防御素是一类富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽，广泛分布于植物、昆虫和脊椎动物中。根据对6个保守的半胱氨酸的位置和二硫键连接方式不同将防御素分为3个亚家族：α、β和θ-防御素(Zhu et al, 2013)。β-防御素是动物防御素系统中最大的成员，具有广谱的抗菌活性及不受传统抗生素耐药性菌株影响的抗菌机理，同时，与典型抗生素具有协同作用，能中和内毒素、调节机体免疫应答和炎症反应、调节组织创伤修复等而备受人们关注(张伟等, 2006)。

目前，鱼类中只发现了β-防御素，相对于其他脊椎动物，研究处于起步阶段。2007年首次在斑马鱼(Danio rerio)和河鲀(Takifugu rubripes)中分离鉴定出β-防御素(Zou et al, 2007)以来，迄今仅在金头鲷(Sparus aurata) (Cuesta et al, 2011)、团头鲂(Megalobrama amblycephala)(Liang et al, 2013)、斑点叉尾(Ictalurus punctatus)(Zhu et al, 2017)等14种鱼类上开展过基因表达和抗菌活性的研究。

鲟鱼被称为“水中活化石”，近年来，俄罗斯鲟(Acipenser gueldenstaedti)养殖业在我国发展较快，由于其性成熟周期较长，养殖过程一旦发生病害，将对养殖业产生巨大影响，而嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是致病的主要病原体之一(杨治国, 2001)。但俄罗斯鲟的免疫基因发掘及免疫机制鲜有报道。本研究在前期俄罗斯鲟性腺转录组(Chen et al, 2016)中挖掘到β-防御素部分序列的基础上，克隆了俄罗斯鲟β-防御素cDNA序列，推导出包含信号肽的完整蛋白序列，研究其组织表达及响应病原菌刺激后在免疫组织中的时空表达模式，为俄罗斯鲟免疫机理研究、病害防治和健康养殖提供有价值的研究资料。

健康1.5龄俄罗斯鲟，体长为(47.5±2.5) cm，体重为(450±10) g。取自杭州千岛湖鲟龙集团有限公司，暂养于直径2 m、水深0.5 m的圆形玻璃钢养殖缸中，至少15 d后方可进行实验。养殖用水引自乌溪江，水温为17~20℃。嗜水气单胞菌为实验室保存菌种，分离自俄罗斯鲟病鱼组织，经16S rRNA测序进行菌种鉴定。

分别收集3条健康俄罗斯鲟的肝、肠、脾、头肾、胃、鳃、血液、脑、皮肤、肌肉和性腺11种组织，立即放入液氮中，随后将组织转移至–80℃冰箱中保存，用于总RNA提取。采用腹腔注射方法按照半致死剂量(2.07×10⁴ CFU/g)进行病原感染。对照组注射同等体积的1×PBS溶液。收集感染0、6、12、24、48、72 h实验组和对照组，各取3条俄罗斯鲟的肝、脾、鳃、血液、头肾和肠组织，保存方式同上所述。

采用液氮研磨收集的组织，参照总RNA提取试剂盒(天根, 北京)说明书进行组织总RNA提取。使用Agilent 2100生物分析仪(Applied Biosystems, 美国)检测其质量和浓度，通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。按照Prime Script TM RT reagent kit (Perfect Real time) (宝生物, 大连)试剂盒合成cDNA，-20℃保存备用。

从俄罗斯鲟性腺转录组中筛选出β-防御素基因部分cDNA序列，采用Primer Premier 5.0在线软件(www.bio-soft.net)设计特异性引物P1和P2(表 1)，以俄罗斯鲟11个组织混合cDNA为模板，进行PCR扩增。扩增产物连接T载体，转化到T1感受态细胞中，对阳性克隆进行测序。

表 1(Tab. 1)

表 1 俄罗斯鲟β-防御素基因克隆和表达分析所用引物 Table 1 Primers used for cloning and expression of A. gueldenstaedti β-defensin 引物 Primer 引物序列 Primer sequence (5'~3') 用途 Purpose P1 TCTCCGAGGACAGCCATGGTAAC 克隆β-防御素基因 P2 GTGTCCTCTCTGACCACAGGTCC 克隆β-防御素基因 P3 GCTGTTGTTACTGGCATCTGT 定量表达引物 P4 TGAAGAAAAGCCCATCTCCAT 定量表达引物 18S-F CCTGAGAAACGGCTACCACATC 定量表达内参引物 18S-R CTCATTCCAATTACAGGGCCTC 定量表达内参引物

表 1 俄罗斯鲟β-防御素基因克隆和表达分析所用引物 Table 1 Primers used for cloning and expression of A. gueldenstaedti β-defensin

