2. 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 哈尔滨 150070;
3. 厦门大学海洋与地球学院 厦门 361102
2. Heilongjiang River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Harbin 150070;
3. College of Ocean and Earth Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102
抗菌肽(Antimicrobial peptide, AMP)又称为宿主防御肽(Host defense peptide, HDP)，是非特异性免疫系统的关键组分之一，在生物体对抗病原微生物感染中发挥着重要的分子屏障作用。Cathelicidin是已知最大的抗菌肽家族之一，在脊椎动物中广泛分布，包括哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物和鱼类中都有报道(Maier et al, 2008; Hao et al, 2012; Cheng et al, 2015)，其中，哺乳动物Cathelicidin的结构和功能研究较为深入(Hilchie et al, 2013; 王晨等, 2017)。
第1个硬骨鱼类Cathelicidin基因Cath1由Chang等(2005)在虹鳟(Oncorhynchus mykiss)中发现，此后, 在大西洋鲑(Salmo salar)等多种鲑科(Salmonidae)鱼类(D'Este et al, 2016)、大西洋鳕(Gadus morhua) (Shewring et al, 2011)、香鱼(Plecoglossus altivelis) (Nsrelden et al, 2017)、日本鳗鲡(Anguilla japonica) (张东玲等, 2015)等物种中陆续发现，并因其具广谱抗菌能力而吸引了广泛的注意，但另一些已完成的硬骨鱼类基因组图谱中却无法筛查到该家族基因(Shewring et al, 2011)，如斑马鱼(Danio rerio)、青鳉(Oryzias latipes)、河豚(Takifugu rubripes)等。因此，Cathelicidin可能为部分硬骨鱼类群所特有，其基因功能和表达调控的研究将有助于加深对鱼类，特别是对鲑科鱼类非特异性免疫机制的理解，并促进鱼类抗病育种研究进展。
Cathelicidin成熟肽为带有正电荷的短肽，主要通过插入并破坏细胞膜结构杀灭病原微生物。体外实验表明，虹鳟4个Cath基因的各种可变剪切表达产物均能够抑制多种革兰氏阳性和阴性菌的生长(Zhang et al, 2015)，Cath2基因产物还具有一定的抗真菌效果，能够延缓水霉(Saprolegnia parasitica)孢子形成(de Bruijn et al, 2012)。而在大西洋鲑的研究中则发现，Cath基因表达呈现出广泛的免疫应答特征，不仅能够被细菌所诱导，也能够被不具有细胞结构的病毒模拟物所诱导(Shewring et al, 2011; Broekman et al, 2013)，其转录调控机制尚不明确。本研究以虹鳟Cath2基因为例，通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real Time PCR, qRT-PCR)实验验证了该基因的免疫诱导转录模式，并开展了启动子克隆与功能分析，对Cath2基因转录调控机制进行了初步探索。
1 材料与方法 1.1 实验材料无特定病原虹鳟5尾，采自中国水产科学研究院黑龙江水产研究所渤海冷水性鱼试验站；自然感染鳗弧菌(Vibrio anguillarum)发病的虹鳟5尾，采自山西朔州；自然感染传染性造血器官坏死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV)发病的虹鳟5尾，采自北京怀柔。草鱼肾组织细胞系(Ctenopharyngodon idellus Kidney, CIK)保藏于国家水产种质资源平台。
1.2 基因表达分析使用Trizol试剂(Life technologies)分别提取鳃、头肾组织总RNA，DNase I(Sigma-Aldrich)处理以避免基因组DNA污染。使用ReverTra Ace-α-RT-PCR cDNA第一链合成试剂盒(TOYOBO)进行mRNA反转录。使用SYBR Green RT-PCR试剂盒(TOYOBO)在Applied Biosystems® 7500 Real-Time PCR系统(Life technologies)上进行qRT-PCR实验，分析各样本内Cath2基因(NCBI：NM_001124463.1)的表达量差异。使用β-actin(NCBI：NM_001124235.1)作为内参基因，2–ΔΔCt法(Schmittgen et al, 2008)计算Cath2基因相对表达量。Cath2定量引物Cath2-qPCR-F：CAACACCCTCAACACTGACCG；Cath2-qPCR-R：GAATCTTTTCTACCCATCTTAGG；β-actin定量引物actin-F：ACAGGTCATCACCATCGGCA；actin-R：GGTCTCGTGGATACCGCAAG。
