环糊精(CD)是由环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)作用于直链淀粉而产生的环状低聚糖(Valle et al, 2004)，常见的有α-、β-和γ-环糊精。环糊精可以包埋形状各异和适当大小的疏水性客体分子，进而改变它们的理化性质(Biwer et al, 2002)。环糊精的化学性质均较稳定，α-环糊精在体内的代谢作用最慢且无毒(Arima et al, 2011)。环糊精在医药(朱征等, 2016)，化妆品(李姝静等, 2016)、环保领域(张洪伟, 2014)等有良好的应用前景，而且作为一种新型的膳食纤维逐渐走入人们的视野(Artiss et al, 2006)。

大多数CGTase生成的是多种环糊精的混合体。Bharat等(2001)利用来自肺炎克雷伯菌AS-22分泌的CGTase酶生产α-环糊精。Duan等(2013)以α-CGTase和异淀粉酶作用于马铃薯淀粉，CD的总产量达到84.6%，比单独使用α-CGTase的转化率提高了31.2%。目前，环糊精的应用依然受到环糊精产量的制约，继续研究提高环糊精产率的方法具有重要意义。

本研究对前期筛选到的来自黄海海域的海洋芽孢杆菌Y112的α-CGTase生产α-环糊精的条件进行优化，旨在提高α-环糊精的产量，以便应用于食品药品等领域。

1 材料与方法 1.1 酶的来源

α-CGTase酶：由菌株海洋芽孢杆菌Y112(与Bacillus agaradhaerens DSM8721的同源性为100%，本实验室分离自中国黄海水域)发酵提取制备获得。

1.2 主要试剂

α-环糊精标准品(Aladdin, HPLC级)；可溶性淀粉，玉米淀粉，马铃薯淀粉，麦芽糊精(索莱宝)；水溶性淀粉-底物(Aladdin, 药用级)；甲基橙(Aladdin, AR)；其他化学试剂，国药集团化学试剂有限公司。

1.3 α-CGTase酶活力的测定

实验组：取4 g水溶性淀粉，用配制好的pH=8.5的0.2 mol/L的NaOH-甘氨酸缓冲液100 ml (现用现配)溶解并进行加热糊化作为底物，待其冷却后取0.9 ml液体在试管中，放入50℃水浴锅中预热5 min，然后加入适当稀释倍数的粗酶液0.1 ml混合均匀，50℃水浴反应4 min，取出后迅速加入1 ml盐酸溶液(1 mol/L)终止反应，最后加入4 ml稀释4倍的甲基橙溶液，混匀，室温静置20 min。

对照组：取底物0.9 ml于试管中，预热5 min。随实验组放入水浴反应4 min后，加入1 ml盐酸溶液混合均匀后，再加入与实验组相同的粗酶液，其他处理与实验组相同。用分光光度计在507 nm测定实验组与对照组的吸光度。1个单位酶活定义为上述条件下生成1 μg α-环糊精需要的酶量(张晓磊等, 2015)。

1.4 绘制标准曲线

取一支试管，分别加入1 ml梯度浓度的α-环糊精标准溶液和1 ml 1 mol/L的盐酸，再加入4 ml稀释4倍的甲基橙溶液于试管中，摇匀，室温静置20 min，在507 nm处测吸光度。其中，空白不含α-环糊精，其余操作相同。以环糊精浓度为横坐标，吸光度差值为纵坐标，绘制标准曲线。吸光度差值(DOD)=空白溶液吸光度-样品吸光度。

1.5 α-环糊精含量测定

将待测溶液按照1.4的步骤进行测定，根据标准曲线计算得到α-环糊精的浓度，然后得出α-环糊精的含量值。

1.6 单因素法优化α-CGTase作用淀粉产α-环糊精条件 1.6.1 底物种类对α-CD产量的影响

取5%浓度的玉米淀粉、马铃薯淀粉、麦芽糊精和可溶性淀粉溶液各100 ml加热溶解，待冷却后，温度30℃，pH为9，加酶量200 U/g淀粉，200 r/min，6 h取出煮沸灭活测α-CD产量。每个梯度做3次，取平均值。

1.6.2 底物浓度对α-CD产量的影响

分别取3%、5%、8%、10%、15%、20%浓度的马铃薯淀粉溶液各100 ml加热溶解，待冷却后，温度30℃，pH为9，加酶量200 U/g淀粉，200 r/min，6 h取出煮沸灭活测α-CD产量。每个梯度做3次，取平均值。

1.6.3 酶添加量对α-CD产量的影响

5%浓度的马铃薯淀粉溶液100 ml，温度为30℃，pH为9，分别加入100、150、200、250、300 U/g马铃薯淀粉的α-CGTase进行反应，200 r/min摇床反应6 h后灭活测α-CD产量。每个梯度做3次，取平均值。