将测序拼接获得的基因序列运用NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) Protein Blast进行β-防御素氨基酸同源性比对，使用在线软件SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)预测蛋白质结构域；信号肽预测采用SignalP3.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，应用ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)、DNAstar(http://www.dnastar.com/)、ClustalX1.83 (http://www.genome.jp/tools/clustalx/)和DNAMAN(http://www.lynnon.com/)等软件进行俄罗斯鲟β-防御素基因开放阅读框的查找及氨基酸多重序列比对分析。利用MEGA 5.1重复1000次构建N-J进化树。应用CPHmodels3.2server(http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/)在线软件预测β-防御素蛋白的三维结构。

基因实时定量表达分析参照已报道的方法进行(路飏等, 2013; 于孟君等, 2017)。根据测序得到的俄罗斯鲟β-防御素cDNA序列设计qRT-PCR引物为P3、P4(表 1)，以俄罗斯鲟18S rRNA基因为内参设计特异引物18S-F和18S-R(表 1)。用SYBR Green荧光定量试剂盒(天根, 北京)按照说明书在ABI PRISM 7500Fast实时定量扩增仪上(ABI，美国)进行该基因的实时定量分析(qRT-PCR)。每个样品设置3个生物学重复，使用2^-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量，Ct值取3个平行样品的平均值。qRT-PCR检测结果使用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)的Duncan法对多组样本均数进行两两比较分析，P < 0.05时，认为存在显著性差异。

克隆测序得到的俄罗斯鲟β-防御素基因部分cDNA片段长度为333 bp，用ORF finder软件分析其ORF长度为213 bp，编码71个氨基酸(图 1)，与其他物种的同源序列所包含的ORF长度相当。信号肽和结构域分析结果显示，该基因序列包含23个氨基酸的信号肽、完整的β-防御素-2结构域(82~234)。

图 1(Fig. 1)

图 1 俄罗斯鲟β-防御素cDNA序列和推测的氨基酸序列 Figure 1 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of A. gueldenstaedti β-defensin 推导的氨基酸序列显示在核苷酸序列下方，用大写字母表示；双下划线(=)所示为信号肽；方框所示为起始密码子(ATG)、星号(*)所示为终止密码子(TAG)；下划线(—)为defensin-β-2结构域 Translated amino acid sequence was shown under nucleotide sequence as uppercase; The iniation codon and termination codon were marked by a box and an asterisk, respectively; Signal peptide was shown with double solid line(=); Defensin-β-2 domain was shown with underline(—)

推导的俄罗斯鲟β-防御素氨基酸序列和其他物种的β-防御素氨基酸序列如斑马鱼(Danio rerio, NP_001075024.1)、青鳉(Oryzias latipes, ACG55699.1)、鳜(Epinephelus coioides, AFA41485.1)、鲤(Cyprinus carpio, AGZ03658.1)、梭鱼(Liza haematocheila, AIK66783.1)、点带石斑鱼(Epinephelus coioides, AFA41485.1)、福鼎蝾螈(Cynops fudingensis, AHF22421.1)、原鸡(Gallus gallus, ALI16124.1)、小鼠(Mus musculus, EDL32923.1)、大鼠(Rattus norvegicus, AAC61871.1)、恒河猴(Macaca mulatta, AAC61871.1)和人(Homo sapiens, AAH93985.1)等进行同源比对。结果显示，俄罗斯鲟β-防御素与其他物种的氨基酸序列同源性在39%~60%之间，其中，与斑马鱼和鲤鱼的同源性最高，为60%，其次是鳜鱼59%，与青鳉的同源性最低，为54%。但在不同的物种之间，都具有6个保守的半胱氨酸残基(图 2)。

图 1(Fig. 1)

图 2 推导的俄罗斯鲟β-防御素氨基酸与其他物种已知同源序列比对 Figure 2 Multiple alignment of A. gueldenstaedti β-defensin deduced amino acid sequence with other known orthologs 图中标黑处表示6个保守的半胱氨酸残基及位置，分别是C38、C44、C48、C60、C66和C67 Six conserved Cysteine residues (C38, C44, C48, C60, C66 and C67) in β-defensin protein were highlighted by black color

利用MEGA 5.1以N-J法构建基于上述物种β-防御素氨基酸序列的分子系统进化树。结果显示，系统进化树分为两个大的分支，俄罗斯鲟β-防御素与斑马鱼、青鳉、鳜、梭鱼、点带石斑鱼聚为一大支，其中俄罗斯鲟单独聚为一个亚支，与斑马鱼和鲤进化关系最近；小鼠、大鼠和人聚为另外一个大支，其中，鼠类按亲缘关系远近聚成相应的亚支；两栖类福鼎蝾螈单独聚为一个分支(图 3)。

图 1(Fig. 1)

图 3 俄罗斯鲟与其他物种的β-防御素系统进化分析 Figure 3 Phylogenetic tree of β-defensin of A. gueldenstaedti and other vertebrates