1.3 启动子测序分析以虹鳟基因组图谱序列(Berthelot et al, 2014)为参考，通过基因组步移法测定Cath2基因序列，使用CLC Genomics Workbench 9.5.4数据分析平台拼接，并结合在线分析软件Neural Network Promoter Prediction (Reese, 2001)(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)，JASPAR2016 (Mathelier et al, 2016)(http://jaspar.genereg.net/)，AliBaba2.1(http://gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html)，PROMO (Messeguer et al, 2002)(http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3)，开展启动子位置和转录因子结合位点分析。
1.4 载体构建以虹鳟基因组DNA为模板，使用Cath2启动子引物Cath2-promoter-F：TCTCACGCGTGGCAGACAGGCATGGGAATA；Cath2-promoter-R：TCTCAAGCTTCTGACCTCTGACCAGCAAGC进行PCR扩增。将纯化后的扩增产物进行MluⅠ、Hind Ⅲ双酶切处理，获取带有黏性末端的启动子片段。分别将pGL3- EGFP和pGL3-basic载体(Promega)进行MluⅠ、Hind Ⅲ双酶切处理，获取带有黏性末端的载体质粒。将纯化后的启动子和载体质粒按照物质的量比例3:1混合，T4 DNA连接酶16℃处理12 h，转化E.coli DH5α感受态细菌，涂布含有氨苄青霉素的平板，37℃倒置培养12 h。挑取单克隆，碱裂解法提取质粒，测序鉴定，获得成功插入虹鳟Cath2启动子完整序列的pGL3- EGFP-Cath2和pGL3-Cath2启动子载体。按照同样步骤构建插入核因子κB (Nuclear factor kappa B，NFκB)编码序列(NCBI：XM_019064772.1)的pEGFP-NFκB表达载体，酶切位点为EcoRⅠ和BamHⅠ。
1.5 细胞转染和免疫刺激使用含5%胎牛血清的杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM)，初始接种浓度为每孔2×105个细胞，5% CO2培养箱25℃培养12 h，待单层细胞贴壁超过60%后，用pH为7.4的PBS缓冲液洗涤细胞3次，每孔加入无血清DMEM培养基900 μl，1 h后进行转染。
转染实验使用Lipofectamine®2000(Life technologies)体系进行脂质体转染，分为7组，每组6孔，各孔分别加入(1)2000 ng pGL3-EGFP空载体+6 μl Lipofectamine® 2000转染试剂+994 μl无血清DMEM培养基；(2)、(3)、(4)2000 ng pGL3-EGFP-Cath2启动子载体+6 μl Lipofectamine® 2000转染试剂+994 μl无血清DMEM培养基；(5)1200 ng pEGFP空载体+600 ng pGL3-basic载体+60 ng PRL-CMV海肾荧光素酶内参载体+6 μl Lipofectamine® 2000转染试剂+994 μl无血清DMEM培养基；(6)1200 ng pEGFP空载体+600 ng pGL3-Cath2启动子载体+60 ng PRL-CMV海肾荧光素酶内参载体+6 μl Lipofectamine® 2000转染试剂+998 μl无血清DMEM培养基；(7)1200 ng pEGFP- NFκB表达载体+600 ng pGL3-Cath2启动子载体+60 ng PRL-CMV海肾荧光素酶内参载体+6 μl Lipofectamine® 2000转染试剂+994 μl无血清DMEM培养基。轻轻摇动平皿混匀，5% CO2培养箱25℃培养。
转染后6 h，换半液，换液使用含有5%胎牛血清的DMEM培养基，继续5% CO2培养箱25℃培养。转染后24 h，在荧光显微镜下观察各组细胞形态和绿色荧光蛋白荧光信号，计数并计算转染效率，转染效率=表达绿色荧光蛋白的细胞数/活细胞总数。向(3)组各孔中加入1 μg/μl的细菌脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)10 μl，向(4)组各孔中加入10 μg/μl的聚肌胞苷酸(Polyinosinic polycytidylic acid，Poly I:C)10 μl，轻轻混匀，继续5% CO2培养箱25℃培养6 h。在荧光显微镜下观察(1)~(4)组细胞形态和绿色荧光蛋白荧光信号。
1.6 双荧光素酶报告基因检测使用Dual-Luciferase® Reporter Assay System双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega)，按说明书完成检测步骤。将(5)~(7)组各孔内细胞充分裂解后，分别测定萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活力。使用海肾荧光素酶活力值作为内参，使萤火虫荧光素酶活力值正态化，荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活力/海肾荧光素酶活力。再以只转染对照载体和内参载体的第(5)组数值为对照，将该组荧光素酶活性归一化，荧光素酶相对活性=实验组荧光素酶活性/对照组荧光素酶活性(Pannier et al, 2007)。
