无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)也称B簇链球菌(Group B streptococci, GBS)，为兼性革兰氏阳性球菌(Rosinski-Chupin et al, 2013; Soto et al, 2015)。该菌宿主广泛，不仅能感染包括人在内的哺乳动物，还是养殖鱼类的重要病原(Schuchat et al, 1998)。罗非鱼为重要的世界性养殖鱼类，是联合国粮农组织(FAO)向全球推广养殖的优良品种，中国罗非鱼养殖年产量约为178万t，占世界罗非鱼总产量的三分之一以上，是水产品出口量最大的品种之一(2016中国渔业统计年鉴)。近年来，罗非鱼链球菌病日益严重，无乳链球菌作为其主要病原，传染力强，致死率高，由此产生的病害给罗非鱼养殖产业带来了巨大的经济损失(Evans et al, 2008; Kayansamruaj et al, 2015)。

罗非鱼无乳链球菌病发病较快，部分鱼从发病到死亡无明显病症，较难确定鱼体是否携带该病原菌，从而影响对病害的有效处理(程世亮等, 2016)。传统的病原菌分离和生理生化鉴定等方法，由于操作繁琐、检测周期长，不能达到快速检测目的(张新艳等, 2008; 卢迈新等, 2010)；普通PCR方法，一次仅能检测1个基因，可能会造成漏检或误检(Wu et al, 2008)；环介导等温扩增(LAMP)方法，具有灵敏度高、反应时间短、临床使用不需要特殊的仪器、操作简单等优点，但对引物设计要求比较高，有些基因可能不适用，还容易形成气溶胶污染，造成假阳性(甘文佳等, 2010)；荧光定量PCR虽然具有较高的灵敏度，但检测仪器昂贵，对实验操作技术水平要求较高(Su et al, 2016)。因此，建立快速、精准、高效且适用于生产一线的无乳链球菌检测技术势在必行。

多重PCR在一次反应中能同时扩增多个目的片段的靶序列，具有高效、快捷、高度特异、敏感等优势，已经成为诸多实验室的常规诊断方法(毕艳妮等, 2014)。目前，多重PCR方法已用于养殖对虾中同时检测6种病毒(刘飞等, 2014)。本研究以无乳链球菌的毒力基因即透明质酸酶基因hylB、编码表面相关青霉素结合蛋白的ponA基因和CAMP因子的cfb基因为靶标，设计3对特异性引物，通过引物组合优化建立一种快速、高效、稳定、特异性好、灵敏度高的无乳链球菌三重PCR检测方法，旨在为无乳链球菌的快速检测和早期预警提供一种准确、高效的检测技术。

鱼源无乳链球菌标准株(ATCC51487)和人源无乳链球菌标准株(ATCC BAA-1138)购于中国微生物菌种保藏中心。来源于不同年份和地区的无乳链球菌分离株TZQ0901(2009年分离自广东省肇庆市)、TGZ1001(2010年分离自广东省高州市)、TYC1101 (2011年分离自广东省阳春市)、THZ1301(2013年分离自广东省惠州市惠东区)、GZN1501(2015年分离自广东省广州市)、TLC1601(2016年分离自广东省龙川县)均从宿主罗非鱼分离获得，海豚链球菌(S. iniae)、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(Photobacterium damselae subsp. piscicida)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)均由实验室分离、鉴定并保存。

根据GenBank中无乳链球菌3个特异性hylB、ponA和cfb基因序列，通过Primer Premier 6.0软件设计相应的引物对(表 1)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表 1(Tab. 1)

表 1 3对引物的信息 Table 1 The information of the three pairs of primers 引物名称Primer 序列Sequence (5'~3') 扩增片段Amplified fragment (bp) 扩增基因Gene hylB-F CGCGACTTTGGCTTTCTGAG 790 hylB hylB-R TAATTGAGCGAGGGACACCG ponA-F AGCTATCCCTGGTGTTGCAC 598 ponA ponA-R ACCGTTAGGTACTGTATTGTTGT cfb-F TGGGATTTGGGATAACTAAGC 348 cfb cfb-R TTTGAAGTGCTGCTTGTAATG