1.6.4 温度对α-CD产量的影响

5%浓度的马铃薯淀粉溶液100 ml，pH为9，加酶量200 U/g马铃薯淀粉，分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃反应，200 r/min摇床反应6 h后煮沸灭活测定α-CD产量。每个梯度做3次，取平均值。

1.6.5 反应时间对α-CD产量的影响

5%浓度的马铃薯淀粉溶液100 ml加热溶解，待冷却后，温度为30℃，pH为9，加酶量为200 U/g马铃薯淀粉，200 r/min，反应分别进行1、2、4、6、8、10、12、24 h后煮沸灭活测定α-CD产量。每个梯度做3次，取平均值。

1.6.6 pH对α-CD产量的影响

5%浓度的马铃薯淀粉溶液100 ml，温度30℃，加酶量200 U/g马铃薯淀粉，分别在pH为6、7、8、9、10条件下反应，200 r/min摇床反应6 h后煮沸灭活，测定α-CD产量。每个梯度做3次，取平均值。

1.6.7 Mg²⁺浓度对α-CD产量的影响

5%浓度的马铃薯淀粉溶液100 ml，pH值为9，温度为30℃，加酶量为200 U/g马铃薯淀粉，分别加入终浓度为0~60 mmol/L的镁离子，200 r/min摇床反应6 h后灭酶测定α-CD产量。每个梯度做3次，取平均值。

1.7 响应面法优化产α-环糊精条件 1.7.1 Plackett-Burman实验

根据单因素实验，选取底物浓度、加酶量、温度、时间和pH共5个因素，通过PB实验为响应面实验筛选出酶催化淀粉生成α-环糊精的主要影响因子。

1.7.2 中心组合确定最佳条件

根据PB实验结果用Design-Expert 8.06软件设计BBD实验并进行分析(表 2)(董延娟等, 2016)。

2 结果与分析 2.1 α-环糊精的标准曲线

α-环糊精的标准曲线见图 1，方程为y=0.0373x (R²=0.9994)。

2.2 单因素实验设计与分析 2.2.1 底物种类对α-环糊精生产的影响

底物种类对α-环糊精转化率的影响如图 2所示。由图 2可以看出，可溶性淀粉的环糊精转化率最高，麦芽糊精的转化率最低。马铃薯淀粉的转化率略低于可溶性淀粉。

环糊精可以由环糊精酶作用于不同种类的淀粉、糊精、直链淀粉和支链淀粉产生，得到高转化率环糊精的底物是淀粉。而淀粉是由直链淀粉和支链淀粉组成，由于直链淀粉与脂质容易形成复合物，不易酶活性的作用；支链淀粉有更多的还原端，与直链淀粉相比再生缓慢，以支链淀粉为底物的环糊精产量高于直链淀粉(Pishtiyski et al, 2006)。马铃薯淀粉的价格比较低，使得生产环糊精的成本降低，因此，本研究中马铃薯淀粉是适合生产环糊精的底物。

2.2.2 底物浓度对α-环糊精生产的影响

底物浓度对环糊精转化率的影响如图 3所示。由图 3可以看出，当淀粉浓度为5%时，α-环糊精的转化率为25.9%，当淀粉浓度升到10%时，α-环糊精的转化率和5%时相比下降50%，二者相差较大，继续增大底物浓度，转化率降低越明显。可能是因为马铃薯淀粉浓度过大，加热糊化后粘性过大，不利于酶与底物的反应过程。相反，底物浓度越小，环糊精转化率越高，但成本升高，总的产量过低，综合考虑，选用5%的马铃薯淀粉作为生产α-环糊精的淀粉浓度。

2.2.3 加酶量对α-环糊精生产的影响

图 4显示，在一定范围内，α-环糊精的转化率随着加酶量的增加呈现先上升后下降的趋势。当加酶量为200 U/g时，转化率达到最高。

环化反应的逆反应是耦合反应，加酶量的增加，使酶的歧化、耦合反应能力均增强，增加了体系中小分子糖的存在，促进耦合反应的进行，使得α-环糊精向β-环糊精转化，不利于α-环糊精的生产。控制酶的添加量可以有效提高α-环糊精的产量，减少酶的用量也可以降低成本。通过单因素实验，选择200 U/g的加酶量。

2.2.4 温度对α-环糊精生产的影响

从图 5可以看出，不同的温度对转化率的影响比较明显，转化率在30℃时最高，之后随着温度的继续升高，α-环糊精的转化率降低幅度增大。该酶的最适反应温度是55℃，在40℃以下稳定，高于50℃对酶活影响较大，与实验结果基本保持一致，在不失活的状态下，30℃时最有利于α-环糊精的生产。