2 结果 2.1 虹鳟Cath2基因转录模式分析通过qRT-PCR对虹鳟Cath2基因转录特征进行了研究。结果表明，该基因转录呈现出显著的免疫应答特征，细菌和病毒感染均能增强该基因转录。Cath2基因在健康个体的鳃、头肾组织内均有表达，其中，头肾表达量较高；在鳗弧菌感染个体中，Cath2基因表达量显著上调，上升幅度达到10.7倍(鳃)和13.5倍(头肾)；在IHNV感染个体中，Cath2基因表达量也有明显上调，但上升幅度小于鳗弧菌感染个体(图 1)，分别为6.98倍(鳃)和6.84倍(头肾)。
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图 1 虹鳟Cath2基因在感染条件下mRNA表达量变化
Figure 1 Relative mRNA levels of rainbow trout Cath2 in infected individuals
1:健康个体；2：鳗弧菌感染个体；3：IHNV感染个体 图中实验组相对表达量以健康对照组鳃组织基因表达量为基准计算，误差线为相对标准差(n=5)，星号为t检验显著性水平(**, P < 0.01)，下同 1: Healthy control; 2: V. anguillarum infected; 3: IHNV infected The relative expression level in each group was calculated by comparing with the value in gill of healthy control. Error bars represented standard error of the mean (n=5). Statistical differences relative to unaffected tissues were calculated by using Student's t test (**, P < 0.01), the same as below |
将虹鳟Cath2基因(NCBI：NM_001124463.1)序列在虹鳟基因组图谱中进行Blat比对，该基因被定位于ChrUn_8重叠群，使用该区段序列为参考，通过基因组步移法对Cath2基因上游调控序列进行Sanger测序和拼接，获得起始密码子前1000 bp序列。对该区域进行启动子功能分析，推测基因转录起始位点自–7 bp开始，在–30 bp位置有TATA盒，在–69 bp位置有CAAT盒，具有典型的真核生物启动子结构。
预测该基因核心启动子区为–1~–351 bp区间，为更完整地保留特征性转录调控区域，设计PCR引物扩增–927 bp~76 bp间的1003 bp序列，将其克隆进入启动子载体用于转录活性分析实验。
在虹鳟Cath2基因–1000~312 bp区间范围内，密集存在着多个顺式作用元件(图 2)，其中，既包括免疫应答转录因子结合位点，如核因子κB(Nuclear factor kappa B, NFκB)、Ccaat增强子结合蛋白(Ccaat/Enhancer Binding Protein，CEBP)、cAMP应答元件结合蛋白(cAMP-responsive element binding proteins，CREBP)、巨噬细胞活化因子相关转录因子(Macrophage activating factor related factor，MAFF)、干扰素调节因子(Interferon regulatory factors, IRF)等，也包括高频出现的干扰素增强子GAAA基序以及数个环境压力应答元件，如低氧应答元件(Hypoxia response element, HRE)。
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图 2 虹鳟Cath2基因上游调控序列功能预测示意 Figure 2 Functional annotation by bioinformatics analysis for upstream sequence of rainbow trout Cath2 gene |
对预测得到的虹鳟Cath2基因启动子区域进行PCR扩增，将该启动子连接进入pGL3-EGFP质粒载体，使虹鳟Cath2启动子驱动绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)基因表达，构建成功pGL3- EGFP-Cath2质粒载体。
使用pGL3-EGFP-Cath2质粒转染CIK细胞，转染后细胞生长状况良好(图 3A)，荧光显微镜下可见GFP绿色荧光(图 3B)，表明转入的DNA片段能够成功驱动GFP基因表达，具有启动子活性，转染效率为(34.7±4.6)%。向细胞培养液中加入免疫刺激剂LPS (图 3C、图 3D)或Poly I:C(图 3E、图 3F)，分别模拟细菌感染和病毒感染，细胞的荧光强度显著强于无免疫刺激对照组，表明启动子活性在免疫激活后显著增强，为免疫诱导型启动子。