表 1 3对引物的信息 Table 1 The information of the three pairs of primers

各实验菌株的DNA提取按照细菌基因组DNA提取试剂盒的操作说明，并保存于-20℃备用。罗非鱼组织中细菌DNA提取步骤，参照Su等(2016)的方法。首先取鱼组织约50 mg，放入组织匀浆器中研磨，加入1000 μl TE缓冲液，制成组织匀浆液。取上述匀浆液180 μl，加入20 μl浓度为50 mg/ml的溶菌酶，30℃孵育10 min，后续步骤均参照细菌DNA提取试剂盒进行。即得到高纯度的鱼(鱼包括体内细菌)基因组DNA，保存于-20℃备用。

单一引物扩增采用25 μl反应体系：2×PCR DsMix 12.5 μl，引物F(10 μmol/L) 1.0 μl，引物R(10 μmol/L) 1.0 μl，DNA模板1.0 μl，ddH₂O 9.5 μl。利用3对引物进行PCR扩增，反应体系组成：2×PCR DsMix 12.5 μl，各引物上、下游(10 μmol/L)分别为0.2~1.0 μl，DNA模板1.0 μl，补充ddH₂O至25 μl。反应条件：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，55~60℃退火30 s，72℃延伸1 min，扩增30个循环；72℃延伸10 min。然后取5 μl扩增产物，在恒压120 V条件下，1%的琼脂糖凝胶电泳25 min检测结果。其中，无菌超纯水代替DNA模板的扩增结果为阴性对照。根据扩增结果，选择最佳的引物比例和退火温度。同时，将三重PCR方法所扩增的特异性片段送北京六合华大基因科技有限公司(广州)进行测序验证。

分别以鱼源无乳链球菌标准株(ATCC51487)、人源无乳链球菌标准株(ATCC BAA-1138)、6株罗非鱼无乳链球菌(TZQ0901、TGZ1001、TYC1101、THZ1301、GZN1501和TLC1601)、海豚链球菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、创伤弧菌和迟缓爱德华菌的基因组DNA为模板，根据优化后的多重PCR反应条件和体系进行PCR扩增。

测定提取的鱼源无乳链球菌标准株(ATCC51487)基因组DNA浓度，将样品浓度按照5⁰、5^-1、5^-2、5^-3、5^-4、5^-5、5^-6和5^-7进行梯度稀释后分别为模板DNA，采用优化的多重PCR反应体系和条件进行PCR扩增，确定三重PCR检测方法所需模板的最低浓度。

利用构建好的三重PCR方法，检测来自广东省廉江市、高州市、吴川市、开平市、惠城区和龙川县6个不同罗非鱼养殖区188个罗非鱼组织样品。同时，利用常规细菌分离鉴定法对每份组织样品进行检测，比较这2种检测方法的结果。

根据世界动物卫生组织(OIE)《水生动物疾病诊断手册》(2016)所规定的原则，在95%以上的置信区间、允许误差5%范围内对188个罗非鱼组织样品进行检测，以常规细菌分离鉴定法为标准计算此三重PCR检测方法的诊断敏感性(Dse)和诊断特异性(Dsp)。

分别对各引物加入体系的体积和退火温度进行优化，优化后的最佳退火温度为57℃，反应体系优化结果见表 2。利用优化后的反应体系和反应条件进行无乳链球菌检测，出现3条特异性条带；使用单一引物分别扩增hylB、ponA和cfb基因，均出现1条特异性条带，条带位置与预期结果一致(图 1)。此外，对送测序的特异性条带序列进行BLAST比对，与无乳链球菌hylB、ponA和cfb基因的同源性均达到或超过99%，表明构建的三重PCR所扩增的特异性条带是准确的。

表 2(Tab. 2)

表 2 三重PCR反应体系试剂组成 Table 2 The content of the reagent in the reaction system of a triple PCR 成份Ingredients 体积Volume (μl) 2×PCR DsMix 12.5 hylB-F(10 μmol/L) 0.5 hylB-R(10 μmol/L) 0.5 ponA-F(10 μmol/L) 0.6 ponA-R(10 μmol/L) 0.6 cfb-F(10 μmol/L) 0.5 cfb-R(10 μmol/L) 0.5 DNA模板 1.0 ddH2O 8.3 共计Total 25.0

表 2 三重PCR反应体系试剂组成 Table 2 The content of the reagent in the reaction system of a triple PCR

图 1(Fig. 1)

图 1 3对引物和单一引物PCR扩增结果 Figure 1 The amplification of the single primer and three pairs of primers M: DL2000 bp marker；1：三重PCR的结果；2~4分别表示hylB、ponA和cfb基因的扩增片段；5：阴性 M: DL2000 bp marker; Lane 1: the result of three pairs of primers; Lanes 2~4: Amplified fragments of hylB, ponA, and cfb; Lane 5: Negative control

