $ \begin{array}{l} I = \left({2n - 1} \right)\sum {({X_i}{Y_i})} /\\ \;\;{\{ \sum {[2n({X_i}})^2} - 1]\sum {[2n({Y_i}} {)^2} - 1]{\} ^{1/2}} \end{array} $ |
式中，Xi、Yi分别为X和Y群体第i个位点的等位基因频率。
2 结果 2.1 扇贝属间通用性引物的筛选将60对虾夷扇贝微卫星引物在虾夷扇贝和栉孔扇贝基因组DNA中进行PCR扩增。根据电泳条带优化反应条件，调整退火温度及时间，最终有21对引物可稳定扩增，条带之间较为清晰，引物通用性比例达35.00%，其中，17对引物的扩增产物具有多态性，占总数的28.33%(表 1)。
|
表 1 在虾夷扇贝和栉孔扇贝基因组中扩增出多态性条带的17对EST-SSRs Table 1 Seventeen polymorphic EST-SSRs were amplified from the genomes of the scallops P. yessoensis and C. farreri. |
17对EST引物在虾夷扇贝、栉孔扇贝群体中均能检测到较高的多态性，但多态性水平有所不同(表 2)。虾夷扇贝、栉孔扇贝群体等位基因数变化范围都为2.00~4.00，平均等位基因数(Na)分别为2.7647和2.3529；平均有效等位基因数(Ne)分别为1.9487和1.6350；观测杂合度(Ho)范围为0.0667~0.9667和0~0.9667，平均为0.6314和0.3333；期望杂合度(He)范围为0.1588~ 0.6576和0.0333~0.6672，平均为0.4569和0.3139；多态信息含量(PIC)范围为0.1500~0.5724和0.0323~ 0.5814，平均为0.3726和0.2597。
|
|
表 2 17个EST-SSR位点在虾夷扇贝、栉孔扇贝各30个个体中的遗传特征 Table 2 Characterization of 17 EST-SSRs in 30 scallops P. yessoensis and C. farreri |
虾夷扇贝和栉孔扇贝群体遗传结构变化和21对EST引物在2个群体内偏离Hardy-Weinberg平衡程度见表 2。从表 2可以看出，从Fis参数看，2个群体中7对引物偏离Hardy-Weinberg平衡，其中，位点comp88965_c0在2个群体中均偏离了Hardy-Weinberg平衡。从F-检验的数据来看(表 3)，配对比较Fst值(Fst < 0.05)。通过17对微卫星位点计算总的遗传分化系数(Fst)为0.2398，表明有23.98%的遗传变异来自于群体之间，76.02%来自个体之间。此外，对Fis值的计算表明，除了comp100440_c1、contig_963940和contig_988858的Fis > 0，其他14个位点Fis < 0，呈现杂合子过剩状态。2个扇贝群体在comp91359_c0、comp100440_c1、comp91909_c0、contig_1217920、contig_1443641、contig_293601、contig_963940、contig_ 915269、contig_763705、contig_988858 10个引物呈现一定程度的杂合子缺失。
|
|
表 3 扇贝2个群体17个微卫星位点的F-检验分析 Table 3 F-statistics for two scallop populations at seventeen microsatellite loci |
EST-SSR标记来源于基因的编码区，具有开发成本低、信息含量丰富、扩增效率高等优点(Wang et al, 2009; 李云峰等, 2011)。本研究从虾夷扇贝的EST文库中分离和筛选了60对多态性位点，多态性比例达40.0%，这与太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)EST-SSR的多态性比例相似(王艳红等, 2007)。而刘博等(2011)研究表明，缢蛏(Sinonovacula constricta)EST-SSR的多态性比例达35.0%，与本研究结果基本一致。由于微卫星侧翼序列在种间或属间有高度保守性，因此，开发通用性位点应用于近源物种成为可能。有学者研究表明，文蛤(Meretrix meretrix)微卫星引物在彩虹明樱蛤(Moerella iridescens)和青蛤(Cyclina sinensis)的引物通用性分别为10.3%和6.9%(李晓英等, 2010)，美洲紫海胆(S.purpuratus)EST-SSR在光棘球海胆(Strongylocentrotus nudus)中的引物通用性为22.50% (李晶晶，2008)。而本研究中，虾夷扇贝EST-SSR在栉孔扇贝中的引物通用性比例达35.00%，这与杨璞等(2008)和李晓英等(2010)的研究结果相一致，但低于栉孔扇贝cSNP引物在虾夷扇贝中52.27%的通用性比例(李晶晶, 2008)，原因可能是SNP标记相比SSR重复序列具有更高的遗传稳定性，且更容易对数据进行自动化和规模化分析，王晓涧等(2012)的研究结果与本研究结果相一致。
3.2 虾夷扇贝EST-SSR位点的开发及群体遗传多样性分析本研究中2个扇贝群体中的Fis大部分为负值，表明这些基因座存在远交或杂交现象，2个种群均处于杂合度过剩状态，这可能是纯合致死或是群体内自然选择引起的(张海滨, 2005; 王宇等, 2012)。Hardy- Weinberg平衡和多态性信息含量是经常用来衡量群体遗传结构变异程度高低的重要参数。本研究发现，有7个位点偏离了平衡，可能是人为因素的干扰，导致种群内基因缺失造成杂合子缺失。其中，6个位点为高度多态性基因座(PIC > 0.5)，占总位点数的35.29%；11个位点为中度多态性基因座(0.25 < PIC < 0.5)，占总数的64.71%。说明本研究中所开发的微卫星位点在扇贝遗传多样性研究中可提供有效的遗传信息，这与齐晓艳等(2013)得出相同的结论。17对EST引物在虾夷扇贝群体中的He和Ho分别为0.6314和0.4569，高于在栉孔扇贝群体中的He(0.3333)和Ho(0.3139)，由此可知，虾夷扇贝群体的遗传多样性略高于栉孔扇贝群体。同时，这组数据高于利用AFLP研究不同地理群体虾夷扇贝遗传多样性的平均杂合度，可能是SSR比AFLP技术更加灵敏导致，刘芳(2006)、薛明等(2006)的研究也说明这一点。