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图 3 转染pGL3-EGFP-Cath2质粒的CIK细胞 Figure 3 Microscope images of CIK cells transfected by pGL3-EGFP-Cath2 plasmid A：无免疫刺激，明场显微镜照片；B：无免疫刺激，荧光显微镜照片；C：LPS模拟细菌感染，明场显微镜照片；D：LPS模拟细菌感染，荧光显微镜照片；E：Poly I:C模拟病毒感染，明场显微镜照片；F：Poly I:C模拟病毒感染，荧光显微镜照片 A: Control cells without immune stimulus, by bright field microscope; B: Control cells without immune stimulus, by fluorescence microscope; C: Immune stimulated cells with LPS, by bright field microscope; D: Immune stimulated cells with LPS, by fluorescence microscope; E: Immune stimulated cells with Poly I:C, by bright field microscope; F: Immune stimulated cells with Poly I:C, by fluorescence microscope |
将虹鳟Cath2基因启动子序列连接进入pGL3- basic质粒载体，使虹鳟Cath2启动子驱动萤火虫荧光素酶基因表达，构建成功pGL3-Cath2质粒载体；将虹鳟NFκB基因cDNA序列连接进入pEGFP载体，使虹鳟NFκB基因与GFP基因共表达，构建成功pEGFP-NFκB质粒载体。
使用pGL3-Cath2启动子载体、pEGFP-NFκB表达载体，与PRL-CMV海肾荧光素酶内参载体质粒共转染CIK细胞，转染效率为(28.9 ± 3.5)%。定量测定启动子活性，结果见图 4。从图 4可以看出，转染pGL3- Cath2实验组测定的萤光素酶活性比空载体对照组显著增强，表明Cath2基因启动子在该体系中表现出明显的启动子活性；pGL3-Cath2和pEGFP-NFκB共转染实验组测定的萤光素酶活性显著高于单独转染pGL3-Cath2实验组，前者约为后者的4.39倍，表明外源NFκB转录因子的增强性表达能够提高启动子活性，证实了NFκB为促进Cath2基因启动子表达的反式作用因子。
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图 4 双荧光素酶报告基因实验测定虹鳟Cath2基因启动子活性 Figure 4 Promoter activity of rainbow trout Cath2 gene, determined by dual luciferase reporter gene assay 使用pGL3-Cath2启动子载体质粒、pEGFP-NFκB转录因子表达载体质粒单独或共同转染CIK细胞，所有细胞中均有PRL-CMV海肾荧光素酶内参质粒共转染，使用未负载启动子的pGL3-basic空质粒和未负载转录因子的pEGFP空质粒作为对照，使各组转染DNA总量均等 CIK cells were transfected by pGL3-Cath2 promoter vector plasmid and pEGFP-NFκB transcription factors expression vector plasmid, independently or simultaneously. All cells were co-transfected by PRL-CMV renilla luciferase plasmids as internal control. Blank vectors, pGL3-basic and pEGFP plasmids were also used for co-transfection, to keep equal quantity of transfected DNA among different groups |
多项不同来源的转录组数据分析表明，虹鳟Cath2基因转录水平不仅在细菌感染或LPS模拟刺激后大幅度上升(MacKenzie et al, 2008; Langevin et al, 2012; Bridle et al, 2012)，也在病毒或模拟物刺激后有不同程度的上升，如IHNV BLK94和WA毒株(Purcell et al, 2011)，IHNV灭活病毒(MacKenzie et al, 2008)，病毒性出血败血症病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)(Aquilino et al, 2014)以及病毒双链RNA模拟物Poly I:C(Pacitti et al, 2016)诱导后的表达谱数据中，Cath2基因均呈现上调表达。