特异性实验结果显示，鱼源无乳链球菌(ATCC51487)、人源无乳链球菌(ATCC BAA-1138)以及不同年份和地区的无乳链球菌分离株扩增结果一致，均扩增出3条目的条带。而以罗非鱼、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、迟缓爱德华氏菌、海豚链球菌、创伤弧菌的基因组DNA为模板均未扩增出任何条带，与阴性对照结果相一致(图 2)。

图 1(Fig. 1)

图 2 三重PCR特异性检测结果 Figure 2 The pecificity result of triple PCR assay M：DL2000 bp marker；1：鱼源无乳链球菌(ATCC51487)；2：人源无乳链球菌(ATCC BAA-1138)；3：罗非鱼基因组；4：美人鱼发光杆菌杀鱼亚种；5：粪肠球菌；6：金黄色葡萄球菌；7：迟缓爱德华氏菌；8：海豚链球菌；9：创伤弧菌；10~15：扩增使用的模板为TZQ0901、TGZ1001、TYC1101、THZ1301、GZN1501和TLC1601；16：阴性对照 M: DL2000 bp marker; Lane 1: S. agalactiae ATCC51487; Lane 2: S. agalactiae ATCC BAA-1138; Lane 3: Tilapia genomic DNA; Lane 4: P. damselae subsp. piscicida; Lane 5: E. faecalis; Lane 6: S. aureus; Lane 7: E. tarda; Lane 8: S. iniae; Lane 9: V. vulnificus; Lanes 10~15: TZQ0901, TGZ1001, TYC1101, THZ1301, GZN1501, and TLC1601 of S. agalactiae; Lane 16: Negative control

以无乳链球菌基因组DNA浓度分别为5.65、1.13、2.26×10^-1、4.52×10^-2、9.04×10^-3、1.81×10^-3、3.62×10^-4和7.24×10^-5 ng/μl为模板进行PCR扩增，结果显示，三重PCR能检测到的无乳链球菌基因组DNA最低浓度为1.81×10^-3 ng/μl(图 3)。

图 1(Fig. 1)

图 3 三重PCR敏感性检测结果 Figure 3 The sensitivity result of the triple PCR assay M：DL2000 bp marker；1~8：无乳链球菌模板浓度分别为5.65、1.13、2.26×10-1、4.52×10-2、9.04×10-3、1.81×10-3、3.62×10-4和7.24×10-5 ng/μl；9：阴性对照 M: DL2000 bp marker; Lanes 1~8: Template concentration of S. agalactiae as 5.65, 1.13, 2.26×10-1, 4.52×10-2, 9.04×10-3, 1.81×10-3, 3.62×10-4, and 7.24×10-5 ng/μl; Lane 9: Negative control

采自廉江、龙川、高州、吴川、开平和惠东的罗非鱼样品阳性检出率分别为100%(4/4)、100%(8/8)、57.14%(4/7)、50%(2/4)、1.23%(2/159)和0(0/6)；总体来看，188尾罗非鱼组织样品的阳性检出率为10.6% (20/188)，均与常规细菌分离鉴定结果相一致(表 3)。

表 3(Tab. 3)

表 3 组织样品检测结果 Table 3 The detection result of the tissue samples 诊断方法Method 阳性检出数/样本总数Positive samples/total samples 廉江市 Lianjiang 高州市 Gaozhou 吴川市 Wuchuan 开平市 Kaiping 惠城区 Huicheng 龙川县 Longchuan 常规细菌分离鉴定Conventional method 4/4 4/7 2/4 2/159 0/6 8/8 三重PCR检测方法Triple PCR assay 4/4 4/7 2/4 2/159 0/6 8/8

表 3 组织样品检测结果 Table 3 The detection result of the tissue samples

以常规细菌分离鉴定方法为标准，根据Dse和Dsp计算公式得出本研究所建立的三重PCR检测方法的Dse和Dsp均为100%(表 4)。

表 4(Tab. 4)

表 4 两种不同的方法对组织样品的检测 Table 4 Two different methods for detection of the tissue samples 项目Items 罗非鱼组织样品Tilapia tissue samples 常规细菌分离鉴定Conventional method 阳性P(20) 阴性N(168) 三重PCR检测方法Triple PCR assay 真阳性TP(20) 假阳性FP(0) 假阴性FN(0) 真阴性TN(168) 计算公式Calculation Dse=TP/(TP+FN)×100% =100% Dsp=TN/(TN+FP)×100%=100%

