魁蚶(Scapharca brouhtonii)俗称赤贝、血贝、大毛蛤，是一种大型底栖息经济贝类(孙楠等, 2015)。魁蚶广泛分布于太平洋西部沿岸、日本北海道以南、朝鲜半岛和俄罗斯东南部(姚红伟等, 2010)。在我国，魁蚶主要分布于辽东半岛东南部、山东半岛北部和东部等海区。魁蚶属于大型蚶，成体个大体肥、肉质鲜美，具有很高的经济价值。目前，对于不同地理种群魁蚶的分类学地位存在较大争议(梁超等, 2010; 孔晓瑜等, 2001; 喻子牛等, 1998a、b)，无论是在外部形态上，还是线粒体基因组的序列特征上，不同群体魁蚶都显示了较大的差异(Yokogawa et al, 1997; Liu et al, 2013、2014; Cho et al, 2007)。魁蚶养殖业的发展需了解养殖品种清晰的遗传背景和分类进化地位，明确分类等级，理清相互之间的进化关系，以掌握其资源状况，为魁蚶养殖业的发展奠定基础。

随着DNA测序技术和生物信息学的飞速发展，分子系统学日臻完善。线粒体DNA(mtDNA)因具有进化速率快、群体内变异大、分子结构简单、极少发生重组等特点，在分子系统学研究中得到了较广泛的应用，已成为物种起源、分类学定位、分子进化和系统发育研究的重要分子标记(孔晓瑜等, 2001; 崔文涛等, 2013; 金逍逍等, 2013; 梁日深等, 2014; 孙毅, 2015)。分子生物学分析方法能克服贝类形态学分析的困难，更能真实有效地反映其分类地位及进化关系。目前，包括毛蚶属贝类在内的双壳贝类的线粒体基因组测序工作正在大量开展(Serb et al, 2003; Smith et al, 2007; Mjelle et al, 2008; Yu et al, 2008; Xu et al, 2011; Sun et al, 2015; Hou et al, 2016)，已测出4种蚶科贝类的线粒体全基因组序列，为本研究的实施创造了条件。

很多蚶科贝类的线粒体基因组全序列测定工作陆续完成。目前，对于魁蚶的研究主要集中在生物学特性(张玉玺等, 1995; 周玮等, 2011; 王子臣等, 1987; 常亚青等, 1992; 吴彪等, 2010)、营养组分分析(王颖等, 2013)及繁养技术(邹琰等, 2010; 张启刚等, 2003; 杨青等, 2011)等，而利用分子生物学手段对遗传信息的研究相对较少。东北亚不同地理种群魁蚶存在形态学和遗传学上的差异(喻子牛等, 1997、1998; Cho et al, 2007; 梁超等, 2010)。本研究通过测定魁蚶中国群体线粒体基因组COⅠ和12S rRNA序列，从GenBank中下载了蚶科26种贝类的同源序列进行比对和系统发育分析，从分子水平上探讨魁蚶中国群体的分类学地位。

1 材料与方法 1.1 样品的采集

选取蚶科27种贝类样本进行分析，其中，魁蚶中国群体的线粒体COⅠ和12S rRNA的全长序列为本研究首次获取，其他线粒体基因组序列从NCBI的GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中检索并下载得到，所有物种的命名和分类地位采用Nelson(2006)提出的分类标准。本研究涉及物种的种名及序列GenBank登录号等相关信息见表 1。

魁蚶样品采自山东威海乳山，均为自然群体，样品采集后即保存在–20℃冰箱中备用，鉴定后取闭壳肌肌肉组织提取DNA。

1.2 基因组DNA提取

20个样品中各取闭壳肌约100 mg，充分剪碎，用动物细胞组织线粒体DNA萃取试剂盒(上海哈灵生物有限公司)提取线粒体基因组，0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。

1.3 PCR扩增和测序

COⅠ引物设计参考孔晓瑜等(2001)，扩展序列为魁蚶线粒体基因组1490~2198 bp的片段(AB729113)。引物序列：COIL1490：5'-GGTCAACAAATCATAAA- GATATTGG-3'；COIH2198：5'-TAAACTTCAGGGT- GACCAAAAAATCA-3'。12S rRNA基因的引物设计在魁蚶日本群体12S rRNA基因序列的基础上，使用Primer Premier 5.0设计。引物序列：F1：5'-GCGGCTA ATGTAATGCCAGCAG-3'；R1：5'-ACGGGAACGTGT CTCCTCAC-3'。