为在实验层面确认以上生物信息学分析数据，本研究通过qRT-PCR检测，证实自然感染鳗弧菌或IHNV的虹鳟鳃、头肾组织中，Cath2基因转录水平都有显著升高(图 1)，进一步的体外转录研究结果(图 3)显示，细菌模拟物LPS和病毒模拟物Poly I:C都能够诱导Cath2基因启动子表达增强。Cath2基因表达能够被细菌感染所诱导，与其抗菌生理功能相吻合，而该基因同样参与病毒感染免疫应答，该基因可能不局限于通常所知的生物学功能，即破坏病原生物膜结构，还可能以其他的方式发挥作用，以抵御不具有细胞结构的病毒感染。
D’Este等(2016)对鲑科鱼类Cathelicidin成熟多肽结构进行了分析，并推测其富含丝氨酸和甘氨酸的分子，可通过刺激吞噬细胞的吞噬功能来发挥免疫调节作用，而非直接杀伤病原体。本研究从转录特征方面支持了Cathelicidin的非直接杀菌功能，这种受病毒诱导表达的转录模式在鱼类抗菌肽中并非个例，在大西洋鳕中也曾有报道，包括Hepcidin (Solstad et al, 2008)和Cathelicidin(Shewring et al, 2011; Broekman et al, 2013)，其抗病毒机制仍需进一步研究验证。
3.2 虹鳟Cath2基因转录调控分析为解析虹鳟Cath2基因转录调控机制，本研究对基因上游调控序列进行了测序和分析，成功获得了长度为351 bp的核心启动子序列。序列相似性比对结果表明，虹鳟Cath2基因起始密码子前的上游调控序列与人(Homo sapiens)、大西洋鳕Cath基因以及虹鳟Cath1基因对应序列的碱基一致性较低，但具有一些共同的结构特征，各Cath基因启动子均具有真核生物启动子典型的TATA盒和CAAT盒结构，在基因上游直至第一内含子区域，密集存在多个免疫相关转录因子结合位点(Chang et al, 2005; Chakraborty et al, 2009; Shewring et al, 2011; Dhawan et al, 2015)。
虹鳟Cath2基因上游调控区共有3个NFκB预测结合位点，其中，2个都在核心启动子正链上，分别位于–78 bp和–180 bp位置，靠近CAAT盒。对已报道的鱼类其他Cath基因序列进行了NFκB结合位点预测，包括虹鳟Cath1、大西洋鳕Cath研究发现，NFκB结合特征性序列普遍存在于Cath基因上游，但此前尚无NFκB调控Cath基因转录的研究结果。本研究通过双荧光素酶报告基因研究，将虹鳟Cath2启动子连入pGL3质粒载体，转染草鱼CIK细胞系，萤火虫荧光素酶基因能够在该启动子驱动下表达，当与NFκB表达载体共转染时，萤火虫荧光素酶活性显著增强，表明NFκB是增强Cath2基因转录的反式作用因子。
NFκB是经典的炎症和免疫调控核转录因子，该通路既能被细胞表面病原识别受体直接激活，也能被多种诱导磷酸激酶活化的胞内信号所激活，在接受免疫刺激后，数分钟即可迅速活化，参与包括细菌和病毒在内的多种病原感染应答(Ghosh et al, 1998; Varejckova et al, 2017)。虹鳟Cath2基因转录受NFκB调控，因此，能够在不同病原感染个体中迅速大幅上调表达，呈现出免疫诱导型转录特征。
3.3 免疫诱导型启动子的应用启动子常根据作用方式及功能分为3类：组成型启动子，在全部或多数组织中保持持续的转录活性；特异型启动子，在特定的组织或发育时期具有转录活性；诱导型启动子，受特定物理或化学信号调控(李圣彦等, 2014)。本研究中获得的虹鳟Cath2启动子即为免疫诱导型启动子，在基因工程抗病育种中具有较高的应用价值。
利用基因工程技术，将免疫基因，如免疫球蛋白或抗菌肽等转入养殖鱼类体内，培育疾病抗性品种，是防控养殖病害的有效途径之一(叶鼎等, 2014)。启动子是各种转基因技术方案中必备的转基因元件，转基因载体中负载的外源目的基因必须置于有效的启动子介导之下，才能够在宿主细胞内成功转录表达。
目前，已报道的用作转基因元件的鱼类启动子多为组成型，如鲤(Cyprinus carpio)β-肌动蛋白、美洲大绵鳚(Zoarces americanus)抗冻蛋白启动子等(叶星等, 2011; Ledford, 2015; 汪亚平等, 2016; 胡炜等, 2016)。但对抗病转基因鱼而言，使用组成型启动子，将使未接触病原的鱼体内长期大量表达外源免疫基因，不仅没有必要，还可能因消耗能量而造成生长负担。如果使用免疫诱导型启动子，则可介导外源基因仅在鱼体遭受免疫胁迫时出现高表达，合理利用能量并抵御病害。
目前，关于免疫诱导型启动子的报道仍较少(杜小溪等, 2013; Fu et al, 2016)，本研究即提供了一种具有快速免疫响应特征的鱼类启动子。虹鳟Cath2基因的表达模式较好地符合了抗病转基因鱼对外源免疫基因转录特征的需求，将该基因启动子用作抗病转基因载体构建的启动子元件，可能驱动外源免疫基因保持类似的表达模式。
鳃和头肾组织都在鱼类免疫防御中具有重要地位。鳃是鱼类的呼吸器官，比表面积大，表面密布毛细血管，随时与外界水流接触，因而易受环境中的病原菌侵袭。头肾是硬骨鱼类特有的淋巴器官，在鱼体内发挥重要的免疫功能。将虹鳟Cath2基因启动子用作转基因元件，可能使转基因鱼在受到免疫刺激时，鳃和头肾大量表达转入的免疫基因，及时抵御外界病原感染，同时，避免在不必要的组织和健康状态下过多表达外源基因，在鱼类基因工程抗病育种领域具有广阔的应用前景。
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