Chang YQ, Chen XX, Ding J, et al. Genetic diversity in five scallop populations of the Japanese scallop(Patinopecten yessoensis). Acta Ecologica Sinica, 2007, 27(3): 1145-1152 [ 常亚青, 陈晓霞, 丁君, 等. 虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)5个群体的遗传多样性. 生态学报, 2007, 27(3): 1145-1152] |
Chang YQ, Zhang CS, Cao XB, et al. Effect of morphometrical traits on weight traits in one-year old Yesso scallop Patinopecten yessoensis. Journal of Dalian Fisheries University, 2008, 23(5): 330-334 [ 常亚青, 张存善, 曹学彬, 等. 1龄虾夷扇贝形态性状对重量性状的影响效果分析. 大连海洋大学学报, 2008, 23(5): 330-334] |
Cheng NN, Yang AG, Liu ZH, et al. Analysis on heterosis of Chlamys farreri×Patinopecten yessoensis by SRAP marker. Marine Sciences, 2009, 33(10): 107-111 [ 程宁宁, 杨爱国, 刘志鸿, 等. 栉孔扇贝(♀)×虾夷扇贝(♂)子一代杂种优势的SRAP分析. 海洋科学, 2009, 33(10): 107-111] |
He B, Yang AG, Wang QY, et al. ISSR analysis of the F1 hybrids of scallop Chlamys farreri♀×Patinopecten yessoensis♂. Journal of Dalian Fisheries University, 2007, 22(4): 273-277 [ 何斌, 杨爱国, 王清印, 等. 栉孔扇贝♀×虾夷扇贝♂单对杂交子一代的ISSR分析. 大连海洋大学学报, 2007, 22(4): 273-277] |
Li JJ. Isolation and characterization of microsatellite markers in two species of bivalve and sea urchin Strongylocentrotus nudus. Doctoral Dissertation of Ocean University of China, 2008[李晶晶. 两种双壳贝类和光棘球海胆微卫星标记的分离及特性研究. 中国海洋大学博士研究生学位论文, 2008]
|
Li L, Xiang JH, Liu X, et al. Construction of AFLP-based genetic linkage map for Zhikong scallop, Chlamys farreri Jones et Preston and mapping of sex-linked markers. Aquaculture, 2005, 245(1-4): 63-73 DOI:10.1016/j.aquaculture.2004.12.015 |
Li XY, Dong ZG, Yan BL et al. A Study on the universality of partial shellfish microsatellites in GenBank in Cyclina sinensis and Moerella iridescens. First International Conference on Cellular, Molecular Biology, Biophysics and Bioengineering, 2010[李晓英, 董志国, 阎斌伦, 等. GenBank中部分贝类微卫星标记在青蛤和彩虹明樱蛤的通用性研究. 第Ⅰ届细胞生物学, 分子生物学, 生物物理与生物工程国际会议, 2010]
|
Li YF, Liu WD, Gao XG, et al. Construction of cDNA libraries from mantle and kidney of Japanese scallop(Mizuhopecten yessoensis) and ESTs analysis. Academic Annual Meeting of China Fisheries Society, 2011, 578-585[李云峰, 刘卫东, 高祥刚, 等. 虾夷扇贝外套膜和肾脏组织cDNA文库构建以及EST的初步分析. 中国水产学会学术年会, 2011, 578-585]
|