PCR反应体系为40 μl，包含20 μl 2×U taq PCR MasterMix，14 μl ddH₂O，上、下游引物(10 μmol/L)各2.0 μl和2.0 μl的DNA模板。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃条件下变性45 s，52℃退火40 s，72℃延伸1 min，共循环30次，72℃充分延伸5 min。将PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，PCR扩增产物送深圳市恒创基因科技有限公司测序，为保证序列的准确性，序列经正反2次重复测定。

1.4 基因组序列分析

将双向测序的结果用ClustalX 1.8进行全序列自动对准，并辅以人工校对。利用MEGA5.05(Kumar et al, 2001)软件对基因序列进行比对，统计分析序列组成、碱基含量、结构特征及变异特点等信息，并计算转换(Ts)/颠换(Tv)比和两两序列间的遗传距离。

1.5 系统发育分析

利用软件ClustalX对蚶科贝类线粒体基因组序列进行多重比对并人工校正，以贻贝科的贻贝(Mytilus edulis)为外群，通过MEGA 5.05软件进行整理和分类，并用邻接法(Neighbor-joining, NJ)和最大简约法(Maximum-Parsimony, MP)构建了蚶科贝类的系统进化树(图 1和图 2)，其各分支的置信度经Bootstrap法检验，共1000次循环(金逍逍等, 2013)。

2 结果与分析 2.1 魁蚶中国群体线粒体COⅠ和12S rRNA基因序列

COⅠ是编码细胞色素C氧化酶基因亚基Ⅰ的蛋白质编码基因，全长1584 bp，T、C、A和G含量分别为39.3%、14.3%、24.9%和21.5%，A+T、G+C含量分别为64.2%、35.8%。COⅠ基因编码518个氨基酸，密码子3个位点的碱基频率统计值见表 2：在3个位点上均表现出明显的AT偏向性，特别是第3个密码子，AT含量达77.1%，与无脊椎动物偏好以A或T结尾一致(Brown, 1985)。密码子第3位点表现出明显的不平衡性，T的频率达到47%，而C只有7.2%。

12S rRNA为编码核糖体核糖核酸的基因，全长为673 bp，T、C、A和G含量分别为26.3%、19.0%、27.3%和27.3%，A+T、G+C含量分别为53.6%、46.3%。

2.2 蚶科27种贝类COⅠ和12S rRNA基因序列变异及碱基组成

将魁蚶中国群体的COⅠ和12S rRNA基因与另外26种蚶科贝类的COⅠ和12S rRNA基因序列进行比对分析。COⅠ基因的长度为1455~1584 bp，T、C、A和G碱基平均含量为40.2%、14.7%、21.4和23.7%，A+T的平均含量(61.6%)大于G+C的平均含量(38.4%)。COⅠ基因编码302个氨基酸，密码子3个位点的碱基使用频率统计值见表 2：在3个位点上均表现出明显的AT偏向性，特别是在第1位点上，达到71.7%。按照无脊椎动物线粒体密码表，编码苯丙氨酸Phe和色氨酸Trp的密码子UUU和UGG是使用最频繁的密码子，分别达26.7%和15.8%，存在明显的密码子使用偏好。蚶科27种贝类3个密码子位点上碱基使用频率无显著差异，显示出相似的序列组成特征。特别是魁蚶中国群体、魁蚶日本群体和Anadara sativa在某些位点上碱基组成相同。蚶科27种贝类COⅠ基因共有787个变异位点，占总位点数的49.7%；其中含有简约信息位点531个，为总变异位点的67.4%；核苷酸的替换以颠换为主，转换/颠换比值平均为0.79。与外群比对后长度为1665 bp，有660个变异位点，占总位点数的39.6%，各种间序列变异位点明显颠换多于转换。