2.2.5 作用时间对α-环糊精生产的影响

由图 6可知，α-环糊精转化率达到最高点的时间为6 h，继续增加反应时间，转化率并没有增高，反而有明显的降低趋势。随着反应时间的加长，酶的其他作用增强，造成α-环糊精的分解。另一方面，反应时间的减少，更有利于节约成本。

2.2.6 pH对α-环糊精生产的影响

通过考察不同pH下α-环糊精的转化率，结果显示(图 7)，初始pH为9时，转化率最高，此时即为α-环糊精转化的最适反应pH。不同的CGT酶反应的体系的pH值是不同的，大多数是弱碱性或中性介质(Jung et al, 2007)。有研究表明，底物种类-缓冲液类型对环糊精有重要的作用(Mau et al, 2007)，在此未对缓冲液的类型是否对转化率有一定的影响做进一步的探讨。

2.2.7 Mg²⁺浓度对α-环糊精生产的影响

之前的实验中，Mg²⁺对酶活性有一定的促进作用，本实验考察反应过程中添加量对反应的影响。由图 8可知，由于生产α-环糊精的时间比较短，在一定范围内Mg²⁺浓度的增减对环糊精的转化率并没有很大的影响，因此，后期实验中不考率金属离子的添加量。

2.3 响应面实验设计与分析 2.3.1 PB实验结果

用Design-Expert 8.0.6软件对实验结果进行处理，得到PB实验设计分析如表 4，底物浓度、温度和pH的P值小于0.055为显著，因此，确定三者为酶转化淀粉生产α-环糊精的主要影响因子。

2.3.2 中心组合实验设计与结果

利用Design- Expert 8.06软件对实验结果进行多元回归拟合(表 6)，发现该模型是显著的，F值为506.71表示仅有0.01%的可能是由噪音引起的，其中A、B、C、AC、A²、B²、C²的P值均小于0.05，是显著模型项，失拟F值为0.96(P=0.4921)表示该模型的失拟不显著，因此该模型是合适的。方程的R²=0.9985，说明α-环糊精转化率的实测值与预测值的拟合度较好，该模型能较好解释环糊精产率的变化。F值越大，表明影响因子对实验指标的影响越大。由方差分析表可得出，FA=369.36，FC=303.67，FB=33.64，即各因素对产物制备的影响程度大小顺序为底物浓度 > pH > 温度。

二次多项式回归方程为：

Y=+28.58-0.91A+0.28B-0.83C+0.012AB+0.57AC- 0.13BC-1.30A²-2.30B²-2.76C²

根据回归方程，做响应面图(图 9)。

软件分析得到最大响应值(产量)时A、B、C对应的最佳实验条件为：底物浓度4.61、温度30.2℃、pH=8.4、反应时间6 h，α-环糊精最大预测转化率为28.84%。按照实验筛选出的最佳条件，为方便实验操作，在底物浓度5%、温度30℃、pH=8.4、加酶量200 U/g、反应6 h条件下进行反应，实际转化率为28.67%，与理论值接近。

3 讨论

郭永华等(2016)通过定点饱和突变技术得到CGTase突变体N623T，在酶的最适温度60℃和pH为6.5条件下反应24 h，淀粉总转化率从11.3%提高至39.7%，其中，α-环糊精、γ-环糊精所占比例分别为32.8%和7.7%，α-环糊精的总转化率为13.02%。王琰等(2017)利用重组的α-CGTase酶转化5%的马铃薯淀粉，58℃反应15 h后，环糊精的总转化率可达40.7%，转化生成α-CD、β-CD和γ-CD比例分别为43.6%、41.8%和14.6%，即α-CD的转化率为17.75%。与已报道的产环糊精最高的酶相比(Duan et al, 2013)，菌株Y112产的CGTase酶在碱性环境中更加稳定，反应时间仅为6 h，大大降低了生产成本，且在不添加有机试剂的条件下，转化率可达到28.67%，减小了环糊精的毒性，使得环糊精应用范围更广，特别是医药，食品，化妆等方面，具有不可比拟的优势。

4 结论

本研究采用单因素实验分析了α-CGTase催化淀粉制备α-环糊精的条件，初步筛选得到的条件为：以马铃薯淀粉溶液为底物，5%的浓度，加酶量200 U/g (淀粉)，温度30℃，pH为9，反应时间6 h；利用Plackett-Burman实验设计对影响α-环糊精转化率的5个因素进行筛选，通过分析得知主要影响因素为底物浓度、温度和pH值。采用响应面分析法对α-CGTase转化淀粉制备α-环糊精条件进行优化，得到的最佳转化条件为底物浓度5%、pH 8.4、温度30℃、200 r/min、反应6 h。在最佳条件下制备α-CD转化率均值为28.67%，比优化前的产率提高了2.48倍。