预测的俄罗斯鲟β-防御素的3D结构如图 4所示。结果显示，C38和C66、C44和C60及C48和C67之间分别形成3对二硫键，6个保守的半胱氨酸残基按照箭头方向形成反向平行的β片层折叠结构，对β-防御素结构稳定具有重要作用。该结构与斑马鱼β-防御素-2非常相似，从结构上判断，获得的俄罗斯鲟β-防御素基因应属于β-防御素-2基因。

图 1(Fig. 1)

图 4 预测的俄罗斯鲟β-防御素蛋白质三维结构 Figure 4 Three-dimensions structure of deduced protein of A. gueldenstaedti β-defensin 三个二硫键：C38和C66(绿色)，C44和C60(蓝色)和C48和C67(红色)，箭头方向表示β-片层折叠 Three disulfied bonds were formed C38-C66 (green), C44-C60 (blue) and C48-C67 (red), respectively Arrow mark indicates β-sheet

qRT-PCR结果显示，β-防御素基因在检测的健康俄罗斯鲟11种组织(肝、肠、脾、头肾、胃、鳃、血液、脑、皮肤、肌肉和性腺)中均有不同程度的表达(图 5)。以表达量最低的血液(1.0)为对照，相对表达量最高的组织是性腺(21.75)，其次是皮肤(10.05)、胃(2.5)、肌肉(2.4)，在肝(1.5)和脾(1.5)、鳃(1.05)、肠(1.2)、脑(1.25)及头肾(1.1)中的表达量相对较低，β-防御素基因在不同组织中表达存在特异性。

图 1(Fig. 1)

图 5 β-防御素基因在健康俄罗斯鲟组织中的表达 Figure 5 β-defensin gene expressions in 11 tissues of healthy A. gueldenstaedti L:肝; In:小肠; Sp:脾; HK:头肾; Sk:皮肤; Mu:肌肉; Gi:鳃; Br:脑; Bl:血液; Go:性腺; St:胃。字母“a，b，c”代表SPSS多重分析的不同分组，有相同字母表示差异不显著(P > 0.05)，无相同字母表示差异显著(P < 0.05)。下同 L: Liver; In: Intestine; Sp: Spleen; HK: Head-Kidney; Sk: Skin; Mu: Muscle; Gi: Gill; Br: Brain; Bl: Blood; Go: Gonad; St: Stomach. The letters 'a, b, c, d' are subsets by Duncan algorithm. The same letters indicate unsignificant difference (P > 0.05), the different letters indicate significant difference (P < 0.05). The same as below

嗜水气单胞菌感染俄罗斯鲟0、6、12、24、48和72 h后，β-防御素基因在6种免疫组织(肝、肠、脾、头肾、鳃和血液)中呈现不同的表达特征，结果如图 6所示。嗜水气单胞菌感染俄罗斯鲟后，β-防御素在头肾、血液、肠、脾和鳃5种组织中均呈现上调表达，只是各组织中峰值出现的时间点不同，在肝中则呈现下调趋势。其中，β-防御素基因在头肾中呈现最为显著的上调表达，与0 h相比，在感染后6 h后即出现了10倍的增加，在感染后的12~48 h，基因表达表现为几十倍到上百倍不等的上调，到感染72 h达到峰值，为0 h表达量的700倍；β-防御素基因在小肠、血液和脾中整体上表现为上调表达，最大表达峰值达到几倍到十几倍，在鳃中表达量变化不大，最高的表达量出现在感染后12 h，为0 h表达量的2倍，其他时间点表达量与0 h相当；β-防御素基因在肝脏中则总体呈现下调表达模式，感染12~72 h后，表达量与0 h相比，呈现近5倍的明显下调表达。

图 1(Fig. 1)

图 6 俄罗斯鲟感染嗜水气单胞菌后β-防御素基因在免疫组织中的表达 Figure 6 β-defensin gene expressions in immune tissues of A. gueldenstaedti after Aeromonas hydrophila challenge 每个时间点的β-防御素的表达量为感染组除以PBS组的相对表达量 The expression level of β-defensin at each timepoint was presented as relative expression in which the infected group divided by the PBS group

养殖环境的生态环保对鱼类健康养殖产业提出了严格要求，发展替代抗生素的绿色无污染的渔药如抗菌肽等势在必行。鱼类β-防御素已被证明具有明显的抗菌、抗病毒功能(Jin et al, 2010; Casadei et al, 2009)，具有广阔的应用前景。但目前鱼类β-防御素的研究不深入，亟待在更多的鱼种和功能分析上进行更深入的研究。俄罗斯鲟是生产鱼子酱的主要鱼种之一，经济价值很高，开展免疫机理和绿色病害防治研究，对发展和稳定鲟鱼养殖产业具有重要意义。本研究关于俄罗斯鲟β-防御素基因的克隆和表达研究，是俄罗斯鲟宿主免疫的首次报道。