12S rRNA基因的平均长度为673 bp，T、C、A和G碱基平均含量为26.8%、19.0%、27.1%和27.1%，A+T的平均含量(53.9%)大于G+C的平均含量(46.1%)。13种蚶科贝类共有344个变异位点，占总位点数的51.1%；其中，含简约信息位点148个，为总变异位点的43.0%；核苷酸的替换以转换为主，转换/颠换比值平均为1.24。对13种蚶科贝类的12S rRNA基因用Kimura双参数法计算遗传距离，计算结果见表 3，魁蚶中国群体和魁蚶日本群体以及Anadara sativa的遗传距离为最小，说明它们的亲缘关系最近，与毛蚶的遗传距离为0.019，亲缘关系次之。

2.3 系统发育分析

COⅠ和12S rRNA是蚶科贝类线粒体内具有较好的系统发育信息的基因，通过对其进行PCR扩增和序列测定，分析比较蚶科贝类的种间变异程度和亲缘关系。COⅠ和12S rRNA都是蚶科线粒体中相对保守的序列，可以用于分析物种进化关系。

以贻贝为外群，蚶科27种贝类的COⅠ和12S rRNA基因为基础，使用MEGA5.05软件中的NJ法和ML法构建了蚶科贝类的分子系统进化树，结果如图 1~图 2所示。ML树的拓扑结构与NJ树相似，图片不再列出。通过系统发育树可得知，蚶科表现为单系性，但须蚶属Barbatia表现为复系，粗饰蚶亚科Anadarinae和泥蚶属Tegillarca表现为单系群。魁蚶中国群体与毛蚶属的魁蚶日本群体和粗饰蚶属的Anadara sativa亲缘关系最近，在COⅠ和12S rRNA基因这2个序列的基础上分析，魁蚶中国群体与魁蚶日本群体的差异不大，隶属于双壳纲(Bivalvia)、翼形亚纲(Pteriomorphia)、蚶目(Arcoida)、蚶科(Arcidae)、毛蚶属(Scapharca)，但魁蚶中国群体更确切的分类地位还需通过简化基因组测序等进一步验证。

3 讨论

Yokogawa(1997)研究了中、日两国魁蚶的壳高、壳长和壳重等形态上的差异，魁蚶中国群体平均壳高、壳长和壳重分别是日本群体的1.09倍、1.11倍和1.58倍，中国群体壳面的放射肋条数为45.83，而日本群体只有41.25，形态学上的比较显示出了显著差异。并利用等位基因酶研究了其遗传差异，计算得到的遗传距离达0.108。该研究认为，两国魁蚶在形态和遗传上差异非常明显，已完全达到亚种甚至种的水平。依据传统分类学方法(徐凤山等, 2008)，将蚶科分为2个亚科：蚶亚科和粗饰蚶亚科，共12属，中国已发现50多种。魁蚶隶属于蚶科、粗饰蚶亚科、毛蚶属。

目前，可用于系统发育分析的mtDNA基因主要有12S rRNA、16S rRNA、COⅠ、COⅡ、ND1、ND2和ND5等，其中以16S rRNA、COⅠ作为DNA条形码对物种系统发生关系的研究尤为普遍，本研究选取了线粒体基因组中的COⅠ和12S rRNA进行了魁蚶中国群体的分类学地位研究。从GenBank数据库中下载已经完成测序的蚶科COⅠ和12S rRNA基因和本研究测序得到的魁蚶中国群体线粒体COⅠ和12S rRNA基因序列，分析其组成结构和变异特点，通过构建蚶科贝类的系统发育树来探讨各物种间的系统发育关系，并与传统蚶科分类作比较。

本研究从COⅠ和12S rRNA这2个基因上分析，魁蚶中日群体的遗传距离很小，密码子使用率和碱基组成等相似度高，进化树中魁蚶中国群体和日本群体聚为一支，亲缘关系很近，说明魁蚶中国群体与传统的蚶科分类中魁蚶日本群体的分类地位相同，隶属于蚶科、粗饰蚶亚科、毛蚶属。本研究初步探索了魁蚶中国群体的分子系统进化地位，有利于掌握魁蚶的遗传背景和资源状况，为魁蚶种质资源的管理、保护与合理利用提供理论基础，从而推动魁蚶养殖业的发展。虽然COⅠ和12S rRNA基因能够将魁蚶中国群体进行定位，但由于本研究所选取的物种分布不均、数量有限，且仅凭单基因对魁蚶中国群体进行定位有其不足之处。要更加系统地对魁蚶中国群体进行分类，还需借助于其他的分子标记或与其他基因联合分析。