Liu B, Shao YQ, Teng SS, et al. Characterization, development and utilization of EST-derived microsatellities in Sinonovacula Constricta. China Zoological Society, Shellfish China Institute of Oceanology and Limnology Society of the Ninth Congress and the Fifteenth National Symposium on Shellfish Abstract Set, 2011[刘博, 邵艳卿, 滕爽爽, 等. 缢蛏EST-SSR分布特征及引物开发利用. 中国动物学会、中国海洋湖沼学会贝类学分会第九次会员代表大会暨第十五次学术讨论会会议摘要集, 2011]
|
Liu F. Genetic diversity of different populations of Patinopecten yessoensis using AFLP and SSR molecular markers. Master's Thesis of Liaoning Normal University, 2006[刘芳. 利用AFLP和SSR分子标记研究不同地理虾夷扇贝群体的遗传多样性. 辽宁师范大学硕士研究生学位论文, 2006]
|
Liu XL, Chang YQ, Xiang JH, et al. Analysis of effects of shell size characters on live weight in Chinese scallop Chlamys farreri. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2002, 33(6): 673-678 [ 刘小林, 常亚青, 相建海, 等. 栉孔扇贝壳尺寸性状对活体重的影响效果分析. 海洋与湖沼, 2002, 33(6): 673-678] |
Lv ZM. Cytogenetic and molecular analysis of hybridization between Chlamys farreri and Patinopecten yessoensis. Doctoral Dissertation of Ocean University of China, 2006[吕振明. 栉孔扇贝和虾夷扇贝杂交过程中的细胞与分子遗传学分析. 中国海洋大学博士研究生学位论文, 2006]
|
Qi XY, Dong YH, Yao HH, et al. Identification of 30 microsatellite markers in Meretrix meretrix and their transferability in Meretrix lamarckii and Meretrix lyrat. Journal of Fisheries of China, 2013, 37(8): 1147-1154 [ 齐晓艳, 董迎辉, 姚韩韩, 等. 文蛤30个微卫星标记的开发及在斧文蛤和帘文蛤中的通用性检测. 水产学报, 2013, 37(8): 1147-1154] |
Sun XJ, Zhang GM, Zhou LQ, et al. Development of genome-wide microsatellite genetic resources by using RAD tag sequencing in Yesso scallop Patinopecten yessoensis. Conservation Genetic Resource, 2016, 8(2): 192-194 |
Teng LL, Yang AG, Zhao F, et al. Analysis on heterosis of Chlamys farreri×Patinopecten yessoensis by RAPD marker. Chinese High Technology Letters, 2005, 15(6): 97-101 [ 滕丽莉, 杨爱国, 赵峰, 等. 栉孔扇贝×虾夷扇贝子一代杂种优势的RAPD分析. 高技术通讯, 2005, 15(6): 97-101] |
Wang RC, Zheng XD. Progress of marine shellfishes culture in China and its prospect. Periodical of Ocean University of China(Natural Science), 2004, 34(5): 775-780 [ 王如才, 郑小东. 我国海产贝类养殖进展及发展前景. 中国海洋大学学报(自然科学版), 2004, 34(5): 775-780] |
Wang XL, Song B, Qiu XM, et al. Development of EST-SSRs in scallop (Patinopecten yessoensis) from sequence database. Conservation Genetics, 2009, 10(4): 1129-1131 |
Wang XJ. Development of cSNP markers in Zhikong scallop (Chlamys farreri) and their cross-species applications. Master's Thesis of Ocean University of China, 2012[王晓涧. 栉孔扇贝(Chlamys farreri)cSNP标记的开发及其种间通用性研究. 中国海洋大学硕士研究生学位论文, 2012]
|
Wang Y, Li L, Zhang SD, et al. Microsatellite segregation distortion analysis of the out bred, inbred and selfed families of the Bay scallop(Argopecten irradians). Marine Sciences, 2012, 36(8): 109-115 [ 王宇, 李莉, 张守都, 等. 海湾扇贝杂交、近交和自交家系的微卫星标记偏分离分析. 海洋科学, 2012, 36(8): 109-115] |