俄罗斯鲟β-防御素基因cDNA长度为333 bp，ORF为213 bp，编码71个氨基酸，包含23个氨基酸的信号肽和48个成熟肽，目前报道的不同鱼类的β-防御素前体分子一般由62~77个氨基酸残基组成，信号序列和前导序列含有22~38个氨基酸残基，成熟肽序列由39~45个氨基酸残基组成(Casadei et al, 2009)，本研究结果与报道结果吻合。另外，俄罗斯鲟β-防御素C端包含6个保守的半光氨酸残基，形成3个二硫键结构，与报道的鱼类β-防御素结构一致(Dong et al, 2015; Ruangsri et al, 2013; Guo et al, 2012; Ellis, 2001)。俄罗斯鲟β-防御素蛋白质空间结构预测形成3个β-片层折叠，与斑马鱼BD-2的结构(Ellis, 2001)很类似，SMART结构域预测，俄罗斯鲟β-防御素包含β-防御素-2结构域，同源序列比对的结果也证实其与斑马鱼BD-2的相似度最高，为60%，这些证据都指明所获得俄罗斯鲟β-防御素基因应属于β-防御素-2，在进化上还是属于相对原始的类型。

鱼类β-防御素是抗菌肽的重要成员，在各组织中广泛表达，罗非鱼β-防御素在检测的9种组织(心、肝、脾、鳃、头肾、肠、胃、肌肉和皮肤)中都有表达，其中，在皮肤中表达量最高，其次是在脾、头肾和肌肉中有较高的表达，在肝、心、肠、胃和鳃中的表达量最低(Dong et al, 2015)。β-防御素基因在健康斑点叉尾前肠、肝脏、头肾、肾、鳃、后肠、皮肤、胃中均有表达，在皮肤中表达量最高(Zhu et al, 2017)。俄罗斯鲟β-防御素基因在检测的11种健康组织(肝、小肠、脾、头肾、后肾、鳃、血液、脑、皮肤、肌肉和性腺)中均有表达，其中，在皮肤和性腺表达最高，3种鱼在共同检测到的组织中，都是在皮肤中表达量最高，表达模式相似但又不完全相同，说明不同物种β-防御素的功能存在相似性，但表达还具有组织特异性和物种特异性。斜带石斑鱼(Epinephelus coioides) β-防御素能够在睾丸和脑垂体中表达，推断它可能参与内分泌系统和生殖系统的一些功能(Jin et al, 2010)，俄罗斯鲟β-防御素的序列来自性腺转录组，实时定量组织表达分析其在性腺中存在高表达，在脑中有较高的表达，暗示俄罗斯鲟β-防御素同样可能具有内分泌和生殖系统的功能。

目前，对鱼类β-防御素生物学活性的研究主要集中在抗菌和抗病毒等免疫活性方面，石斑鱼的防御素对革兰氏菌(阳性或阴性)均具有抗菌活性，并且还具有抗RGV病毒活性(Jin et al, 2010)。爱德华菌(Edwardsiella ictaluri)感染斑点叉尾48 h后，β-防御素在头肾、鳃和皮肤中都有明显的上调表达(Zhu et al, 2017)，用停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)感染梭鱼48 h后，β-防御素在脾和肠中都有十几倍的上调表达(Qi et al, 2016)，嗜水气单胞菌可强烈影响俄罗斯鲟β-防御素基因的表达，在头肾中的上调表达最明显，72 h到达表达峰值，为0 h表达量的700倍。在脾脏、血液和肠中均有几倍至十几倍的上调，本研究结果与报道的研究结果相似。说明俄罗斯鲟β-防御素在响应细菌感染的免疫反应中发挥了重要作用。

本研究初步研究了俄罗斯鲟的克隆、组织表达及相应病原刺激的免疫应答，后续研究尚需进一步深入。由于俄罗斯鲟的基因资源还远远不足，缺乏基因组及多数组织的转录组数据，加之俄罗斯鲟的基因组又极其复杂，染色体数目多达236条(尹洪滨等, 2006)，β-防御素有可能存在较多的同源基因和重复基因，在一定程度上对俄罗斯鲟β-防御素基因的克隆和精准分型造成困难。由于获得的俄罗斯鲟cDNA片段长度只有333 bp，缺乏合适的位点设计RACE引物，我们尝试多次克隆，仍无法获得完整的5'和3'全长，但我们获得了完整的ORF，对进一步开展功能研究奠定了良好基础。在后续研究中，将进一步验证其对不同病原(细菌、病毒)等的体内和体外抗菌活性的研究，为俄罗斯鲟的绿色病害防治途径探讨可行之路。