表 4 两种不同的方法对组织样品的检测 Table 4 Two different methods for detection of the tissue samples

罗非鱼是我国主要的水产品养殖和出口品种之一，近几年，由于罗非鱼产品不合格(农兽药残留、品质不合格、微生物污染、食品添加剂超标等)，出口严重受阻(赵海军等, 2015)。其中，由无乳链球菌带来的病害给罗非鱼养殖产业带来的损失最为严重。水产品中微生物的检测方法主要有生化培养法、免疫学法和核酸检测法等(应晓国等, 2017)，王远微等(2008)利用三重PCR对临床疑似样本的检出率为81.8%，对人工攻毒样本的检出率为87.5%，两组数据均高于用细菌分离的检出率(40.9%和67.5%)，说明多重PCR可避免单个毒力基因进行检测时漏检情况的发生，同时也暗示多重PCR比细菌分离技术更灵敏。

基于PCR技术的无乳链球菌检测方法大多选取靶标基因为16S~23S rRNA间区序列、sip和荚膜多糖类编码基因等(王均等, 2011; Forsman et al, 1997)。无乳链球菌普遍存在20多种毒力基因(Lin et al, 2011)，透明质酸酶(Hyl)是无乳链球菌重要的毒力因子，有助于链球菌在巨噬细胞内存活并影响巨噬细胞促炎性因子的表达，在无乳链球菌致病过程中起关键作用(Wang et al, 2014)。青霉素结合蛋白(PBP1a)在GBS抗吞噬清除中起重要作用(Hamilton et al, 2006; Jones et al, 2000)，蔡朝阳等(2006)发现青霉素结合蛋白的改变与金黄色葡萄球菌对甲氧西林等β-内酰胺类抗生素以及万古霉素等糖肽类抗生素耐药有密切关系，影响药物作用的靶位，阻止抗生素的杀菌作用。CAMP因子认为是具有成孔性质的分泌蛋白，在GBS致病过程中发挥重要作用(Udo et al, 2013)。通过基因组的数据检索确认，不同来源的(包括人及其他动物源)无乳链球菌均包含上述3种毒力基因，说明它们在病原体的侵入、繁殖与扩散及抵抗机体防御中起关键作用(Casadevall et al, 2001)，因此，选择hylB、ponA和cfb毒力基因设计引物检测罗非鱼无乳链球菌十分必要。

多重PCR方法具有特异性好、灵敏度高的优点，被广泛应用于水产病原的检测。曾伟伟等(2013)针对草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)各类型毒株的保守序列，建立了GCRV的三重PCR检测方法；危芙蓉等(2010)根据广州管圆线虫核糖体小亚基rDNA基因序列设计特异性引物，并与小管福寿螺16S rDNA的特异性引物组合，建立了检测小管福寿螺体内广州管圆线虫的多重PCR方法；李晨等(2010)根据水产上常见病原菌鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、迟缓爱德华氏菌(E. tarda)的毒力相关基因，建立了同时检测3种菌的单管多重PCR方法。本研究中，用单一引物分别扩增hylB、ponA和cfb基因，可获得特异性扩增条带，将上述3对引物组合并优化出多重PCR条件和体系，可同时扩增出3条特异性条带。Su等(2016)研究发现，以无乳链球菌的一些毒力基因(如sip和cpsE)为靶标设计引物进行PCR扩增，存在跟其他病原菌基因组DNA交叉反应的现象，而本研究中未能在其他水产动物病原菌基因组中扩增出条带，表明所建立的三重PCR检测方法特异性强。灵敏度测试发现，本研究所构建的方法可检测到浓度为1.81×10^-3 ng/μl的细菌基因组DNA，比黄锦炉等(2012)构建的三重PCR检测方法灵敏度提高了近200倍。运用本研究构建的三重PCR方法检测广东省各地区罗非鱼组织样品的阳性检出率为10.6%(20/188)，与细菌分离鉴定的结果吻合，说明三重PCR在罗非鱼样品检测过程中具有广阔的应用前景。该三重PCR检测方法准确性高、特异性强、灵敏度高，为罗非鱼无乳链球菌病的诊断、大规模检疫、流行病学调查等提供了一种快速、准确而有效的方法。