Wang YH, Ren R, Yu ZN. Exploitation of EST-SSR markers for Crassostrea gigas. China Zoological Society, Shellfish China Institute of Oceanology and Limnology society of the Eighth Congress and the Thirteenth National Symposium on Shellfish Abstract Set, 2007[王艳红, 任睿, 喻子牛. 太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)的EST-SSR标记开发. 中国动物学会、中国海洋湖沼学会贝类学分会第八次会员代表大会暨第十三次全国贝类学术讨论会论文摘要集, 2007]
|
Xue M, Du XD, Huang RL, et al. Biochemicalgenetic variation within three wild populations of Meretrix meretrix. Marine Science Bulletin, 2006, 25(1): 38-43 [ 薛明, 杜晓东, 黄荣莲, 等. 文蛤三个野生种群的生化遗传变异. 海洋通报, 2006, 25(1): 38-43] |
Yang AG, Wang QY, Liu ZH, et al. The hybrid between the scallops Chlamys farreri and Patinopecten yessoensis and the inheritance characteristics of its first filial generation. Marine Fisheries Research, 2004, 25(5): 1-5 [ 杨爱国, 王清印, 刘志鸿, 等. 栉孔扇贝与虾夷扇贝杂交及子一代的遗传性状. 渔业科学进展, 2004, 25(5): 1-5] |
Yang P, Yang AG, Liu ZH, et al. The selection of universal microsatellite primers between Patinopecten yessoensis and Chlamys farreri and its application in hybrid identification. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2008, 36(19): 8287-8289 [ 杨璞, 杨爱国, 刘志鸿, 等. 栉孔扇贝和虾夷扇贝通用微卫星引物的筛选及其在杂种鉴定中的应用. 安徽农业科学, 2008, 36(19): 8287-8289 DOI:10.3969/j.issn.0517-6611.2008.19.037] |
Yang PM, Yang AG, Liu ZH, et al. Cryopreservation of Patinopecten yessoensis sperm and its application to hybridization. Journal of Shanghai Ocean University, 2007, 16(4): 351-356 [ 杨培民, 杨爱国, 刘志鸿, 等. 虾夷扇贝精子的冷冻保存及其杂交试验应用研究. 上海海洋大学学报, 2007, 16(4): 351-356] |
Yu T, Yang AG, Zhou LQ, et al. Genetic variation of Chlamys farreri, Patinopecten yessoensis and their hybrids. Journal of Fishery Sciences of China, 2011, 18(3): 574-580 [ 于涛, 杨爱国, 周丽青, 等. 栉孔扇贝、虾夷扇贝及其杂交子代的群体遗传多样性分析. 中国水产科学, 2011, 18(3): 574-580] |
Zhang GM, Sun XJ, Zhou LQ, et al. Isolation and characterization of 44 microsatellite markers in Yesso scallop Patinopecten yessoensis by transcriptome mining. Conservation Genetic Resource, 2016, 8(2): 186-188 |
Zhang HB. Inbreeding effect and genetic improvement of Bay scallop, Argopecten irradians (Lamarck). Master's Thesis of University of Chinese Academy of Sciences (Institute of Oceanology), 2005[张海滨. 海湾扇贝近交生物学效应和遗传改良研究. 中国科学院大学研究生院(海洋研究所)硕士研究生学位论文, 2005]
|
Zhang MM, Zhao W. Causes of death of Patinopecten yessoensis in China and control measures. China Fisheries, 2008(2): 65-66 [ 张明明, 赵文. 我国虾夷扇贝死亡原因的探讨及控制对策. 中国水产, 2008(2): 65-66] |